CN104988240A

CN104988240A - 利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法

Info

Publication number: CN104988240A
Application number: CN201510478734.5A
Authority: CN
Inventors: 苏松坤; 刘小彦; 李志国; 许叔鹏; 孟魏宏
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-08-03
Also published as: CN104988240B

Abstract

本发明涉及一种利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法，包括蜜蜂个体取样、蜜蜂样本DNA提取、合成引物、PCR检测和鉴别蜂群王浆高产性状，根据从该蜂群中随机收集的工蜂个体在SNP标记rs16287910出现T等位基因的频率P_T和C等位基因的频率P_C之间是否存在显著差异，鉴别蜂群王浆高产性状。本发明从分子生物学水平，提供了使用意大利蜜蜂工蜂个体王浆高产相关的SNP（rs16287910）标记，科学、准确、快速地鉴别意大利蜜蜂蜂群王浆高产性能，可以大大缩短王浆高产意大利蜜蜂的选育周期，加快蜜蜂育种速度。

Description

利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别蜜蜂蜂群王浆高产性状的方法，具体涉及一种利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法，属生物技术领域。

背景技术

蜂王浆具有许多重要的营养和药物价值，对人类健康十分有益，是天然的滋养食品。我国是养蜂大国，蜂王浆的产量占世界总量的90%以上，这与我国饲养的蜜蜂品种有着密不可分的关系。我国的蜂业科学家和科技人员经过蜜蜂集团闭锁繁殖育种方法培育出了“浙农大1号”和萧山浆蜂，产浆能力显著高于中华蜜蜂和其它蜂种，同时也具有良好的蜂蜜采集能力，已成为我国的特有和主要饲养蜂种。一直以来，我国的蜂业科技工作者致力于王浆高产蜜蜂的相关研究，以期发现王浆高产机制和王浆高产性状相关的遗传标记等，加强王浆高产蜂种的保种和选育工作，充分发挥我国优良蜂种资源的优势。就王浆高产性状相关研究、分子标记意义和SNP技术及其在蜜蜂研究领域的应用等方面进行的研究概述如下：

1、王浆高产性状相关标记的研究

（1）形态学遗传标记：蜜蜂咽下腺是位于工蜂头部的合成并分泌蜂王浆的主要腺体，其活性常被用于衡量蜜蜂的泌浆能力。邵瑞宜等（2003）发现工蜂头重与咽下腺重量存在极显著相关性，且咽下腺重量可作为衡量王浆生产性能的重要指标，因此吐浆工蜂的头部重量与王浆生产性能可能存在一定相关性。郑爱娟等（2010）发现，浆蜂工蜂蛹的头重在各日龄均极显著高于原种意大利蜜蜂工蜂蛹头重，工蜂头重有可能成为王浆高产蜂种在外部形态学水平上的标记。此外，人们研究咽下腺的解剖形态学发现，工蜂的咽下腺小囊数、咽下腺大小和重量、以及咽下腺体外合成蛋白质的速率均可作为咽下腺活性的衡量指标，其中工蜂的咽下腺长度与王浆产量的相关性最大，可能作为意蜂王浆生产性能较理想的形态学遗传标记。

（2）细胞学遗传标记：通过对“浙农大1号”意蜂雄蜂和原种意蜂雄蜂的染色体核型进行分析比较发现，两个不同蜂种雄蜂的第7、10、12 条染色体的臂比存在着极显著差异。这种差异可能是“浙农大1号”意蜂雄蜂染色体复制时，控制产浆性状的多对等位基因片段重复复制，造成了微效基因数增多的缘故。染色体G 带分析中还发现第3条染色体“浙农大1号”意蜂比原种意蜂多了一个条带。

