CN103866032A - 一种检测山羊stat3基因单核苷酸多态性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法及应用，以包含STAT3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2或P3为引物，PCR扩增山羊STAT3基因；用限制性内切酶DdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204位、第62058位或第62230位的单核苷酸多态性。3个位点能够作为提高西农萨能奶山羊体高的分子标记，1个位点作为提高海南黑山羊管围的分子标记，1个作为提高海南黑山羊体长指数的标记，这些有利于中国地方山羊生长性状的标记辅助选择（MAS），有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。

Description

一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法及应用。 

背景技术

基因多态性（polymorphism）是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。在生物医学和动物生产实践中，基因多态性的检测及其应用具有重要意义。例如：研究人类某些重要功能基因多态性与疾病的易感性的关联，可阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性，为临床医学、遗传病学、预防医学的发展开拓了新的研究领域；研究动物某些基因多态并分析它们与生长发育、泌乳等生产性能的关系，将有利于标记辅助选择（MAS)技术为基础的分子育种。目前，基因多态性的主要形式是单核核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)。 

SNP是由美国麻省理工学院人类基因组研究中心学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而 形成胸腺嘧啶。 

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(Coding-region SNPs,cSNPs）、基因周边SNPs(Perigenic SNPs,pSNPs）和基因间SNPs（Intergenic SNPs,iSNPs）等三类。研究表明，位于编码区内的cSNPs比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。近年来，研究人员对基因内含子SNP及其功能的关注度逐渐升高。由于内含子属于非编码序列，曾一度被认为“它的存在没有意义”，但随着功能基因组研究的深入，越来越多的研究发现，内含子并不是基因组的“垃圾”，而是在基因表达调控中具有重要的生物学功能。近年来，若干研究发现，内含子突变能够引起某些基因功能的重大改变，从而在动物生产实践中具有重要应用和推广价值，其中最著名的例子是“猪IGF2基因内含子突变”。胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor2，IGF2)基因是欧洲科学家历时10年鉴定的一个影响家猪数量性状的呈印迹遗传的主效基因，位于该基因第3内含子3072位核苷酸的G/A替换，改变了顺式作用元件与阻抑蛋白的结合，提高了30%IGF2在肌肉中的表达量，从而增加了肌肉产量，降低了背部脂肪沉积。IGF2基因第3内含子的G3072A突变对生长肥育性状的重要影响，在专门化父系的选育中具有重大应用价值。 

此外，在原核生物基因中，不存在内含子或着含有少量的内含子，而在真核生物基因中内含子的存在是普遍现象，而且内含子的长度远远大于外显子的长度，甚至在人类基因组中非编码序列占到95％～97％。由此可见，随着生物进化程度越高，其内含子所含比例也越高，这也进一步说明内含子是具有生物学功能的。从生物进化角度讲，内含子也必定在生命活动中执行着某种功能。因此，目前关于内含子的研究会越来越多，关于内含子多态性及其应用功能正成为当前研究的热点。 

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。 

在这种情况下，PCR-RFLP就成为检测SNP的理想技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求。 

分子育种，即分子标记辅助育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方 法，进行新品种选育。在羊育种中，人们期望通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在实际育种中获得更大的遗传进展。 

为此，借助分子遗传标记辅助选择，即将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，将加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状之间的遗传分析；第二阶段是蛋白质（酶）标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。 

信号转导及转录活化因子(signal transducers and activators of transcription;STAT)是一类脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白，由750～850个氨基酸组成,分子量为84～113kDa(8.4×10⁴～11.3×10⁴u)。作为JAK(Janus Kinase)-STAT途径中JAKs的重要底物，STATs在细胞因子(cytokine;CK)的信号转导中起着关键性的作用。截止目前，发现STATs由STAT3和其他6种STATs蛋白组成（如：STAT1、STAT2、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6）。 

STAT3是在1994年作为白细胞介素-6信号传递中的急性期反应因子(acute-phaseresponse factor;APRF)被纯化的。STAT3广泛表达于不同类型的细胞和组织中,对STAT3缺陷小鼠的研究显示STAT3在早期胚胎发育和骨髓细胞的分化中发挥着不可或缺的重要作用。此外,STAT3还参与了细胞生长、分化、增生、恶性转化及凋亡抑制等生理功能的调控。组织特异性的基因敲除结果表明,STAT3对于上皮细胞的凋亡，哺乳后期乳腺的发育、皮肤重建、角质细胞迁移、巨噬细胞失活与Th细胞反应中的炎性因子下调等都具有重要的调 控作用。总之，STAT3在胚胎早期发育、细胞分化、哺乳后期乳腺的发育等方面具有很重要的作用，因此，研究中国地方羊STAT3基因的遗传变异和分子遗传特征具有重要的理论和实践意义。然而，目前对于STAT3基因的研究多集中在小鼠和人类上，并主要对其功能进行了大量研究。对中国地方山羊STAT3基因遗传变异领域的研究匮乏该基因位点的功能研究更是空白。 

