CN103409527A - 利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，包括蜜蜂样本采集、蜜蜂头部RNA提取、蜜蜂头部cDNA合成、引物设计、qRT-PCR反应体系和条件，以及蜂王浆产量性能鉴别。本发明从分子生物学高度，针对蜂王浆生产受蜂群群势、蜜源、环境、气候等条件影响巨大的问题，提供了能够更科学、准确地鉴别蜂群的王浆产量性能优劣的荧光定量PCR方法，可以大大缩短蜂王浆生产性状考察周期，加快蜜蜂育种速度，降低蜂王浆生产性状考察的成本和育种成本，还能减轻田间蜂王浆产量性能考察的工作强度。

Description

利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法

技术领域

本发明涉及一种利用荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，具体涉及利用蜜蜂多巴胺受体2（Dop2）基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法。

背景技术

我国是养蜂大国，更是蜂王浆的主要生产国，全世界90%以上王浆产自中国，王浆高产蜜蜂更是我国特有的蜂种资源。一直以来，我国的蜂业科技工作者致力于王浆高产蜜蜂遗传育种的相关研究，以期发现王浆高产性状相关的遗传标记，为蜜蜂王浆高产育种服务。在蜜蜂形态学水平、细胞学水平、生化水平及分子水平对王浆高产相关的遗传标记进行了研究。概述如下：

、形态学遗传标记

邵瑞宜等（2003）发现工蜂头重与咽下腺重量存在极显著相关性，且咽下腺重量可作为衡量王浆生产性能的重要指标，因此吐浆工蜂的头部重量与王浆生产性能可能存在一定相关性。郑爱娟等（2010）发现，浆蜂工蜂蛹的头重在各日龄均极显著高于原种意大利蜜蜂工蜂蛹头重，工蜂头重有可能成为王浆高产蜂种在外部形态学水平上的标记。蜜蜂咽下腺是位于工蜂头部的合成并分泌蜂王浆的主要腺体，其活性常被用于衡量蜜蜂的泌浆能力。人们研究咽下腺的解剖形态学发现，工蜂的咽下腺小囊数、咽下腺大小和重量、以及咽下腺体外合成蛋白质的速率均可作为咽下腺活性的衡量指标，其中工蜂的咽下腺长度与王浆产量的相关性最大，可能作为意蜂王浆生产性能较理想的形态学遗传标记。

、细胞学遗传标记

通过对“浙农大1号”意蜂雄蜂和原种意蜂雄蜂的染色体核型进行分析比较发现，两个不同蜂种雄蜂的第7、10、12条染色体的臂比存在着极显著差异。这种差异可能是“浙农大1号”意蜂雄蜂染色体复制时，控制产浆性状的多对等位基因片段重复复制，造成了微效基因数增多的缘故。染色体G带分析中还发现第三条染色体“浙农大1号”意蜂比原种意蜂多了一个条带。

、生化遗传标记

同工酶是由遗传差异产生的多酶形式，可以直接反映基因表达的差异性，可作为一种生化遗传标记被广泛应用于群体遗传、分子育种和种属鉴定的研究。蜜蜂研究中的苹果酸脱氢酶（MDH）是由三个等位基因编码的等位基因酶，其遗传性极稳定。其酶谱可分为三个区带：MDHⅠ、MDHⅡ、MDHⅢ, 但只有MDHⅡ在不同级型和不同发育阶段呈多态性。通过分析MDHⅡ的基因型频率、基因频率和杂合纯合度，已在王浆高产蜂种的生化遗传标记研究方面取得了一定进展。关迎辉等（1994）研究发现，王浆高产蜜蜂（“浙农大1号”意蜂）的MDHⅡ杂合度比其他两种意蜂（湖北意蜂和原种意大利蜜蜂）的高，且新发现了其他两种王浆低产意蜂中所没有的aa、ab基因型，可作为王浆高产蜂种的生化遗传标记。此外，西方蜜蜂的三个亚种蜜蜂的MDHⅡ的基因型频率、基因频率及杂合纯合度均存在极显著差异，这一结果表明，可通过测定MDHⅡ的基因频率和杂合纯合度从生化遗传角度对不同蜂种进行鉴定。鲍秀良（1997）研究报道，王浆高产蜜蜂（“浙农大1号”意蜂）及其他四种意蜂品系的MDHⅡ多态性呈显著性差异。综上得知，蜜蜂的苹果酸脱氢酶Ⅱ（MDHⅡ）有可能成为王浆高产性状相关的生化水平的遗传标记。

