CN107779499A

CN107779499A - 基于snp位点的川金丝猴遗传监测和繁育管理方法

Info

Publication number: CN107779499A
Application number: CN201710967276.0A
Authority: CN
Inventors: 张于光; 张宇; 李迪强
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2018-03-09

Abstract

本发明公开了一种川金丝猴个体遗传多样性监测方法，该方法包括以下步骤:（1）采集川金丝猴血液样品，提取血液样品的基因组DNA；（2）利用RAD‑seq进行基因组DNA测序：（3）分析获取SNP位点；（4）进行种群遗传多样性监测；（5）选择SNP位点，基于亲缘关系建立繁殖群体的动态家庭关系。本发明利用获得的SNP位点，能够简便、准确、全面的获取川金丝猴个体的遗传信息和亲缘关系，有利于长期监测川金丝猴繁殖群体的遗传多样性和建立动态的繁殖家庭谱系。相对于已有的遗传标记方法，SNP位点的突变率高、位点数量多、分布广，能够获得更全面的遗传信息，结果更可靠，相对于全基因组测序，SNP位点简单、数据易于分析。

Description

基于SNP位点的川金丝猴遗传监测和繁育管理方法

技术领域

本发明涉及川金丝猴的遗传多样性监测和家庭繁育管理，具体涉及基于SNP位点的遗传多样性监测和家庭繁育管理方法。

背景技术

川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)，隶属于灵长目、猴科、疣猴亚科、仰鼻猴属，是我国特有物种，国家I级重点保护保护野生动物，被国际自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)名录列为易危(IUCN，2011)。目前川金丝猴仅分布于几个相互隔离的地区(四川北部及甘肃南部、陕西秦岭和湖北神农架3个地区)，其中神农架金丝猴种群是分布在最东端的孤立金丝猴群，在川金丝猴的保护和研究中具有重要的价值。

川金丝猴在我国已有60年的饲养和展出历史，深受国内外游客的喜爱。1956年北京动物园首次饲养展示金丝猴，并于1964年首次圈养繁殖成功。自20世纪70年代后，全国动物园饲养展示金丝猴的单位逐渐增多，饲养繁殖水平逐渐提高。目前国内饲养展示金丝猴的单位有40家，圈养金丝猴种群数量达400余只。川金丝猴的圈养种群在2000年之前，野外捕获个体数大于圈养出生个体数，种群发展主要依靠野外个体进入种群，之后圈养出生个体数大于野外捕获个体数，并逐年增长，到2015年种群中野外捕获个体49只，圈养出生个体378只，种群增长完全依靠圈养个体繁殖，野外引入越来越少，因此，种群存在近亲繁殖和遗传多样性丧失的风险。

遗传多样性是物种是否适应外界不良环境的潜在能力和长期发展的基础和重要指标。特别是对那些珍稀濒危物种的遗传多样性研究，掌握其目前的遗传变异水平和遗传结构，根据现状制定与实际情况相应的保护和管理措施，这对濒危野生动物的保护具有重要的意义。如何避免近亲繁殖是小种群保护与管理必须解决的问题。近亲繁殖会导致诸如后代生存力下降、繁殖适应度降低以及死亡率高等近交衰退现象，同时还会导致种群遗传多样性快速丢失，从而影响种群的长期发展。对于圈养种群来说，需要一定的个体来缓解近亲的几率，种群个体之间因亲缘关系的差异，其近交的程度也会不同。一般来说越是亲近个体之间交配繁殖，越容易受到近交带来的后果影响。

利用遗传标记进行濒危动物的遗传多样性监测和保护管理，为濒危物种的保护提供了重要的科学依据。单核苷酸多态性(SNP)分子标记是随着人类基因组计划的进展而发现的新的DNA遗传标记，是第三代分子标记的代表。SNP具有以下特点：(1)位点遗传稳定性高，基于单核苷酸的突变频率较低，所以遗传的稳定性相对高；(2)位点密度高且分布广，人类基因组大约平均每1000bp就会出现一个SNP位点(唐立群等，2012)，在其他哺乳类动物中，约每500～1000bp出现1个SNP位点(曾燕如等，2003)，在一些植物中，如水稻、玉米，大豆等农作中，SNP位点的分布更为频繁(Nasu et al.，2002；Kanazin etal.，2002；李兆波等，2010)；(3)位点具有代表性，SNP位点可能分布在基因的编码区，可能是直接导致生物的某性状发生变异和病变的直接因素，这将是个体性状遗传机理研究提供一定的科学依据；(4)检测快速，SNP位点大部分是由2个等位基因组成，即为二态性，不需像建立在凝胶电泳基础上的分子标记，检测片段的长度，实验步骤繁琐，进展速度相对较慢，而是直接测序，用序列比对的方式来发现差异，检测实施自动化，极大提高实验的效率。