发明内容

本发明解决的问题在于利用DdeI、RsaI和TaqI Forced-PCR-RFLP方法检测山羊STAT3基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，以包含STAT3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增山羊STAT3基因；用限制性内切酶DdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204位的单核苷酸多态性； 

以引物对P2为引物，用限制性内切酶RsaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058位的单核苷酸多态性； 

以引物对P3为引物，用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230位的单核苷酸多态性； 

所述的引物对P1为： 

上游引物：tgtgtgagtg tgtaggtttc agaat； 

下游引物：agataggtta ttaattaatc aactga； 

所述的引物对P2为 

上游引物：aaatccagcc tgagggagaa ttcct； 

下游引物：gagtctcttt gaaagtccac tttgta； 

所述的引物对P3为： 

上游引物：tgggaaagat acttgctg； 

下游引物：gacctgaatc acaggaggaa aagatc。 

所述的PCR扩增反应程序为： 

94.0℃，预变性5min；94.0℃，变性30s；50.8℃复性30s；72.0℃延伸60s，35个循环之后72.0℃延伸10min，4.0℃保存扩增产物。 

所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度3%琼脂糖凝胶电泳。 

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204nt的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为264bp和26bp两条条带;CT基因型表现为290bp、264bp和26bp三条条带;TT基因型表现为290bp一条条带； 

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058nt的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为222bp、97bp和25bp三条条带;AG基因型表现为222bp、122bp、97bp和25bp四条条带;AA基因型表现为222bp和122bp两条条带； 

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230nt的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为233bp、126bp和27bp三条条带；CT基因型表现为260bp、233bp、126bp和27bp四条条带；TT基因型表现为260bp和126bp两条条带。 

山羊STAT3基因的45204位的CC基因型、62058位的AA基因型、62230位的TT基因型作为西农萨能奶山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。 

所述的DNA标记是作为提高西农萨能奶山羊的体高的分子标记。 

山羊STAT3基因的45204位的CC和CT基因型、62058位的AA和GG基因型，作为海南黑山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。 

所述的45204位的CC和CT基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的管围的分子标记。 

所述的62058位的AA和GG基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的体长指数的分子标记。 

与现有技术比较，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明根据STAT3基因的序列设计引物，分别以2种山羊品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后获得山羊的STAT3基因的部分序列。 

针对STAT3基因第45204，62058及62230位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过特定引物经PCR扩增含特定限制性内切酶位点的片段再酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其单核苷酸的多态性。 

本发明对2个山羊品种的SNPs基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNPs位点与山羊部分生长性状（如体高、管围和体长指数）进行关联分析，结果表明，3个SNP位点能够作为提高西农萨能奶山羊体高的分子标记，1个位点可以作为提高海南黑山羊管围的分子标记，1个可以作为提高海南黑山羊体长指数的标记，这些有利于中国地方山羊生长性状的标记辅助选择（MAS），有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。 

附图说明

图1为山羊STAT3基因扩增包含第45204位多态位点的PCR产物电泳结果； 

图2为山羊STAT3基因第45204位SNP的测序图。带框的字母

表示该位点发生突变：AC_000176:g.45204C>T。 

图3为山羊STAT3基因包含第45204位的多态位点的290bp PCR产物的DdeI酶切电泳结果； 

图4为山羊STAT3基因扩增包含第62058位多态位点的PCR产物电泳结果； 

图5为山羊STAT3基因第62058位SNP的测序图。带框的字母

表示该位点发生突变：AC_000176:g.62058A>G。 

图6为山羊STAT3基因包含第62058位的多态位点的344bp PCR产物的RsaI酶切电泳结果； 

图7为山羊STAT3基因扩增包含第62230位多态位点的PCR产物电泳结果； 

图8为山羊STAT3基因第62230位SNP的测序图。带框的字母

表示该位点发生突变：AC_000176:g.62230C>T。 

图9为山羊STAT3基因包含第62230位的多态位点的386bp PCR产物的TaqI酶切电泳结果； 

图10为山羊STAT3基因第45204位SNP位点序列分析图。图中， 

分别对应表示上游和下游引物序列，                                                  

或   表示突变位点， CTNAG表示内切酶识别序列，G表示引入的突变碱基。Sequence1代表山羊STAT3基因第2内含子区域的AC_000176:g.45204C等位基因的序列；Sequence2代表山羊STAT3基因第2内含子区域的AC_000176:g.45204T等位基因的序列。 