、分子遗传标记

    目前已在微卫星位点研究、基因研究方面取得的一定进展，但是在基因水平的研究不多见，还需要运用更成熟、更科学的技术对其进一步研究。

自从1993年在蜜蜂的基因组内发现了微卫星以来，蜜蜂遗传学家利用微卫星进行了许多研究，这些研究主要集中在蜜蜂种质资源上的品质分类、起源、群体遗传结构分析以及遗传多样性研究等，为蜜蜂的遗传育种工作奠定了基础。有学者通过采用10个微卫星位点对3种产浆能力不同的蜜蜂（“浙农大1号”意蜂、本地意蜂、原种意蜂）进行研究发现，10个微卫星位点在3个蜂种中共扩增出96个等位基因，包含48个差异等位基因，即表明这10个微卫星位点在3个蜂种中呈高度多态性，且这3个蜂种之间存在一定的遗传距离。等位基因频率的分析结果表明，其中6个位点的7个等位基因的频率是随着蜜蜂产浆能力的变强而顺序增加，且“浙农大1号”意蜂的这7个等位基因频率均显著高于其他两种蜜蜂，同时，另外4个位点的4个等位基因频率则呈现相反趋势，即“浙农大1号”意蜂的等位基因频率显著低于其他两种蜜蜂。 “浙农大1号”意蜂、本地意蜂、原种意蜂都是属于西方蜜蜂的同一亚种，它们的产浆性能差异主要来自于人工选择后形成的遗传多样性，通过微卫星DNA分析技术对三个蜂种研究证明了蜜蜂产浆性状的62%-89%是由遗传因素决定，而上述10个微卫星位点的等位基因频率在三个产浆性能各异的蜂种中呈现出了非常规律的多样性。据此推测，这10个微卫星位点的等位基因的频率可能与王浆产量性状存在紧密的连锁关系。

   1999年，有人从基因水平对王浆高产性状进行了初步探索。W316bp是以随机引物W（5’—CGGCCCCGGT—3’），通过RAPD-PCR扩增获得的特异DNA片段，众多研究表明W316bp只出现在王浆高产意蜂的多态性图谱中。王尉平等（2002）利用12种随机引物对产浆能力不同的四个蜜蜂品系（“浙农大1号”意蜂、平湖浆蜂、萧山浆蜂、卡蜂）进行了RAPD-PCR和Southern杂交分析，得到了王浆高产性状相关的特异标记P2W316bp。张娅娟等（2001）将W316bp制备成探针，分别与王浆高产蜜蜂和卡蜂的RAPD-PCR扩增产物进行杂交，结果再次表明，W316bp可能是王浆高产意蜂特有的基因片段。

但也有学者对此提出了质疑。他们认为，以上实验的蜜蜂种类和样本量太少，以及样本选择也不是非常科学，不能因为三个王浆高产蜜蜂中有而低产蜜蜂中没有就简单推定W316bp可以作为王浆高产性状的标记，它还有可能与四个不同蜂种的其他生物学特性有关。

因此，有必要借助更加强大成熟、更加科学的分子研究技术从基因水平对王浆高产性状进行研究，以探讨从分子生物学水平上鉴别蜜蜂王浆产量性能的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法。所述蜜蜂Dop2基因，指蜜蜂多巴胺受体2（Dop2）基因。

本发明的目通过以下技术方案实现。

本发明的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于鉴别方法如下： 

（1）蜜蜂取样：从被考察蜂群中，每群分别采集30只哺育蜂，所述哺育蜂指蜂群中哺育幼虫的工蜂，即6－12日龄的工蜂；

（2） 蜜蜂头部RNA提取及cDNA合成：提取所采集哺育蜂头部的RNA，反转录获得cDNA；即采用TRizol方法提取RNA，采用反转录试剂盒完成cDNA的合成；

（3）引物设计：设计合成的引物序列如下：

Primer-F：5’- atctgttggctacctttcttcg-3’