（3）生化遗传标记：同工酶是生化标记的一种，由于遗传差异可以产生多种酶形式。在蜜蜂领域研究比较多的是苹果酸脱氢酶（MDH），该酶由三个等位基因编码：MDH Ⅰ、MDH Ⅱ和MDH Ⅲ，只有MDH Ⅱ在蜜蜂的不同级型和发育阶段表现出多态性。关迎辉等（1994）研究发现，王浆高产蜜蜂（“浙农大1号”意蜂）的MDH Ⅱ杂合度比其他两种意蜂（湖北意蜂和原种意大利蜜蜂）的高，且新发现了其他两种王浆低产意蜂中所没有的aa、ab 基因型，可作为王浆高产蜂种的生化遗传标记。此外，西方蜜蜂的三个蜜蜂亚种的MDH Ⅱ的基因型频率、基因频率及杂合纯合度均存在极显著差异，这一结果表明，可通过测定MDH Ⅱ的基因频率和杂合纯合度从生化遗传角度对不同蜂种进行鉴定。鲍秀良（1997）研究报道，王浆高产蜜蜂（“浙农大1号”意蜂）及其他四种意蜂品系的MDH Ⅱ多态性呈显著性差异。综上得知，蜜蜂的苹果酸脱氢酶Ⅱ（MDH Ⅱ）有可能成为王浆高产性状相关的生化水平的遗传标记。

（4）分子遗传标记：基因多态性是指在生物体中普遍存在的两种或两种以上的基因型或等位基因，在有关王浆高产蜂种遗传标记的研究中也有应用。“浙农大1号”、平湖和萧山浆蜂均为王浆高产蜂种，分属于3种不同的蜜蜂品系。张娅娟等（2001）通过对这三个品种的蜜蜂进行随机扩增多态DNA-PCR（RAPD-PCR）分析，得到了共同的特异性DNA片段W316bp，这一现象说明该DNA片段可能与王浆高产性状相关。接着，蒋滢等（2002）又分别对这三种浆蜂的工蜂和雄蜂进行了DNA多态性图谱分析，在三种蜜蜂的工蜂中均有W316bp的存在，但在雄蜂中没有发现，这表明W316bp仅存在于工蜂中。王尉平等（2002）采用RAPD-PCR技术同时分析了3个王浆高产蜂种和王浆低产蜂种卡尼鄂拉蜂的基因多态性，结果在卡尼鄂拉蜂中没有发现W316bp，而在3种浆蜂中仍有检测到，进一步证明了W316bp可作为王浆高产蜂种的遗传标记。随后，戴英等（2003）不仅研究了3种浆蜂，而且对本地意蜂、黑环系蜜蜂等也进行了研究，采用特征序列扩增区域（SCARs）法对W316bp进行验证，结果与前人的研究一致，表明了W316bp很可能是王浆高产性状相关的一个分子标志。之后金水华（2003，2004）也通过实验证明了W316bp的可靠性。

微卫星DNA是普遍存在于生物体基因组中简单的核苷酸重复序列，微卫星标记是一种广泛应用于动植物育种中的遗传标记。“浙农大1号”、原种意大利蜜蜂和本地意大利蜜蜂是我国饲养比较多的西方蜜蜂品种，具有不同的产浆能力，李建科等（2003）分析了这3种蜜蜂的10个微卫星位点，发现这些微卫星位点在每种蜜蜂中扩增出来的等位基因数均不同，呈现出为多态性，其中“浙农大1号”蜜蜂的特有等位基因最多，并根据等位基因频率的分析结果找到了7个可以作为王浆高产蜂种的微卫星标记，并通过遗传距离分析印证了“浙农大1号”蜜蜂的进化史。

潘娇等（2012）采用覆盖了蜜蜂基因组的基因芯片技术对王浆高产蜂种和低产蜂种进行了分析，筛选出369个差异表达基因，其中上调表达基因201个，下调表达基因168个，通过生物信息学的分析，发现这些基因可能参与了蜜蜂与分泌蜂王浆相关的生物学过程，如嗅觉系统、神经系统、运动系统以及腺体功能发育等。进一步的qPCR检测和相关性分析表明有3个基因（dop2、SsRbeta和hex71）与王浆高产性状密切相关，认为其可作为王浆高产的分子标记。