图11为山羊STAT3基因第62058位SNP位点序列分析图。图中， 

分别对应表示上游和下游引物序列，   

或   

表示突变位点，GTAC表示内切酶识别序列，A表示引入的突变碱基。Sequence1代表山羊STAT3基因第10内含子区域的AC_000176:g.62058G等位基因的序列；Sequence2代表山羊STAT3基因第2内含子区域的AC_000176:g.62058A等位基因的序列。 

图12为山羊STAT3基因第62230位SNP位点序列分析图。图中， 

分别对应表示上游和下游引物序列，   或   

表示突变位点，TCGA表示内切酶识别序列，A表示引入的突变碱基。Sequence1代表山羊STAT3基因第11内含子区域的AC_000176:g.62230T等位基因的序列；Sequence2代表山羊STAT3基因第11内含子区域的AC_000176:g.62230C等位基因的序列。 

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对山羊STAT3基因第45204、62058及62230位点突变可能产生的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

以下实施例中所用的主要试剂来源： 

实验药品与试剂 

1.生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶（购自Fermantas即MBI公司）；②限制性内切酶DdeI、RsaI和TapI（购自TAKARA公司）；③蛋白酶K（购自华美生物工程公司）；④Marker I（购自天根生化科技（北京）有限公司）； 

2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠（SDS）、溴化乙锭（EB）、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。 

3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in（1.034×10⁵Pa），25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。 

1）样品采样所用溶液：抗凝剂ACD：柠檬酸0.48g；柠檬酸钠1.32g； 葡萄糖1.47g。把它们定容于100mL水中，高压灭菌。每6mL新鲜血液中加入1mL的ACD液。这一抗凝剂优于EDTA，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-70℃长期保存。 

2）血样基因组DNA分离所用溶液：①PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌。②10%SDS：10g SDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL。③0.5mol/L EDTA：EDTA186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。④1mol/L Tris·Cl：121.14g Tris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存。⑤5mol/L NaCl：NaCl292.2g溶于1000mL超纯水中。⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mol/L EDTA4mL，1mol/L Tris·Cl10mL，5mol/L NaCl4mL，10%SDS20mL定容至100mL。实际浓度为20mmol/L EDTA，pH8.0；100mmol/L Tris·HCl，pH8.0；200mmol/L NaCl，2%SDS。RNase20μg/mL。⑦NaAc缓冲液：NaAc·3H₂O20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL。⑧TE缓冲液：Tris·Cl缓冲液（pH8.0）10mmol/L，EDTA缓冲液（pH8.0）0.1mmol/L，高压灭菌，4℃保存。⑨蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存。 

3）提取组织样DNA所用溶液： 

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配置以下试剂：①2mol/LNaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。②组织DNA提取液（100mL）：l mol/L Tris-Cl（pH8.0）l mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，2mol/L NaCl5mL，定容至100mL。 

4）琼脂糖电泳分析所用溶液 

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE50mL定容至1000mL。②上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40.0%(w/v)蔗糖水溶液。 

以下实施例中具体操作： 

实施例1、山羊STAT3基因含第45204、62058及62230位PCR引物的设计 

由于牛与羊同为反刍动物，高度同源，且截止目前山羊基因组的序列没有发布，故只能在NCBI上检索牛STAT3基因的序列，并利用Primer5.0设计能够扩增包含山羊STAT3基因第2,10及11内含子区域SNP位点的PCR引物，其引物序列如下： 

P1：上游引物：5’-TGTGTGAGTGTGTAGGTTTCAGAAT-3’(25bp)， 

下游引物：5’-AGATAGGTTATTAATTAATCAACT

A-3’(26bp)； 

P2：上游引物：5’-AAATCCAGCCTGAGGGAGAATTCCT-3’(25bp)， 

下游引物：5’-GAGTCTCTTTGAAAGTCCACTTTG

A-3’(26bp)； 

P3：上游引物：5’-TGGGAAAGATACTTGCTG-3’(18bp)， 

下游引物：5’-GACCTGAATCACAGGAGGAAAAGA

C-3’(26bp) 

