CN109825598B - 一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的snp标记、分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物遗传育种和SNP标记及应用领域，具体涉及一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记、分子标记及应用。该分子标记核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第111位碱基处存在一个A/G的等位基因突变，且当SEQ ID NO:1上的第111位核苷酸为G时，澳洲白绵羊的毛发较粗。本发明还公开了与澳洲白绵羊毛发粗细相关的分子标记的制备方法及其关联分析方法的应用。本发明为澳洲白绵羊粗毛性状的分子标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记，本发明的SNP分子标记可用于澳洲白绵羊新品系选育及利用澳洲白绵羊培育新品种过程中的选配及早期选择，可提高选择准确性，加快选育及纯化进展。

Description

一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记、分子标记 及应用

技术领域

本发明属于基因工程及分子生物学领域，涉及动物遗传育种和SNP标记及应用，特别是一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记、分子标记及应用。

背景技术

澳洲白绵羊是澳大利亚澳洲白绵羊育种者协会集成了白头杜泊绵羊，万瑞绵羊，无角陶赛特羊和特克塞尔羊的品种优良基因，采取特定比例的基因组合培育而成的粗毛型专门化肉羊品种。该品种2009年10月在澳大利亚正式注册，2011年3月上市。2011年5月，澳洲白绵羊由天津奥群牧业有限公司从澳大利亚HVD育种公司引进。针对引种及本土驯化遇到的问题，在完成引种适应性试验后，结合本地情况，逐步改进种羊饲养管理方法的同时，加强性能测定，应用所建立的小群体选育方法开展品系选育。经过持续选育，高效快繁，及不同规模和饲养环境下饲养管理技术的调整后，表现出适应性良好、体型大、生长快、成熟早、全年发情、自动换毛、抗逆性好及羔羊成活率高等特点。

近年来，合成材料的发展以及消费观念的改变使得人们对羊毛和羊肉的需求关系发生变化，对羊肉的需求量增加。羊毛生长过程中，细毛羊的营养需求更高，料肉转化率低于粗毛羊，筛选毛发更粗的羊可减少其在羊毛生长上的营养消耗，降低料肉比。同时粗毛型绵羊抗病、抗逆、耐粗饲性能更优，因而筛选并提高其中的粗毛个体比例可有效提高澳洲白绵羊的产肉性能。

基因组选择育种是通过对动物基因型分析来计算育种值，可有效降低表型鉴定中主观评价导致的误差，并能实现目标性状的早期选择，降低饲养成本，加快育种进程。本发明中发现的SNP与澳洲白绵羊毛发粗细性状的相关性达到了极显著水平，有助于加快澳洲白绵羊粗毛新品系的培育。

通过对公开专利文献的检索，并未发现与本专利申请相同的公开专利文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记、分子标记及应用。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记，其特征在于：所述标记存在A和G两种等位基因，位于国际绵羊基因组Oar_v4.025号染色体上第7270707核苷酸位点Chr25:7270707。

而且，所述SNP标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.025号染色体上第7270707核苷酸位点，且具有A/G多态性，所述SNP标记与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关P<0.01。

而且，具有A/G多态性的为g.7270707A/G。

而且，g.7270707A/G位点G等位基因数量与毛发粗度极显著相关。

一种基于与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记的分子标记，其特征在于：所述分子标记的序列为SEQ ID NO:1。

一种基于与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记的分子标记制备方法，其特征在于：所述方法以含有SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以澳洲白绵羊基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP标记转化为300bp的分子标记。

而且，所述引物对的上游引物为：SEQ ID NO:2，下游引物为：SEQ ID NO:3。

而且，所述引物应用在培育粗毛型肉用澳洲白绵羊新品系中。

而且，所述SNP标记位于分子标记序列的第111位的R，表示为A/G多态性。

一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记在培育粗毛型肉用澳洲白绵羊新品系选育及利用澳洲白绵羊培育新品种中的应用。

本发明的优点和积极效果是：

本发明提供的SNP标记与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关，可以通过鉴定所述SNP标记，筛选粗毛型个体，利用分子标记辅助选择提高选择效率、对澳洲白绵羊新品系选育及利用澳洲白绵羊培育新品种具有重要的意义。