随着分子生物学技术的快速发展，SNP位点与芯片技术以及DNA微阵列相结合，加上很多物种基因组测序的完成，SNP标记在生命科学领域具有重大的发展潜力和广阔的应用前景。SNP标记已在遗传图谱(Aslam et al.，2010)、全基因组关联分析及相关验证(Zhouet al.，2014)、群体遗传学分析(Xu et al.，2013)、群体进化(Zhao et al.，2013)等相关研究领域。

发明内容

本发明的目的是利用简化基因组测序(RAD-seq)测序方法，获取川金丝猴的SNP位点，建立一套用于川金丝猴个体遗传多样性监测和繁殖群体的动态家庭关系管理的方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案提供了一种进行川金丝猴RAD-seq的测序方法，获取SNP位点，并进行川金丝猴个体的遗传多样性监测和繁殖群体的动态家庭关系的管理方法。本发明提供一种川金丝猴个体遗传多样性监测方法，该方法包括以下步骤:

(1)采集川金丝猴血液样品，提取血液样品的基因组DNA；

(2)利用RAD-seq进行基因组DNA测序：

1)将基因组DNA加入含有限制性内切酶EcoRI和10xBuffer的反应液中进行反应，随机打断为平均500bp的DNA片段；

2)反应后，加入含有barcode的P1接头，以及10xNEB buffer,T4DNA ligase,H₂O，进行室温培养；

3)对DNA片段进行纯化，琼脂糖电泳，回收350-550bp的DNA片段；

4)处理DNA末端；

5)纯化样品；

6)再次纯化样品，加入P2连接头，室温处理；

7)通过PCR筛选同时带有P1和P2接头的序列，并进行质量和定量检测；

8)选择350-550bp的DNA片段，进行测序；

(3)分析获取SNP位点：

1)将数据质量过滤，包括去除含有连接头的reads，去除低质量的reads。

2)通过barcode对数据进行拆分，获得每个样品的数据；

3)利用SOAP2软件将测序得到的reads与参考基因组序列进行比对，如果一个原始的read无法比对上参考序列，其第一个和最后两个碱基将会被去除，之后再和参考序列进行比对，如果仍然无法匹配，则去掉最后两个碱基再比对，迭代进行，直到能够匹配或者reads短于40bp为止，然后计算相对于参考基因组的测序深度和覆盖度；

4)利用贝叶斯模型，在实际观察到的数据基础上计算出每个可能的基因型概率，挑选出概率最大的基因型作为该测序个体的特定位点的基因型，并在此基础上给出一个反映该基因型准确的质量值，得到一致序列；

5)对基因型进行筛选：在个体内具有双等位基因型和SNPs；SNPs之间距离超过100bp；

去掉次要等位基因频率(MAF)小于0.05的位点；去掉不符合哈迪温伯格平衡的位点；

6)进一步筛选SNP位点：去除次要等位基因频率(MAF)小于0.5；去除SNP在scaffold的距离小于1000Mb的位点；去除SNP位点距离大于5Mb的位点；

(4)进行种群遗传多样性监测：

1)种群结构通过Phylip软件的neighbor-joining树进行分析，利用SNPs的匹配距离矩阵计算非加权neighbor-joining树；

2)利用Admixture软件计算种群遗传结构；

3)利用VCFtools中的Weir和Cockerham’s法计算种群间的Fst值。

进一步地，上述方法还包括下述步骤：

(5)选择SNP位点，基于亲缘关系建立繁殖群体的动态家庭关系：

1)在步骤(3)获取得到的SNP位点中，随机选择80个位点，分析位点在个体间的序列差异；

2)基于选择的SNP位点，利用R软件中的Phh程序包计算川金丝猴个体的内在相关度IR，

IR作为近交系数；

3)利用R软件中的Related程序包计算川金丝猴的个体相关度(PairwiseRelatedness)；

4)利用最大似然法预测个体间的亲缘关系，模拟参数设置为10000后代，100％的取样父母，所有个体的位点总比例为0.99，错配率为0.01；

5)亲缘关系的置信水平设置为95％；

6)利用SWINGER软件，基于SNP位点的IR值和相关性值，设计出繁殖个体的最佳配对方案，根据川金丝猴的自然社群和家庭关系，每个繁殖家庭设置1个雄性个体，3个雌性个体，其中雄性个体的IR值设置为0.1，而雌性个体的IR值设置为0。

本发明利用获得的SNP位点，能够简便、准确、全面的获取川金丝猴个体的遗传信息和亲缘关系，有利于长期监测川金丝猴繁殖群体的遗传多样性和建立动态的繁殖家庭谱系。相对于已有的遗传标记方法，SNP位点的突变率高、位点数量多、分布广，能够获得更全面的遗传信息，结果更可靠。而相对于全基因组测序，SNP位点简单、数据易于分析。