以上述引物对P1对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊STAT3基因（AC_000176序列）第2内含子区域第44941nt～45230nt的290bp的片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示，其中1～5泳道为检测片段,M为Marker I（大小分别为600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)。对扩增的片段进行测序鉴定后，发现45204位点有C>T的突变，测序峰图如图2所示。经过分析发现，当45204位的C>T时，就不能被DdeI内切酶所识别（DdeI识别的酶切位点是CTNAG,N代表A,T,C,G任意一种碱基）,G为设计引物时引入的突变碱基。所以，当C>T之后用DdeI酶切结果电泳检测之后是290bp大小，是没有被切开的长度，而当45204bp没有发生突变时，DdeI内切酶可以识别该序列并将其切开，电泳检测时有264bp+26bp（26bp在电泳图片上显示不出来）,酶切结果电泳检测结果如图3。所以可以通过酶切的方法对该位点SNP多态性进行检测。 

当用限制性内切酶DdeI对引物P1对应扩增的基因片段酶切消化时，由于扩增序列中只有一处DdeI识别位点，因此，只能够被切成2段片段。 

以上述引物对P2对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊STAT3基因（AC_000176序列）第10内含子区域第61741nt～62084nt的344bp的片段，扩增后片段的电泳检测如图4所示，其中1～7泳道为检测片段,M为Marker I（大小分别为600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)。 

对扩增的片段进行测序鉴定后，发现62058位点有A>G的突变，测序峰图如图5所示。经过分析发现，当62058位的A>G时，就不能被RsaI内切酶所识别（RsaI识别的酶切位点是GTAC）,为设计引物时引入的突变碱基。所以当62058位点未突变时用RsaI酶切结果电泳检测之后是222bp、97bp和25bp三条条带（25bp在电泳图片上显示不出来），是被RsaI切开的长度，而当A>G时，RsaI内切酶不能识别该序列，电泳检测时有222bp和122bp两条带，酶切结果电泳检测结果如图6。所以可以通过酶切的方法对该位点SNP多态性进行检测。 

当用限制性内切酶RsaI对引物P2对应扩增的基因片段酶切消化时，由于扩增序列中有两处RsaI识别位点（存在一处天然酶切位点），因此，能够被切成3段片段。 

以上述引物对P3山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊STAT3基因（AC_000176序列）第11内含子区域第61871bp～62256bp的386bp的片段，扩增后片段的电泳检测如图7所示，其中，泳道1～5为检测片段，泳道M为Marker I(大小分别为600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)。 

对扩增的片段进行测序鉴定后，发现62230位点有C>T的突变，测序峰图如图8所示。经过分析发现，当62058位的C>T时，就不能被TaqI内切酶所识别（TaqI识别的酶切位点是TCGA）,

为设计引物时引入的突变碱基。所以当62230位点未突变时用TaqI酶切结果电泳检测之后是233bp、 126bp和27bp三条条带，酶切结果如图9所示（27bp在电泳图片上显示不出来），是能被TaqI切开的长度，而当C>T时，TaqI内切酶不能识别该序列，电泳检测时有260bp和126bp两条带，所以可以通过酶切的方法对该位点SNP多态性进行检测。 

当用限制性内切酶TaqI对引物P3对应扩增的基因片段酶切消化时，由于扩增序列中有两处TaqI识别位点（存在一处天然酶切位点），因此，能够被切成3段片段。 

因此，结合图10～图12所示的序列分析、SEQ.ID.NO.1～3所示的山羊的STAT3基因片段中存在SNP多态性，并且能够运用引物扩增结合酶切进行SNP多态性的判断。 

实施例2、以引物P进行PCR扩增待测山羊的STAT3基因片段 

1、山羊样本的采集 

实验所用的动物为两个品种共计585个样本，其中 

1）海南黑山羊（HNBG）样品220份采自海南省詹州海南黑山羊育种场。采用随机采样方式采取海南省儋州市海南黑山羊育种场的个体耳组织样品，这些样品为70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。 

2）西农萨能奶山羊（XNSN)样品共365份，采自陕西省千阳县萨能奶山羊保种场。采用随机采样方式采取育种场个体的血样，利用ACD抗凝，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。 