Primer-R：5’- aacgctctacgaaaatctctgc-3’；

（4）荧光定量PCR检测：以稀释后的蜜蜂头部cDNA为模板， 以Primer-F和 Primer-R为引物，进行荧光定量PCR；选用蜜蜂头部的GAPDH为内参基因，采用2 ^-△△ct 方法计算蜜蜂Dop2基因的表达量；在每个蜂群样本的每次qRT-PCR反应中均重复多次，取多次重复的平均值为蜜蜂Dop2基因的最终表达量，最终表达量越高，则表明該蜂群的蜂王浆产量性能越好；所述2^-△△ct为蜜蜂Dop2基因的相对表达量，其中△△Ct = (Ct_target-Ct_GAPDH) _treatment- (Ct_target -Ct_GAPDH) _control。

本发明的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其荧光定量PCR的反应体系为：总体积为20ul，内含SYBR GreenⅠ 10ul，Rox 0.4ul，Primer-F 0.4ul，Primer-R 0.4ul，cDNA 2ul，DEPC水补足到20ul。

本发明的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其荧光定量PCR的反应条件如下：预变性 95℃，30s，PCR反应40 cycles，95℃，5s，61℃, 31s，溶解曲线 55℃，20s。

本发明的优点及有益效果：本发明对筛选蜜蜂Dop2基因进行深入的研究，通过定向选育手段，在同一蜂种中分别培育了王浆高产和王浆低产蜜蜂。根据从NCBI上检索的9792条已注释的蜜蜂基因和本发明在蜜蜂幼虫中新检测的1722条基因，以及175条与王浆分泌可能紧密相关的基因，设计和制备了含有11689条蜜蜂基因的基因芯片（Agilent），分别与王浆高产蜜蜂及王浆低产蜜蜂中正在吐浆的哺育蜂的头部cDNA进行杂交，初步筛选出369条差异表达的基因。另外，采集王浆高、低产蜜蜂样本，通过qRT-PCR技术对差异表达基因进行验证，筛选出蜜蜂Dop2基因，作为蜂王浆产量性状相关的分子标记。进而设计引物，以蜜蜂头部cDNA为模板， 以Primer-F和 Primer-R为引物，进行荧光定量PCR；选用蜜蜂头部的GAPDH为内参基因，采用2 ^-△△ct 方法计算蜜蜂Dop2基因的表达水平；其结果为蜂王浆产量性能与蜜蜂Dop2基因的最终表达量密切相关，蜜蜂Dop2基因的最终表达量高，则蜂王浆产量性能好。

本发明与现有技术相比，显著优点是：

1、因为蜂王浆生产受蜂群群势、蜜源、环境、气候等条件影响巨大，本发明采用的蜜蜂Dop2基因作为蜂王浆高产性状相关的分子标记，能够更科学、准确地检测蜂群的王浆生产性状的优劣，为蜜蜂王浆高产育种提供分子辅助选育手段。

2、可以在实验室方便地检测蜜蜂Dop2基因表达丰度以判断蜂群的王浆生产性状，减轻田间蜂王浆生产性状考察的工作强度。

3、蜂群从繁殖到蜂王浆生产需要两个月以上的时间，蜂王浆生产性状考察周期在三个月以上，而蜜蜂Dop2基因表达丰度检测只需要一天时间，所以，采用本发明可以大大缩短蜂王浆生产性状考察周期，加快育种速度。

4、本发明方法与传统方法相比，能大大降低蜂王浆生产性状考察的成本和育种成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1  一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，包括以下步骤：

、蜜蜂样本采集

① 产浆季节，连续5次对浙江千岛湖实验蜂场的30群蜜蜂组织生产王浆，称量并记录每群每次的王浆重量及王台接受数量。

②分别筛选出5个王浆高产蜂群和5个王浆低产蜂群以及其他4个王浆产量在高产和低产之间且王浆产量呈梯度趋势的蜂群，共14个蜂群作为被考察蜂群。所述王浆高产蜂群和王浆低产蜂群的王浆产量范围为高产群三天一批群产蜂王浆不低于100克，而低产群三天一批群产蜂王浆不高于80克；

③ 再次组织所选定蜂群进行王浆生产，产浆的第二天，用镊子分别在14个蜂群中每群采集30只正在吐浆的哺育蜂，立即放入液氮，接着分类装管并于-80℃冰箱保存。

2、RNA提取

①从超低温冰箱中取出蜜蜂样本，用灭菌后的剪刀剪下蜜蜂的头部（在冰上操作），并用DEPC水配制的PBS缓冲液洗去蜜蜂头部的灰尘。所述PBS为磷酸缓冲液。

②将蜜蜂头部放入研钵中，加入液氮并研磨为粉末，然后将粉末转移至50ml离心管，于离心管中加入TRizol， 30只蜜蜂加3ml。用匀浆仪或振荡器进行振荡、匀浆处理。