附图说明

图1.基于neighbor-joining方法的SNP位点的金丝猴个体系统发育树。

图2.ADMIXTURE分析K＝2和K＝3情况下的个体贝叶斯聚类图。

具体实施方式

下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

(1)材料

采集川金丝猴血液样品，所有样品均低温冷冻保存于含有抗凝血剂的灭菌试管中。

(2)血液样品基因组DNA的提取

血液样本的DNA提取采用Blood DNA Mini Kit(QIAGEN)试剂盒。提取的方法参照试剂盒说明书，具体操作如下：

1)取200μl溶解后的血液样本入新2ml的离心管中，加20μl蛋白酶K到有样本的离心管中；

2)取200μl AL buffer溶液入离心管中，充分混匀，在56℃水浴锅中温育30mins；

3)取200μl无水乙醇加入温育好的溶液中，充分混匀，低速离下离心管盖上的液体；

4)取混合液体入Blood DNA Mini Kit的吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min；更换新吸离心管，弃离心液和旧离心管；

5)取400μl Buffer AW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μl Buffer AW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；

6)取400μl Buffer AW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；再取300μl Buffer AW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；

7)把吸附柱移到已编号的新1.5ml的离心管中，以12,000rpm速度离心2min；

8)打开盖子，室温静置5～10mins；

9)取60μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心1min；

10)重复步骤9，取60μl温育2～5mins的Buffer AE入离心柱底部，静置2mins，以12,000rpm速度离心2min；并分装DNA，保存于-20℃冰箱备用。

(3)RAD-seq基因组DNA测序

1)1.0μg基因组DNA在50μl反应液中37℃温育60min，反应液中含有5.0μl的10xBuffer和10U的限制性内切酶EcoRI。

2)反应液在65℃反应20min后，加入4.0μl的P1接头(含有barcode)(市售)，以及1.0μl的10xNEB buffer,0.5μl(1000U)T4DNA ligase,3.9μl H₂O，室温培养30min。

3)反应液在65℃反应20min，随机打断为平均500bp的DNA片段。

4)利用QIAquick(Qiagen)纯化试剂盒对DNA片段进行纯化，并用1.25％的琼脂糖电泳(0.5XTBE)，回收350-550bp的DNA片段。

5)利用Quick Blunting Kit(NEB)处理DNA末端，反应液为25μl，含有2.5μl的10xBlunting Buffer,2.5μl dNTP Mix和1.0μl的Blunt Enzyme Mix。

6)纯化样品，在含有10U Klenow Fragment酶的50μl体系中37℃反应30min，50μl体系中含有5.0μl的NEB buffer，1.0μl的dATP(10mM)。

7)再次纯化样品，加入1.0μl的P2连接头(市售)，室温处理，样品纯化后溶解于50μl体积。

8)通过PCR筛选同时带有P1和P2接头的序列，并进行质量和定量检测。

9)选择350-550bp的DNA片段，在Hiseq2500上机测序。

(4)获取SNP位点

1)数据质量过滤，包括去除含有连接头的reads，去除低质量的reads。

2)通过barcode对数据进行拆分，获得每个样品的数据，见表1。

表1.基于RAD-seq测序分析获得的川金丝猴个体原始数据和质量过滤数据

3)利用SOAP2软件将测序得到的reads与参考基因组序列进行比对，如果一个原始的read无法比对上参考序列，其第一个和最后两个碱基将会被去除，之后再和参考序列进行比对，如果仍然无法匹配，则去掉最后两个碱基再比对，迭代进行，直到能够匹配或者reads短于40bp为止。然后计算相对于参考基因组的测序深度和覆盖度，各个体的测序深度和覆盖度见表2。

4)利用贝叶斯模型，在实际观察到的数据基础上计算出每个可能的基因型概率，挑选出概率最大的基因型作为该测序个体的特定位点的基因型，并在此基础上给出一个反映该基因型准确的质量值，得到一致序列。

5)对基因型进行筛选：在个体内具有双等位基因型和SNPs；SNPs之间距离超过100bp；去掉次要等位基因频率(MAF)小于0.05的位点；去掉不符合哈迪温伯格平衡的位点。

6)SNP位点进一步筛选：去除次要等位基因频率(MAF)小于0.5；去除SNP在scaffold的距离小于1000Mb的位点；去除SNP位点距离大于5Mb的位点，各金丝猴个体获得的SNP位点数量见表2。

表2.川金丝猴个体的RAD-seq测序深度和SNP位点数量

(5)种群遗传多样性监测

1)种群结构通过Phylip软件的neighbor-joining树进行分析，利用SNPs的匹配距离矩阵计算非加权neighbor-joining树(请参见图1)。