表1山羊样本的采集 

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化 

1）冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min（4℃），弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色； 

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h； 

3）加3μL（20mg/mL）蛋白酶K至上述混合液中并混匀，55℃过夜孵育至澄清；尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀后继续消化直至澄清； 

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次； 

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中； 

6）加氯仿、异戊醇混合液（24：1）500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中； 

7）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min； 

8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次； 

9）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净； 

10）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。 

11）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋 白酶K至终浓度达到50μg/mL； 

12）55℃保温10h左右； 

13）等体积苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次； 

14）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中； 

15）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA； 

16）弃上清液，70%乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。 

3、组织样品DNA的提取与分离 

1）取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。 

2）加入600μL组织提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。 

3）将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。 

4）取上清液，加入等体积的酚：氯仿（1：1），盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。 

5）取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。 

6）取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状DNA。 

7）挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。 

8）再一次向离心管中加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水 纸上。 

9）待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。 

4、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 

1）将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。 

2）称取0.24g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TBE30mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB。然后快速将琼脂糖溶液导入，轻微摇动，防止出现气泡。 

3）混匀后（约60℃），立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。 

4）完全冷却凝固（约25～40min）后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。 

5）向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。 

6）取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样（注意枪头的顺序应前后对应），并将DNA Marker加在一边。 

7）80V电压电泳2h。 

8）在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。 

5、DNA的纯化 

1）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。 

2）55℃保温10h左右。 

3）等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次。 

4）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。 

5）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。 

6）倒掉液体，70%乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。 

6、分光光度法检测DNA 

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。 

DNA浓度（ng/μL）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数 

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。 

7、PCR扩增 

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix（包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×）6.25μL；上游引物0.25μL；下游引物0.25μL（上下游引物浓度为10pmol/μL，P1、P2、P3引物对分别进行扩增）；基因组DNA（浓度为100ng/μL山羊基因组DNA）1.0μL；去离子水4.75μL；共12.5μL体积的PCR扩增体系。 

8.PCR反应的程序 

PCR扩增反应程序为：94.0℃，预变性5min；94.0℃，变性30s；50.8℃复性30s；72.0℃延伸60s，35个循环之后72.0℃延伸10min，4.0℃保存。 

9.琼脂糖凝胶电泳检测 

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1）制作浓度为3.0%琼脂糖凝胶，120V电压电泳0.5～1h，EB染色；2）待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Bio-Rad凝胶成像系统成像；3）根据图像判断效果。 

实施例3、DdeI、RsaI和TaqI酶切消化PCR扩增的不同STAT3基因片段 

1、DdeI、RsaI和TaqI酶切反应消化体系 

DdeI、RsaI及TaqI酶切反应体系均为10μL体系，包括PCR产物4.0μL，内切酶0.2μL，10×缓冲液1.0μL，0.1%BSA1.0μL以及3.8μL的去离子水。 

2、酶切消化条件： 

DdeI，RsaI酶切条件是37℃过夜（12～16h），TaqI酶切条件是置于65℃恒温水浴锅过夜（12～16h）。 

实施例4、DdeI、RsaI和TaqI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析 

1）制作3%的琼脂糖凝胶，点样后110V电压电泳30-60min，电泳结束后EB染色； 

2）待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统成像； 

3）根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性； 

用BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性： 

由于山羊为2倍体，所以山羊基因组的STAT3基因的第45204位点的SNP的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：CC基因型表现为264bp和26bp两条条带，CT基因型表现为290bp、264bp和26bp三条条带，TT基因型表现为290bp，由于26bp太小所以没有在图中显示出来。 

第62058位点的SNP的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为222bp和122bp两条条带，AG基因型表现为222bp，122bp、97bp和25bp四条条带，由于25bp太小所以没有在图中显示出来。 

第62230位的SNP的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：CC基因型表现为233bp、126bp和27bp三条条带；CT基因型表现为260bp、233bp、126bp和27bp四条条带；TT基因型表现为126bp和260bp两条条带，由于27bp太小所以没有在图中显示出来。 

实施例4、山羊STAT3基因SNP位点的频率统计分析 

1）基因和基因型频率 

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_TT＝N_TT/N，其中P_TT代表某一位点的TT基因型频率；N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。 

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_T=（2N_TT＋N_Ta1＋N_Ta2＋N_Ta3＋N_Ta4＋……＋N_Tan）/2N 