以上这些关于蜜蜂王浆高产性状相关的研究大多数在蜜蜂基因组测序完成之前进行的，采用的方法比较传统，筛选的范围存在一定的局限性，因而有学者提出质疑。比较可靠的是潘娇等（2012）采用基因芯片技术在蜜蜂基因组范围内筛选出来的3个分子标记，但是采用该方法检测需提取蜜蜂RNA并使用荧光定量仪器，使鉴定过程复杂、成本较高，不利于该方法的普及。

因此，采用强大成熟、更加科学的分子研究技术从基因水平对王浆高产性状进行研究，从而寻找一种操作简单、可靠性高、成本低的方法来鉴别蜜蜂的蜂王浆生产性能显得尤为重要。

2、SNP技术

单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基 (A与G) 和嘧啶碱基 (C与T) 之间。SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记之一。目前，可以通过提取基因组DNA并随机打断、加上接头、上机测序、生物信息学分析等步骤可以准确获得基因组的SNP信息，筛选出与特异性状相关的SNP分子标记。

作为新一代生物技术，虽然SNP技术具有极高的实用价值、在人类疾病领域的应用已取得一定进展。本发明采用SNP技术对意大利蜜蜂成年工蜂王浆高产性状进行鉴定，据此可以准确、高效、快速地选择王浆高产蜜蜂进行育种，为通过基因手段培育更加优质的产浆蜂种奠定良好基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

本发明的利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法，其特征在于鉴别步骤如下：

（1）蜜蜂个体取样：从考察的意大利蜜蜂蜂群中，收集成年蜜蜂工蜂个体，随机取样，每群以50只蜜蜂代表整个蜂群，将蜜蜂样本放于-20℃冰箱中冷冻备用；

（2）蜜蜂样本DNA的提取：分别取步骤（1）蜜蜂冷冻样本的头部和胸部，进行组织破碎，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定；

（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下：

Primer-F：5’- TCCTTCGGCCTCCAGAAA -3’

Primer-R：5’- CGAATGTGGATCTCTTCGTGT -3’；

（4）PCR检测：以步骤（2）蜜蜂基因组DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；

反应的体系为：总体积30μL，内含反应底物Mix 15μL，Primer-F 1μL，Primer-R 1μL，DNA模版 2μL，ddH₂O 11μL；

反应的条件为： 94 ℃预变性 5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s， 72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸8 min；

对PCR反应产物进行凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；

（5）鉴别蜂群王浆高产性状：将步骤（4）的测序结果用Alignment软件进行序列比对分析，根据蜂群的C等位基因频率P _C值，鉴别蜂群王浆高产性状。当蜂群的C等位基因频率显著大于T等位基因频率时，此蜂群为王浆高产蜂群，所述显著指统计学的P<0.05。所述SNP标记为蜜蜂王浆高产相关的基因组位点rs16287910。

本发明采用SNP位点rs16287910来鉴定王浆高产蜜蜂的方法是经过严格的筛选和验证的。以王浆高产蜂种（“浙农大1号”）和王浆低产蜂种（美国意大利蜜蜂）为研究对象，提取蜜蜂样本的基因组DNA，然后送于北京百迈克生物技术公司采用SLAF-seq技术进行单体型测序和分子标记的开发，进一步进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS），初步筛选出21个与王浆高产性状相关的SNPs。另外，采集王浆高、低产蜜蜂样本，通过PCR和DNA测序技术对初步筛选的SNPs进行验证，筛选出rs16287910，作为蜂王浆产量性状相关的分子标记。

本发明的优点及有益效果：

1、蜂群的产浆能力会受到基因型的影响，而且存在王浆高产蜂群中特定等位基因显著高于王浆产量低的蜂群。该SNP标记等位基因C基因频率P _C在王浆高产蜂群和王浆低产蜂群中的差异极显著，即王浆高产蜂群中C等位基因频率显著高于王浆低产蜂群中C等位基因频率，因此根据此结果可以方便、快捷、准确地鉴定蜂群是否具有王浆高产的能力。