2)利用Admixture软件计算种群遗传结构(请参见图2)。

3)利用VCFtools中的Weir和Cockerham’s法计算种群间的Fst值，结果为0.034。

(6)个体亲缘关系和繁殖群体的动态家庭关系

1)在(3)获取得到的SNP位点中，随机选择80个位点，分析位点在个体间的序列差异，见表3。

2)基于选择的SNP位点，利用R软件中的Phh程序包计算川金丝猴个体的内在相关度(Internal Relatedness，IR)，IR作为近交系数。

3)利用R软件中的Related程序包计算川金丝猴的个体相关度(PairwiseRelatedness)。

4)利用最大似然法预测个体间的亲缘关系，模拟参数设置为10000后代，100％的取样父母，所有个体的位点总比例为0.99，错配率为0.01。

5)亲缘关系的置信水平设置为95％。

6)利用SWINGER软件，基于SNP位点的IR值和相关性值，提出繁殖个体的最佳配对方案。根据川金丝猴的自然社群和家庭关系，每个繁殖家庭设置1个雄性个体，3个雌性个体，其中雄性个体的IR值设置为0.1，而雌性个体的IR值设置为0。根据上述参数，分析了27个川金丝猴个体，获得3种不同的配对方案(表4)。

表4.SWINGER软件提供的最佳川金丝猴繁殖个体配对方案

。

Claims

1.一种川金丝猴个体遗传多样性监测方法，其特征在于该方法包括以下步骤:

（1）采集川金丝猴血液样品，提取血液样品的基因组DNA；

（2）利用RAD-seq进行基因组DNA测序：

1）将基因组DNA加入含有限制性内切酶EcoRI和10xBuffer的反应液中进行反应，随机打断为平均500bp的DNA片段；

2)反应后，加入含有barcode 的P1接头，以及10xNEB buffer, T4 DNA ligase, H₂O，进行室温培养；

3) 对DNA片段进行纯化，琼脂糖电泳，回收350-550bp的DNA片段；

4）处理DNA末端；

5）纯化样品；

6) 再次纯化样品，加入P2连接头，室温处理；

7）通过PCR筛选同时带有P1和P2接头的序列，并进行质量和定量检测；

8）选择350-550bp的DNA片段，进行测序；

（3）分析获取SNP位点：

1）将数据质量过滤，包括去除含有连接头的reads，去除低质量的reads；

2）通过barcode对数据进行拆分，获得每个样品的数据；

3）利用SOAP2软件将测序得到的reads与参考基因组序列进行比对，如果一个原始的read无法比对上参考序列，其第一个和最后两个碱基将会被去除，之后再和参考序列进行比对，如果仍然无法匹配，则去掉最后两个碱基再比对，迭代进行，直到能够匹配或者reads短于40bp为止，然后计算相对于参考基因组的测序深度和覆盖度；

4）利用贝叶斯模型，在实际观察到的数据基础上计算出每个可能的基因型概率，挑选出概率最大的基因型作为该测序个体的特定位点的基因型，并在此基础上给出一个反映该基因型准确的质量值，得到一致序列；

5）对基因型进行筛选：在个体内具有双等位基因型和SNPs；SNPs之间距离超过100bp；去掉次要等位基因频率（MAF）小于0.05的位点；去掉不符合哈迪温伯格平衡的位点；

6）进一步筛选SNP位点：去除次要等位基因频率（MAF）小于0.5；去除SNP在scaffold的距离小于1000Mb的位点；去除SNP位点距离大于5Mb的位点；

（4）进行种群遗传多样性监测：

1）种群结构通过Phylip软件的neighbor-joining树进行分析，利用SNPs的匹配距离矩阵计算非加权neighbor-joining树；

2）利用Admixture软件计算种群遗传结构；

3）利用VCFtools中的Weir和Cockerham’s法计算种群间的Fst值。

2.根性权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括下述步骤：

（5）选择SNP位点，基于亲缘关系建立繁殖群体的动态家庭关系：

1）在步骤（3）获取得到的SNP位点中，随机选择80个位点，分析位点在个体间的序列差异；

2）基于选择的SNP位点，利用R软件中的Phh程序包计算川金丝猴个体的内在相关度IR，IR作为近交系数；

3）利用R软件中的Related程序包计算川金丝猴的个体相关度（PairwiseRelatedness）；

4）利用最大似然法预测个体间的亲缘关系，模拟参数设置为10000后代，100%的取样父母，所有个体的位点总比例为0.99，错配率为0.01；

5）亲缘关系的置信水平设置为95%；

6）利用SWINGER软件，基于SNP位点的IR值和相关性值，设计出繁殖个体的最佳配对方案，根据川金丝猴的自然社群和家庭关系，每个繁殖家庭设置1个雄性个体，3个雌性个体，其中雄性个体的IR值设置为0.1，而雌性个体的IR值设置为0。