式中，P_T表示等位基因T频率，N_TT表示群体中具有TT基因型的个体数量，N_Tai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1－an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。 

在不同山羊品种STAT3基因3个SNPs位点中的等位基因型频率及等位基因频率如表2所示。根据SNP的定义，在二等位基因的SNP类型中，等位基因频率要大于1.0%。为此，不同山羊品种STAT3基因3个SNPs位点中，等位基因频率均在5.0%以上，符合SNP的标准，属于SNP位点。 

表2山羊STAT3基因第45204、62058及62230位SNP基因频率分布表 

实施例5、山羊STAT3基因SNP位点基因效应的关联分析 

基因型数据：DdeI、RsaI和TaqI分别识别的基因型 

生产数据：西农萨能奶山羊及海南黑山羊体长、胸围、体躯指数、体长指数等数据 

关联分析模型：利用SPSS(20.0)软件来分析品种，环境与基因位点等等因素与生长形状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到年龄，环境的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y=u+E+Age+G+I+X，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；E：环境效应；Age：年龄效应；G：标记基因型效应；I：相关的互作效应；X：随机误差。 

结果表明：山羊STAT3基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对山羊某些生产性状（如体高，体长，胸围等）的影响均有显著差异。 

由表3可以看出，在对365只西农萨能奶山羊群体的关联研究中，3个SNP位点对西农萨能奶山羊的体高均有显著影响（P<0.05）,其中45204位点（SNP1-DdeI位点）CC基因型个体性状优于CT基因型个体（P=0.05)；62058位点（SNP2-RsaI位点）AA基因型个体性状优于GG基因型个体(P=0.04)； 62230位点（SNP3-TaqI位点）TT基因型个体性状优于CT和CC基因型个体(P=0.01)； 

在海南黑山羊群体中，45204和62058位点分别对海南黑山羊的管围和体长指数有显著影响，其中45204位点（SNP1-DdeI位点）CC和CT基因型个体管围性状优于TT基因型个体；62058位点（SNP2-RsaI位点）AA和GG基因型个体体长指数性状优于AG基因型个体。 

得到的这些结论可以作为西农萨能奶山羊和海南黑山羊生长发育的遗传标记。 

表3STAT3基因DdeI、RsaI及TaqI位点对西农萨能奶山羊生长性状的影响 

注：生产性状不同的上标(a,b)表示有显著性不同。 

Claims (9)

1.一种检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含STAT3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增山羊STAT3基因；用限制性内切酶DdeI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204位的单核苷酸多态性；

以引物对P2为引物，用限制性内切酶RsaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058位的单核苷酸多态性；

以引物对P3为引物，用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P1为：

上游引物：tgtgtgagtg tgtaggtttc agaat；

下游引物：agataggtta ttaattaatc aactga；

所述的引物对P2为

上游引物：aaatccagcc tgagggagaa ttcct；

下游引物：gagtctcttt gaaagtccac tttgta；

所述的引物对P3为：

上游引物：tgggaaagat acttgctg；

下游引物：gacctgaatc acaggaggaa aagatc。

2.如权利要求1所述的检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

94.0℃，预变性5min；94.0℃，变性30s；50.8℃复性30s；72.0℃延伸60s，35个循环之后72.0℃延伸10min，4.0℃保存扩增产物。

3.如权利要求1所述的检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度3%琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的检测山羊STAT3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第45204nt的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为264bp和26bp两条条带;CT基因型表现为290bp、264bp和26bp三条条带;TT基因型表现为290bp一条条带；

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62058nt的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为222bp、97bp和25bp三条条带;AG基因型表现为222bp、122bp、97bp和25bp四条条带;AA基因型表现为222bp和122bp两条条带；

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊STAT3基因第62230nt的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为233bp、126bp和27bp三条条带；CT基因型表现为260bp、233bp、126bp和27bp四条条带；TT基因型表现为260bp和126bp两条条带。

5.山羊STAT3基因的45204位的CC基因型、62058位的AA基因型、62230位的TT基因型，作为西农萨能奶山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的DNA标记是作为提高西农萨能奶山羊的体高的分子标记。

7.山羊STAT3基因的45204位的CC和CT基因型、62058位的AA和GG基因型，作为海南黑山羊的DNA标记在辅助选择育种中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的45204位的CC和CT基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的管围的分子标记。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的62058位的AA和GG基因型DNA标记是作为提高海南黑山羊的体长指数的分子标记。

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