CN104878099A - 山羊atbf1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用：该方法是以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增山羊ATBF1基因，并用限制性内切酶MspI或HpaII消化PCR产物，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定山羊ATBF1基因第25748nt或163517nt的基因型；ATBF1基因第25748nt和163517ntSNPs的不同基因型与山羊生长发育性状之间存在显著相关，故将有利于快速建立优良的山羊遗传资源群体。

Description

山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于动物分子育种领域，涉及重要功能基因单核苷酸多态性(SNP)的检测方法及其应用，特别涉及山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法及其在育种中的应用。
背景技术
动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)育种技术首先检测重要基因的DNA多态性，然后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，MAS育种技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体的遗传组成，该方法通过有性杂交将目的基因转移到需要改良的亲本中，将目标基因型的鉴定与传统育种相结合，从而实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性。该方法在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。
在MAS育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是分子标记辅助选择(MAS)技术应用的前提和关键。作为第三代分子遗传标记，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是一种新型分子标记。SNP是指DNA序列上单个核苷酸(A/T/C/G)的变异而引起DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异，这种变异包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2:1。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。在人类基因组中，每隔100至300个碱基就会存在一处SNP位点。每3个SNP位点中有2个会是C和T的相互转变。人类遗传基因的各种差异，90％可归因于SNP引起的基因变异。由于同一位点的不同等位基因之间经常只有一个或几个核苷酸的差异，利用SNP分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从DNA水平上对单个核苷酸的差异进行SNP检测在动物分子育种的MAS体系中具有重要意义。
目前，SNP根据其在基因组中的位置，可以分为基因编码区SNPs(Coding-region SNPs，cSNPs)、基因周边区SNPs(Perigenic SNPs,pSNPs)和基因间隔区SNPs(Intergenic SNPs，iSNPs)。由于密码子的简并性，处于编码序列的SNP不一定会改变蛋白质的氨基酸序列。所以，编码区的SNP有两种类型：同义突变和错义突变。同义突变并不影响蛋白质序列，但有研究显示同义突变会影响目的蛋白质的翻译效率，进而对基因功能产生重要影响；错义突变则会改变蛋白质的氨基酸序列，最终影响到蛋白质的功能。不在蛋白质编码区的SNP仍可能影响转录子的结合、基因剪接、信使RNA降解或非编码区的RNA序列，所以，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。因此，SNP在遗传病和育种的研究中具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。
迄今为止，检测SNPs的技术非常多，包括限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)、单构链多态性PCR(PCR-SSCP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、直接测序法、新型高通量SNP检测技术和引入突变位点的-PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等。在这些技术中，PCR-RFLP法是最早应用于分子人类学的SNP检测技术，因为该技术简单且易操作，对于检测单拷贝上(线粒体和Y染色体)的SNP，准确度非常高，但由于PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位点的限制，故在实际应用中也有一定的局限性；PCR-SSCP技术简便、快速、灵敏，但最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序，且电泳条件要求较严格，故多用于DNA研究中的未知基因突变的检测和临床实验；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，简单且花费较小，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是该方法需要设计特别的引物，两个反应才能得到一个SNP位点的分型，且只能针对特定的基因位点，同时由于两个等位基因特异性引物只有末端碱基不同，有时候可能会出现错误的扩增，从而产生误检；直接测序法是最为准确的SNP检测方法，但其检测费用极其昂贵，且需要有测序仪等大型仪器，还需要非常熟练的技术人员和经验，故对于在一段很短的序列上存在多个SNP的检测是有优势的，但不适用于生产实际；新型高通量SNP检测技术，如SNP芯片、GWAS和第二代测序等对于样本量较小的实验研究，成本过高，在生产实际中应用较为局限；Forced-PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，与通常的PCR-RFLP分析原理相同，即在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，进而鉴别SNP位点，同时Forced-PCR-RFLP可以通过设计错配引物，进行定点突变，从而产生新的酶切位点，克服了通常的PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位点的限制。总之，由于PCR-RFLP技术和Forced-PCR-RFLP方法的联合，不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求，因此，PCR-RFLP和Forced-PCR-RFLP方法在育种工作中的受到青睐，在动物分子育种的MAS体系中具有广阔应用前景。
我国是传统的养羊大国，也是目前世界上羊存栏数最多的国家。随着经济发展和人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，但由于近年来羊肉、羊奶等羊产品严重短缺，所以山羊育种专家期望尽快培育出山羊产品的优良品种。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，山羊育种专家一直关注生长发育性状，但仅靠传统育种手段是不行的，还需要依靠分子育种技术。即首先在DNA水平上筛查和检测与山羊生长发育性状密切相关的DNA标记，然后进行基因多态性的检测，最后是进行基因多态性与生长发育性状的关联分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。
AT模体结合因子1(AT motif-binding factor，ATBF1)起初是作为与人类K-甲胎蛋白(AFP)基因的增强子中AT富含元件结合的蛋白被分离的，可与甲胎蛋白基因的增强子中AT富含元件结合，抑制AFP基因的转录，是目前发现的分子量最大的反式作用因子。人ATBF1基因定位于染色体16q22.3-q23.1，通过选择性剪接产生ATBF1-A和ATBF1-B两种转录本。其中，ATBF1-A是ATBF1基因全长的mRNA转录本所表达的蛋白质，也是ATBF1基因存在的主要形式，编码404kD蛋白，3703个氨基酸，氨基酸序列中有4个同源结构域和23个锌指结构，在这23个锌指结构中包括1个假锌指结构模序；ATBF1-B是由于在转录过程中，mRNA的剪接加工，使第1外显子和第4外显子连接所表达的蛋白质，与ATBF1-A相比，在N端缺少920个氨基酸和5个锌指结构。
ATBF1不同的异构体具有不同的调节作用。ATBF1-A能抑制AFP基因的增强子，可诱导细胞分化和凋亡；而ATBF1-B则能激活AFP的启动子和增强子，促进AFP的表达。目前，ATBF1作为一个新的抑癌基因而被广泛关注，主要集中在ATBF1异构体的选择性表达及其调控机制上。有研究表明，ATBF1在成体器官中都有表达，ATBF1的异常表达与很多人类的慢性疾病有关。而且，ATBF1用于修复组织和保护细胞氧化应激。已有研究表明，ATBF1可与PIAS3相互作用抑制STAT3介导的信号转导，而STAT3在胚胎早期发育、细胞分化、后哺乳期乳腺的发育等方面具有很重要的作用。Cha-Gyun Jung等(2005)揭示了ATBF1可使细胞周期停滞，诱导神经细胞分化。Yingchuan Qi等(2007)揭示，垂体特异性转录因子1(PIT-1)的早期激活需ATBF1的参与，ATBF1是一种新的垂体调节因子。众所周知，PIT-1基因在动物生长发育中发挥重要的调节作用，能调控生长激素(GH)和催乳素(PRL)基因的表达，对动物泌乳和生长发育具有显著遗传效应。由此可见，ATBF1对形成胚胎、调控生长激素和催乳素等具有重要的作用，故研究中国地方羊ATBF1基因的遗传变异和分子遗传特征具有重要的理论和实践意义。
目前，对ATBF1基因的研究主要集中在与癌症相关方面的研究上，对中国地方山羊ATBF1基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究更是空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用，从而加快良种选育速度。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
以包含ATBF1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增山羊ATBF1基因，用限制性内切酶MspI酶切扩增产物，然后对酶切后的扩增产物片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性；所述引物对P1为：
上游引物：5’GCAAGAAGTGGGTGATCCAGACTGTTTCCC 3’(如SEQ.ID.NO.1所示)
下游引物：5’TCGCACCATCAAAGACAAC 3’(如SEQ.ID.NO.2所示)
或者，
以包含ATBF1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P2为引物，通过PCR扩增山羊ATBF1基因，用限制性内切酶HpaII酶切扩增产物，然后对酶切后的扩增产物片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性；所述引物对P2为：