③将匀浆样品在室温放置10min，使核酸蛋白质复合物完全分离，且4℃ 12000g离心10min，取上清。

④将所取上清转移至3个1.5ml离心管，并加入氯仿，振荡15秒，室温放置5min，所述氯仿的加入量为每使用3ml TRizol，加入0.6ml 氯仿。

⑤4℃ 12000g离心15min，取上清500ul转移至新的2ml离心管中。

⑥上清液中加入等体积的异丙醇（沉淀水相中的RNA），混匀后室温放置10min。

⑦4℃ 12000g离心10min。管侧和管底出现胶状沉淀，弃上清（若沉淀质量不好，需在此沉淀的基础上，重新加TRizol进行抽提）。

⑧用体积浓度为75%的乙醇（冰预泠，DEPC水配制）洗涤RNA沉淀。每使用3ml TRizol至少加3ml 75%乙醇，振荡几下，不超过7500g 离心5min，弃上清。

⑨室温干燥10min，加40ul DEPC水，用枪头吸打几次，55℃放置10min，使RNA 溶解。

⑩Total RNA浓度测定:用NanoDrop 2000检测所提取RNA的浓度以及A260/A280值。

3、cDNA合成

① 将上述符合要求的RNA稀释40倍（3ulRNA+117ulDEPC水）。

② 把RNA在65℃条件下热变性5min，立即放于冰上冷却。

③ 用反转录试剂盒完成cDNA的合成，配置如下反应液（50ul体系）：

Total RNA，0.6ul (注Total RNA 的使用量为500-1000ng)； 5*RTbuffer，10ul；Primer mix，2.5 ul； RT Enzyme Mix，2.5 ul； RNase free dH₂O 加至总反应体积为50ul。

④ 反应条件：37℃  15min（反转录反应）

98℃  5min （酶失活反应）

⑤ 取出置于冰上备用，或置于-20℃条件下保存。

⑥ cDNA浓度测定：用NanoDrop 2000测定cDNA的浓度以及A260/A280值。

、引物设计

我们对蜜蜂多巴胺受体2（Dop2）基因进行了qRT-PC筛选验证，应用primer5.0和Primer3 Plus软件设计该基因引物，由上海生工生物工程有限公司完成引物合成。共设计与合成了2对引物，包括1个验证基因和1个参照基因GAPDH（control）。设计和选择引物的最主要原则是，首先确保引物的特异性，能够准确扩增出目的产物；其次是扩增产物的大小为80～250bp，因为这个范围内的扩增片段比较适用于qRT-PCR方法，扩增片段太长会降低扩增效率且容易导致非特异性反应，扩增片段太短也会影响产物的非特异性扩增，影响定量的准确性；最后，所用引物的GC含量在40-60%范围内，且退火温度（Tm值）宜保持一致，有利于整体反应条件的设置。引物序列结果如表1所示。

 

表1  目的基因的引物序列

5、qRT-PCR反应体系及条件

将上述步骤3所得的蜜蜂头部cDNA 6倍体积稀释（5ul原液+25ul DEPC水），备用。并准备如下反应体系（20ul）：

SYBR Green Ⅰ：  10ul

          Rox： 0.4ul

      Primer(F)：  0.4ul            

      Primer(R)： 0.4ul

         cDNA：  2ul

       DEPC水： 6.8ul

反应条件：           

预变性       95℃， 30s

PCR反应    （40 cycles）

95℃， 5s

               61℃,  31s

    溶解曲线     55℃， 20s

6、鉴别蜂王浆产量性能

选用在蜜蜂头部表达非常稳定的GAPDH为内参基因，采用2^-△△ct 方法计算目的基因的表达水平。其中目的基因相对表达量=2^-△△Ct, △△Ct = (Ct_target -Ct_GAPDH) _treatment - (Ct_target-Ct_GAPDH) _control ，选择王浆产量最低的那群蜜蜂为对照组（control），其他13群蜜蜂代表的是实验组(treatment)。