2、根据统计指标判断蜂群的蜂王浆生产能力：蜂群中随机采集的蜜蜂工蜂个体在该SNP位点 P _C> P _T（P< 0.05）的是王浆高产蜂群， P _C< P _T （P< 0.05）的是王浆低产蜂群。据此选择王浆产量高的蜂群，提高蜂群的王浆产量，从而增加蜂农的收入。采用本发明利用蜜蜂王浆高产相关的SNP标记鉴别蜂群王浆高产性状的方法，可以大大提高效率。

3、使用本发明方法目前主要在实验室从分子水平掌握蜜蜂的王浆高产机制，检测与产浆性状相关的分子遗传标记，并结合分子遗传标记辅助蜜蜂品种选育技术，不但能保证选择的准确性，还可以加快蜜蜂品种选育速度，大大提高了选育王浆高产蜂种的成功率，可以安全、有效、快速地进行王浆高产蜂种的鉴别。

附图说明

附图为蜜蜂王浆高产相关的SNP标记rs16287910的基因型判断参考峰图。其中：

图1中方框标注的SNP标记基因型为纯合TT，主要存在于蜂王浆低产蜂群中；

图2中方框标注的SNP标记基因型为纯合CC，主要存在于蜂王浆高产蜂群中；

图3中方框标注的SNP标记基因型为杂合CT，在蜂王浆高、低产蜂群中均有出现。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1

一种利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法，包括以下步骤：

（1）蜜蜂取样：王浆高产蜂种（“浙农大1号”）和王浆低产蜂种（美国意大利蜜蜂）各取50只成年蜜蜂工蜂个体，将每个个体分别放在一个离心管中，于-20℃冷冻保存备用；

（2）蜜蜂样本DNA的提取（使用生工公司的动物基因组快速提取试剂盒，SK8222）

将步骤（1）的工蜂个体用眼科手术剪剪去四肢、翅膀和腹部，仅保留头部和胸部，放于盛有液氮的研钵中，用研磨棒破碎，然后转移到1.5 mL离心管中，加入400 μL Buffer Digestion，震荡均匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。然后取出上清液加入10 μL 的RNA酶A（10mg·mL-1），静置5 min。

加入200 μL Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5 min。

室温10000 rpm离心5 min，将上清液400 μL 转移到新的1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿混匀，12000 rpm离心取上清。

加入400 μL异丙醇，手工震荡1 min，室温放置2 min，室温10000 rpm离心5 min，弃上清液。

加入1 mL 体积比为75%的乙醇（超纯水稀释），轻微震荡1 min，使沉淀悬浮起来，室温10000 rpm离心2 min，弃上清液。

重复步骤一次。

打开离心管盖倒置在干净纸巾上，至残留的乙醇完全挥发，获得DNA。

将得到的DNA用50 μL TE Buffer溶解，用琼脂糖凝胶和NanoDrop 2000紫外分光光度计检测提取的DNA质量，最后将其放于-20℃保存备用。

（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下

Primer-F：5’- TCCTTCGGCCTCCAGAAA -3’

Primer-R：5’- CGAATGTGGATCTCTTCGTGT -3’

将其稀释至10 μmol/μL，用后-20℃保存。

（4）PCR检测：以步骤（2）的每个蜜蜂个体的DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序。

PCR反应体系(30 μL):

Mix: 15 μL

Primer-F: 1 μL

Primer-R: 1 μL

Template: 2 μL

ddH₂O: 11 μL

反应条件：

94℃ 5min

94℃ 30sec

55℃ 30sec 35个循环

72℃ 1min

72℃ 8min

4℃ Hold

（5）SNP标记的筛选和对获得的测序结果分析：

下面是PCR产物的部分DNA序列，该SNP（rs16287910）标记在序列中的位置标记为 C/T 。

5’-TCCTTCGGCCTCCAGAAAATTCTCGAAATGACAAATTTGAAAATTAAATATTTTGCTAGTGAACGATAGTGTACATGTACGTTCGTGACGTTTTTGCCGCTAATTGTACTTTTATAATATTTGTTTAACATGTCATTTCATCGTA C/T ACTTATACTTACGCGTCTCATAGACGCACACAGATCATCAGAAAGATCTCTGATACGATTAAATTTATTCGAGTTAAGATTTTTTTGAATTTGTTCCAAATATATTTAAAATTGGAATAGAATGCCCGTTATTAAAATGGAAAAAATCACAAATTTGGGAATAATTTCGAATCGTTTCATTAGTTTTATTAAATAATCTTTGAACTATTTAAATCAATT-3’