上游引物：5’GACTCTTACCCAGCACGTACCCT 3’(如SEQ.ID.NO.3所示)
下游引物：5’TAACAGAAACCCACCATCCACAA 3’(如SEQ.ID.NO.4所示)
。
鉴定山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性时，所述PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min；55℃复性0.5min；72℃延伸0.5min；35个循环之后，72℃延伸10min；
鉴定山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性时，所述PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min；55.9℃复性0.5min；72℃延伸1.5min；35个循环之后，72℃延伸10min。
鉴定山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性时，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度3.5％的琼脂糖凝胶；鉴定山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性时，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度1.5％的琼脂糖凝胶。
所述山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为365bp一条带纹；AG基因型表现为365bp、336bp以及29bp三条带纹；GG基因型表现为336bp以及29bp两条带纹；
所述山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为1064bp、203bp、135bp以及70bp四条带纹；AG基因型表现为1064bp、898bp、203bp、166bp、135bp以及70bp六条带纹；GG基因型表现为898bp、203bp、166bp、135bp以及70bp五条带纹。
山羊ATBF1基因的25748位的AG基因型或163517位的GG基因型作为海南黑山羊的DNA标记在分子标记辅助选择育种中的应用。
所述山羊ATBF1基因的25748位的AG基因型是作为提高海南黑山羊的髋骨指数的分子标记。
所述山羊ATBF1基因的163517位的GG基因型是作为提高海南黑山羊管围或管围指数中任意一个或两个生长性状的分子标记。
山羊ATBF1基因的25748位的GG基因型或AG基因型或山羊ATBF1基因的163517位的AA基因型或AG基因型作为西农萨能奶山羊的DNA标记在分子标记辅助选择育种中的应用。
所述山羊ATBF1基因的25748位的GG基因型是作为提高西农萨能奶山羊体长、胸围、胸围指数或体长指数中任意一个或多个生长性状的分子标记。
所述山羊ATBF1基因的25748位的AG基因型是作为提高西农萨能奶山羊体长指数的分子标记。
所述山羊ATBF1基因的163517位的AA基因型或AG基因型是作为提高西农萨能奶山羊体躯指数的分子标记。
与现有技术比较，本发明具有以下有益的技术效果：
针对ATBF1基因第25748nt和163517nt的SNPs多态性，本发明公开了其筛查和检测方法，通过特定引物经PCR扩增含特定限制性内切酶位点的片段，再酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。
本发明对2个山羊品种的SNPs基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNPs位点与山羊一些生长性状(体长、胸围、管围、体躯指数、体长指数、胸围指数、管围指数和髋骨指数)进行关联分析，结果表明，1个SNP位点可以作为提高海南黑山羊管围和管围指数的分子标记，1个SNP位点可以作为提高海南黑山羊髋骨指数的分子标记，1个SNP位点能够作为提高西农萨能奶山羊体长、胸围、体长指数、胸围指数的分子标记，1个SNP位点能够作为提高西农萨能奶山羊体躯指数的分子标记。所有这些，有利于中国地方山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)，有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。
附图说明
图1为山羊ATBF1基因扩增包含第25748nt SNP位点的PCR产物电泳结果；
图2为山羊ATBF1基因第25748nt SNP测序图，带框的字母表示该位点发生突变：NC_019471:g.25748G>A；
图3为山羊ATBF1基因包含第25748nt多态位点的365bp PCR产物的MspI酶切电泳结果：AA基因型表现为365bp一条带纹，AG基因型表现为365bp+336bp+29bp三条带纹；GG基因型表现为336bp+29bp两条带纹；
图4为山羊ATBF1基因扩增包含第163517nt多态位点的PCR产物电泳结果；
图5为山羊ATBF1基因第163517nt SNP测序图，带框的字母表示该位点发生突变：NC_019471:g.163517A>G；
图6为山羊ATBF1基因包含第163517nt多态位点的1472bpPCR产物的HpaII酶切电泳结果：AA基因型表现为1064bp+203bp+135bp+70bp四条带纹；AG基因型表现为1064bp+898bp+203bp+166bp+135bp+70bp六条带纹；GG基因型表现为898bp+203bp+166bp+135bp+70bp五条带纹；