目的基因在每个蜂群样本的每次qRT-PCR反应中均重复三次，取三次反应的2^-△△Ct平均值为该基因在该蜂群样本中的最终表达量，蜜蜂Dop2基因的最终表达量高，则蜂王浆产量性能好；最后对王浆高、低产组蜜蜂样本（每组5个蜂群）间的基因差异表达情况选用SPSS13.0软件中的非配对样本均数t检验法进行统计分析，0.01<P<0.05时，差异显著；P<0.01时，差异极显著。

实施例2、王浆高产蜜蜂Dop2基因表达丰度显著高于王浆低产蜜蜂

通过连续5次对蜂场内30群蜜蜂的王浆产量统计，最终筛选了5个王浆高产蜂群和5个王浆低产蜂群。结果表明，王浆低产组五群五次的王浆平均产量为64.32g，王浆高产组五群五次的平均王浆产量达到115.64g，且对王浆高产、低产组10群蜜蜂的王浆产量进行的方差分析结果显示F_1，40=76.3935、P=0.0001，即王浆高、低产组的王浆产量存在呈差异极显著。

通过qRT-PCR技术对蜜蜂Dop2基因进行表达丰度检测。王浆高产组五个蜂群蜜蜂中的Dop2基因的表达丰度为4.6308±2.5956，王浆低产组五个蜂群蜜蜂中的Dop2基因的表达丰度为1.519±0.437，经生统T-test分析，蜜蜂Dop2基因在王浆高、低产组蜜蜂中的表达差异显著（P=0.024）。

SEQUENCE LISTING

序  列  表

<110>  福建农林大学

<120>  利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法

<130>  

<160>  2     

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

atctgttggc tacctttctt cg                                                22

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

aacgctctac gaaaatctct gc                                                      22

SEQUENCE LISTING

序  列  表

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atctgttggc tacctttctt cg                                                22

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

aacgctctac gaaaatctct gc                                                      22

 

 

 

 

Claims (6)

1.一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于鉴别方法如下： 

（1）蜜蜂取样：从被考察蜂群中，每群分别采集30只哺育蜂；所述哺育蜂指蜂群中哺育幼虫的工蜂，即6－12日龄的工蜂；

（2） 蜜蜂头部RNA提取及cDNA合成：提取所采集哺育蜂头部的RNA，反转录获得cDNA；

（3）引物设计：设计合成的引物序列如下：

Primer-F：5’- atctgttggctacctttcttcg-3’

Primer-R：5’- aacgctctacgaaaatctctgc-3’；

（4）荧光定量PCR检测：以稀释后的蜜蜂头部cDNA为模板， 以Primer-F和 Primer-R为引物，进行荧光定量PCR；选用蜜蜂头部的GAPDH为内参基因，采用2 ^-△△ct 方法计算蜜蜂Dop2基因的表达量；在每个蜂群样本的每次qRT-PCR反应中均重复多次，取多次重复的平均值为蜜蜂Dop2基因的最终表达量，最终表达量越高，则該蜂群的蜂王浆产量性能越好；所述2^-△△ct为蜜蜂Dop2基因的相对表达量，其中△△Ct = (Ct_target -Ct_GAPDH) _treatment - (Ct_target -Ct_GAPDH) _control。

2.根据权利要求1所述的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于所述荧光定量PCR的反应体系为：总体积为20ul，内含SYBR GreenⅠ 10ul，Rox 0.4ul，Primer-F 0.4ul，Primer-R 0.4ul，cDNA 2ul，DEPC水补足到20ul。

3.根据权利要求1所述的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于所述荧光定量PCR的反应条件如下：预变性 95℃，30s，PCR反应40 cycles，95℃，5s，61℃, 31s，溶解曲线 55℃，20s。

4.根据权利要求1所述的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于所述蜂头部RNA提取及cDNA合成，采用TRizol方法提取RNA，采用反转录试剂盒完成cDNA的合成。

5.根据权利要求1所述的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于所述稀释后的蜜蜂头部cDNA，即用DEPC水将蜜蜂头部cDNA稀释 6倍体积。

6.根据权利要求1所述的一种利用蜜蜂Dop2基因荧光定量PCR技术鉴别蜂王浆产量性能的方法，其特征在于所述在每个蜂群样本的每次qRT-PCR反应中均重复多次，其重复次数为3次。