查看PCR产物测序峰图，定位该SNP标记在峰图中的位置，基因型峰图标准如图1、图2和图3标记位置，判断每个样本该标记是纯合TT、杂合CT或纯合CC三种类型中的哪种基因型并统计。

（6）利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状：将步骤（4）的PCR测序结果用Alignment软件进行序列比对、统计该标记峰图类型，计算出基因型和基因频率，如表1所示。根据分析结果，如果鉴定蜂群的C等位基因频率显著大于T等位基因频率，可判断蜂群为蜂王产浆高产蜂群。

表1 不同基因型对蜂群产浆能力的影响及基因频率分布情况

表1通过费希尔确切概率T检验 (Fisher’s Exact Test) 统计得到 P=3.55E-04 <0.05，表明不同产浆能力的蜂群与不同基因型之间存在极显著差异，具有统计学意义，表明蜂群的产浆能力会受到基因型的影响。王浆高产组的P _T显著小于P _C，而低产组中P _T显著大于P _C。

本发明采用的主要试剂如下（所有化学试剂均为分析纯）：

无水乙醇，异丙醇，氯仿，超纯水，全式金Trans DNA Marker I，全式金2×EasyTaq PCR SuperMix，全式金琼脂糖，全式金Galstain，生工50×TAE电泳缓冲液，动物基因组快速提取试剂盒SK8222，上下游引物由合成，核酸酶A。

本发明所使用的仪器主要如下：

Axygen 1.5 mL离心管，Axygen PCR管，微波炉，电子天平，震荡器，小型离心机，水浴锅，微量移液枪，电泳仪，ABI公司96孔PCR仪，上海培清科技有限公司凝胶成像分析仪，高速离心机，低温冰箱，高压灭菌锅，NanoDrop 2000等。

<110> 福建农林大学

<120> 利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccttcggcc tccagaaa 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgaatgtgga tctcttcgtg t 21

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> 蜜蜂

<400> 3

tccttcggcc tccagaaaat tctcgaaatg acaaatttga aaattaaata ttttgctagt 60

gaacgatagt gtacatgtac gttcgtgacg tttttgccgc taattgtact tttataatat 120

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tttgggaata atttcgaatc gtttcattag ttttattaaa taatctttga actatttaaa 360

tcaatt 366

Claims

1. 一种利用SNP标记rs16287910鉴别蜂群王浆高产性状的方法，其特征在于鉴别步骤如下：

（2）蜜蜂样本DNA的提取：分别将步骤（1）中冷冻蜜蜂样本的头部和胸部，进行组织破碎，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定；

（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下：

Primer-F：5’- TCCTTCGGCCTCCAGAAA -3’

Primer-R：5’- CGAATGTGGATCTCTTCGTGT -3’；

（4）PCR检测：以步骤（2）蜜蜂DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；

反应的体系为：总体积30μL，内含反应混合物Mix 15μL，Primer-F 1μL，Primer-R 1μL，DNA模版 2μL，ddH₂O 11μL；

反应的条件为： 94 ℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸8 min；

对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；

（5）鉴别蜂群王浆高产性状：将步骤（4）的测序结果用Alignment软件进行序列比对分析，根据蜂群的C等位基因频率P _C值，鉴别蜂群王浆高产性状。

2.根据权利要求1所述的一种利用SNP标记鉴别蜂群王浆高产性状的方法，其特征在于当蜂群的C等位基因频率显著大于T等位基因频率时，此蜂群为王浆高产蜂群，所述显著指统计学的P<0.05。