图7为山羊ATBF1基因第25748nt SNP位点序列分析图，图中，分别对应表示上游和下游引物序列，或表示突变位点，CCGG表示内切酶识别序列，C表示引入的突变碱基。Sequence1代表山羊ATBF1基因第2外显子区域的NC_019471:g.25748A等位基因的序列；Sequence 2代表山羊ATBF1基因第2外显子区域的NC_019471:g.25748G等位基因的序列；
图8为山羊ATBF1基因第163517位SNP位点序列分析图。图中，分别对应表示上游和下游引物序列，或表示突变位点，CCGG表示内切酶识别序列，Sequence 1代表山羊ATBF1基因第8内含子区域的NC_019471:g.163517A等位基因的序列；Sequence 2代表山羊ATBF1基因第8内含子区域的NC_019471:g.163517G等位基因的序列。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明利用PCR-RFLP和Forced-PCR-RFLP方法对山羊ATBF基因第25748nt和163517nt点突变可能产生的单核苷酸多态性进行检测，并将其SNPs与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记。
实施例中所用的主要试剂及其来源
1.生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②限制性内切酶Tap I(购自TAKARA公司)；③蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；④Marker I，Marker D2000(购自天根生化科技(北京)有限公司)；
2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。具体试剂如下：
(1)样品采样所用溶液：抗凝剂ACD；(2)血样基因组DNA分离所用溶液：①PBS缓冲液②10％SDS③0.5mol/L EDTA④1mol/LTris·Cl⑤5mol/L NaCl⑥DNA抽提缓冲液⑦NaAc缓冲液⑧TE缓冲液⑨蛋白酶K。(3)提取组织样DNA所用溶液：①2mol/L NaCl②组织DNA提取液(100mL)；(4)琼脂糖电泳分析所用溶液：①0.5×TBE缓冲液②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。
具体操作：
(一)山羊ATBF1基因含第25748nt和163517nt的PCR引物设计
由于目前山羊基因组的该基因序列并没有很好地被注释，且山羊与绵羊高度同源，故利用在NCBI上检索到的绵羊ATBF1基因的序列，并利用Primer 5.0设计能够扩增包含山羊ATBF1基因部分第2外显子和部分第6内含子、第7外显子、第7内含子、第8外显子、部分第8内含子区域SNP位点的PCR引物，其引物序列如下：
引物对P1的序列为：
上游引物5’GCAAGAAGTGGGTGATCCAGACTGTTTCC3’
下游引物：5’TCGCACCATCAAAGACAAC 3’
引物对P2的序列为：
上游引物：5’GACTCTTACCCAGCACGTACCCT 3’
下游引物：5’TAACAGAAACCCACCATCCACAA 3’
参见图7，以上述引物对P1对山羊基因组扩增(为设计引物时引入的突变碱基)，能够扩增包含山羊ATBF1基因(NC_019471:g.25748序列)第2外显子区域第25718nt～26082nt的365bp的片段(参见图1)。理论上，当25748位的G>A时(参见图2)，就不能被Msp I内切酶所识别(Msp I识别的酶切位点是CCGG)。所以，当G>A之后用Msp I酶切结果电泳检测之后是365bp大小的带纹，是没有被切开的长度；当25748nt没有发生突变时，Msp I内切酶可以识别该序列并将其切开，电泳检测时有336bp+29bp大小的带纹(29bp在电泳图片上显示不出来)。为此，根据理论分析结果，AA基因型表现为365bp一条带纹；AG基因型表现为365bp+336bp+29bp三条带纹；GG基因型表现为336bp+29bp两条带纹；
参见图8，以上述引物对P2对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊ATBF1基因(NC_019471:g.163517序列)第8内含子区域第162942nt～164413nt的1472bp的片段(参见图4)。根据理论结果分析，当163517位的A>G时(参见图5)，HpaII内切酶可以识别该序列并将其切开(HpaII识别的酶切位点是CCGG)，电泳检测时有898bp+203bp+166bp+135bp+70bp大小的带纹(70bp在电泳图片上显示不出来)；当163517位没有发生突变时，HpaII内切酶不能识别该序列，电泳检测时有1064bp+203bp+135bp+70bp大小的带纹。因此，从理论上来说，AA基因型表现为1064bp+203bp+135bp+70bp四条带纹；AG基因型表现为1064bp+898bp+203bp+166bp+135bp+70bp六条带纹；GG基因型表现为898bp+203bp+166bp+135bp+70bp五条带纹。
(二)PCR扩增待测山羊的ATBF1基因片段
1、山羊样本的采集
实验所用的动物为两个品种共计707个样本(见表1)，其中：
1)海南黑山羊(HNBG)样品284份，采自海南省詹州海南黑山羊育种场。采用随机采样方式采取海南省儋州市海南黑山羊育种场的个体耳组织样品，这些样品为70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。
2)西农萨能奶山羊(XNSN)样品共423份，采自陕西省三原县奶山羊育种场。采用随机采样方式采取育种场个体的血样，利用ACD抗凝，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。
表1山羊样本的采集
2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。
3、组织样品DNA的提取与分离
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。
4、琼脂糖凝胶电泳检测DNA
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。
5、DNA的纯化
参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。
6、分光光度法检测DNA
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度(ng)＝50×OD260值×稀释倍数
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
7、PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×)6.25μL；上游引物0.25μL；下游引物0.25μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA(浓度为100ng/μL山羊基因组DNA)1.0μL；去离子水4.75μL；一共12.5μL体积的PCR扩增体系。
8、PCR反应程序：
94℃，预变性5min；94℃，变性0.5min；55℃(引物对P1)或55.9℃(引物对P2)复性0.5min；72℃延伸0.5min(引物对P1)或1.5min(引物对P2)，35个循环之后72.0℃延伸10min，4.0℃保存。
9、PCR琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作1.5％琼脂糖凝胶，120V电压电泳0.5h，EB染色。2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Bio-Rad凝胶成像系统成像。3)根据图像判断效果。
(三)MspI或HpaII酶切消化PCR扩增的不同ATBF1基因片段
酶切反应体系为16μL体系，其中PCR产物8.0μL，内切酶0.3μL，10×缓冲液1.6μL(包含0.1％BSA)，及6.1μL的去离子水。然后，将以上酶切产物置于37℃过夜(12～16h)。
(四)Msp I或HpaII消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析
1)制作3.5％(引物对P1)和1.5％(引物对P2)的琼脂糖凝胶，点样后120V电压分别电泳1.5h(引物对P1)和0.5h(引物对P2)，电泳结束后EB染色；
2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统成像；
3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；
用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性：
由于山羊为二倍体，所以山羊基因组的ATBF1基因的第25748位点的SNP的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为365bp；AG基因型表现为365bp、336bp和29bp；GG基因型表现为336bp和29bp。由于29bp太小所以没有在图中显示出来(如图3)。
第163517位点的SNP的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为1064bp、203bp、135bp和70bp；AG基因型表现为1064bp、898bp、203bp、166bp、135bp和70bp；GG基因型表现为898bp、166bp、135bp和70bp。由于70bp太小所以没有在图中显示出来(如图6)。
(五)山羊ATBF1基因SNP位点的频率统计分析
1)基因和基因型频率
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PTT＝NTT/N，其中PTT代表某一位点的TT基因型频率；NTT表示群体中具有TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量(注：T指代任何碱基)。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PT＝(2NTT+NTa1+NTa2+NTa3+NTa4+……+NTan)/2N
式中，PT表示等位基因T频率，NTT表示群体中具有TT基因型的个体数量，NTai表示群体中具有Tai基因型个体数量，a1－an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。
在不同山羊品种ATBF1基因2个SNPs位点中的等位基因型频率及等位基因频率如表1所示。根据SNP的定义，在二等位基因的SNP类型中，等位基因频率要大于1.0％。表2中不同山羊品种ATBF1基因2个SNPs位点中，等位基因频率均在40％以上，符合SNP的标准，属于SNP位点。
表2山羊ATBF1基因第25748和163517位SNP基因频率分布表
(六)山羊ATBF1基因SNP位点基因效应的关联分析
基因型数据：MSP1和HpaII分别识别的基因型
生产数据：西农萨能奶山羊及海南黑山羊体长、胸围、体躯指数、体长指数等数据
关联分析模型：利用SPSS(20.0)软件来分析品种，环境与基因位点等等因素与生长形状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响体重、体尺生长发育的指标的因素的不同，考虑到年龄，环境的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：Y＝u+E+Age+G+I+X，其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；E：环境效应；Age：年龄效应；G：标记基因型效应；I：相关的互作效应；X：随机误差。
结果表明：山羊ATBF1基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对山羊某些生产性状(体长、胸围、管围、体躯指数、体长指数、胸围指数、管围指数和髋骨指数)的影响均有所差异。
由表3可以看出：25748位点(SNP1-MSPI)在海南黑山羊群体中对髋骨指数有显著影响(P<0.05)，AG基因型个体性状优于GG基因型个体；在西农萨能奶山羊群体中对体长、胸围、体长指数和胸围指数有显著影响(P<0.05)，其中GG基因型个体体长、胸围、胸围指数性状优于AA基因型个体；AG和GG基因型个体体长指数性状优于AA基因型个体。为此，在MAS中，可以根据不同性状选择最优基因型。
表3 ATBF1基因MSPI位点对海南黑山羊和西农萨能奶山羊生长性状的影响
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)，且肩上标有a字母的个体优于标有b字母的个体。
由表4可以看出：163517位点(SNP2-HpaII)在海南黑山羊群体中对管围和管围指数有显著影响(P<0.05)，GG基因型个体性状优于AG基因型个体；在西农萨能奶山羊群体中对体躯指数有显著影响(P<0.05)，AA和AG基因型个体性状优于GG基因型个体。为此，在MAS中，可以根据不同性状选择最优基因型。
表4 ATBF1基因MSPI位点对海南黑山羊和西农萨能奶山羊生长性状的影响
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)，且肩上标有a字母的个体优于标有b字母的个体。

Claims (10)

1.一种山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增山羊ATBF1基因，用限制性内切酶MspI酶切扩增产物，对酶切后的扩增产物片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性；所述引物对P1为：
上游引物：5’GCAAGAAGTGGGTGATCCAGACTGTTTCCC 3’
下游引物：5’TCGCACCATCAAAGACAAC 3’
或者，
以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P2为引物，通过PCR扩增山羊ATBF1基因，用限制性内切酶HpaII酶切扩增产物，然后对酶切后的扩增产物片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性；所述引物对P2为：
上游引物：5’GACTCTTACCCAGCACGTACCCT 3’
下游引物：5’TAACAGAAACCCACCATCCACAA 3’
。
2.根据权利要求1所述一种山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：鉴定山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性时，所述PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min；55℃复性0.5min；72℃延伸0.5min；35个循环之后，72℃延伸10min；
鉴定山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性时，所述PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min；55.9℃复性0.5min；72℃延伸1.5min；35个循环之后，72℃延伸10min；
鉴定山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性时，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度3.5％的琼脂糖凝胶；鉴定山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性时，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度1.5％的琼脂糖凝胶。
3.根据权利要求1所述一种山羊ATBF1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述山羊ATBF1基因第25748位的单核苷酸多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为365bp一条带纹；AG基因型表现为365bp、336bp以及29bp三条带纹；GG基因型表现为336bp以及29bp两条带纹；
所述山羊ATBF1基因第163517位的单核苷酸多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：AA基因型表现为1064bp、203bp、135bp以及70bp四条带纹；AG基因型表现为1064bp、898bp、203bp、166bp、135bp以及70bp六条带纹；GG基因型表现为898bp、203bp、166bp、135bp以及70bp五条带纹。
4.山羊ATBF1基因的25748位的AG基因型或163517位的GG基因型作为海南黑山羊的DNA标记在分子标记辅助选择育种中的应用。
5.根据权利4所述的应用，其特征在于：所述山羊ATBF1基因的25748位的AG基因型是作为提高海南黑山羊的髋骨指数的分子标记。
6.根据权利4所述的应用，其特征在于：所述山羊ATBF1基因的163517位的GG基因型是作为提高海南黑山羊管围或管围指数中任意一个或两个生长性状的分子标记。
7.山羊ATBF1基因的25748位的GG基因型或AG基因型或山羊ATBF1基因的163517位的AA基因型或AG基因型作为西农萨能奶山羊的DNA标记在分子标记辅助选择育种中的应用。
8.根据权利7所述的应用，其特征在于：所述山羊ATBF1基因的25748位的GG基因型是作为提高西农萨能奶山羊体长、胸围、胸围指数或体长指数中任意一个或多个生长性状的分子标记。
9.根据权利7所述的应用，其特征在于：所述山羊ATBF1基因的25748位的AG基因型是作为提高西农萨能奶山羊体长指数的分子标记。
10.根据权利7所述的应用，其特征在于：所述山羊ATBF1基因的163517位的AA基因型或AG基因型是作为提高西农萨能奶山羊体躯指数的分子标记。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106854676A (zh) * 2016-12-27 2017-06-16 江苏大学 一种基于酶切检测snp的方法
CN108192985A (zh) * 2018-03-07 2018-06-22 西北农林科技大学 一种山羊ctnnb1基因插入/缺失的检测方法及其应用
CN108441566A (zh) * 2018-04-04 2018-08-24 西北农林科技大学 一种山羊atbf1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN110172516A (zh) * 2019-03-21 2019-08-27 西北农林科技大学 检测黄牛lncFAM200B基因5’侧翼区单核苷酸多态性的方法及其应用
CN110607373A (zh) * 2019-09-17 2019-12-24 西北农林科技大学 一种山羊dnah1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN111118178A (zh) * 2020-02-18 2020-05-08 天津奥群牧业有限公司 绵羊ghr基因插入/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130324427A1 (en) * 2006-04-27 2013-12-05 Biosystemix Ltd. Assessment and reduction of risk of graft-versus-host disease
CN103866032A (zh) * 2014-03-28 2014-06-18 西北农林科技大学 一种检测山羊stat3基因单核苷酸多态性的方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130324427A1 (en) * 2006-04-27 2013-12-05 Biosystemix Ltd. Assessment and reduction of risk of graft-versus-host disease
CN103866032A (zh) * 2014-03-28 2014-06-18 西北农林科技大学 一种检测山羊stat3基因单核苷酸多态性的方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
钟林等: "ATBF1 研究综述", 《现代生物医学进展》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106854676A (zh) * 2016-12-27 2017-06-16 江苏大学 一种基于酶切检测snp的方法
CN108192985A (zh) * 2018-03-07 2018-06-22 西北农林科技大学 一种山羊ctnnb1基因插入/缺失的检测方法及其应用
CN108192985B (zh) * 2018-03-07 2020-02-21 西北农林科技大学 一种山羊ctnnb1基因插入/缺失的检测方法及其应用
CN108441566A (zh) * 2018-04-04 2018-08-24 西北农林科技大学 一种山羊atbf1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN108441566B (zh) * 2018-04-04 2021-06-29 西北农林科技大学 一种山羊atbf1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN110172516A (zh) * 2019-03-21 2019-08-27 西北农林科技大学 检测黄牛lncFAM200B基因5’侧翼区单核苷酸多态性的方法及其应用
CN110172516B (zh) * 2019-03-21 2022-05-17 西北农林科技大学 检测黄牛lncFAM200B基因5’侧翼区单核苷酸多态性的方法及其应用
CN110607373A (zh) * 2019-09-17 2019-12-24 西北农林科技大学 一种山羊dnah1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN111118178A (zh) * 2020-02-18 2020-05-08 天津奥群牧业有限公司 绵羊ghr基因插入/缺失多态性的检测引物对、试剂盒、方法和应用

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