附图说明

图1本发明的与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记的曼哈顿图，其中，红色圆圈的标记为本发明筛选的分子标记，该标记位于绵羊第25号染色体上；

图2为本发明所设计引物进行PCR扩增出的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M泳道：DNAMarker DL2000；M泳道右侧依次为AA基因型、GA基因型和GG基因型各2个；

图3为本发明中澳洲白绵羊第25号染色体上g.7270707A/G核苷酸处G-A突变，即三种不同基因型(AA、GA、GG)的峰图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例做进一步详述：

一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记，其创新之处在于：所述标记存在A和G两种等位基因，位于国际绵羊基因组Oar_v4.025号染色体上第7270707核苷酸位点Chr25:7270707。

所述SNP标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.025号染色体上第7270707核苷酸位点，且具有A/G多态性，所述SNP标记与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关P<0.01。

具有A/G多态性的为g.7270707A/G。

g.7270707A/G位点G等位基因数量与毛发粗度极显著相关。

一种基于与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记的分子标记，其创新之处在于：所述分子标记的序列为SEQ ID NO:1。

一种基于与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记的分子标记制备方法，其创新之处在于：所述方法以含有SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以澳洲白绵羊基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP标记转化为300bp的分子标记。

所述引物对的上游引物为：SEQ ID NO:2，下游引物为：SEQ ID NO:3。

所述引物应用在培育粗毛型肉用澳洲白绵羊新品系中。

所述SNP标记位于分子标记序列的第111位的R，表示为A/G多态性。

一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记在培育粗毛型肉用澳洲白绵羊新品系及利用澳洲白绵羊培育新品种中的应用。

具体地：

1、实验动物来源

天津奥群牧业有限公司

2、澳洲白绵羊毛发粗细表型测定

参照《羊生产学》(赵有璋主编，2011年6月第三版，中国农业出版社出版)对377只澳洲白绵羊的毛发粗细测定评估，细毛型评分为1分，粗毛型评分为2分。

3、提取基因组DNA

采集377头澳洲白绵羊的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。

使用磁珠法提取耳组织基因组DNA，所需试剂包括：

裂解液BL(长春市志昂生物科技有限公司)

洗涤液BW(长春市志昂生物科技有限公司)

磁珠BC(长春市志昂生物科技有限公司)

蛋白酶K(金普诺安生物科技有限公司)

无水乙醇(西陇科学股份有限公司)

洗脱液CE(长春市志昂生物科技有限公司)

具体步骤如下：

1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入1.5mL离心管中；

2)加入400μL裂解液及20μL蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋振荡混匀；

3)样品置于65℃水浴锅中孵育过夜，至管中裂解液澄清透明为止；

4)4℃12000r/min离心2min，室温放置10min，取上清置于1.5mL离心管中；

5)加入450μL无水乙醇，颠倒混匀后加入30μL磁珠，涡旋振荡混匀，室温静置10min进行吸附，静置过程中第3分钟、第6分钟分别涡旋振荡混匀1次；

6)吸附结束后，涡旋振荡混匀磁珠，将离心管置于磁力架上，反复颠倒磁力架，将可能留存在管盖部分的磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架磁吸1min或至溶液澄清，弃去管盖和管内上清液，注意不要触碰磁珠；

7)加入700μL已加无水乙醇的洗涤液BW，高速涡旋振荡1min，将离心管置于磁力架上，反复颠倒磁力架，将可能留存在管盖部分的磁珠冲刷至管内溶液中，静置磁力架磁吸1min或至溶液澄清，弃去管盖和管内上清液，注意不要触碰磁珠；

8)加入800μL已加无水乙醇的洗涤液BW。按照步骤(7)的方法洗涤1次；

9)加入800μL 80％乙醇溶液，按照步骤(7)的方法洗涤1次；

10)将离心管置于磁力架上，室温开盖干燥5～10min至无乙醇残留；

11)加入50μL洗脱液CE，充分混匀，56℃孵育10min进行DNA洗脱，第5min涡旋振荡混匀1次。洗脱结束后混匀磁珠，磁吸1min或至溶液澄清，小心吸取上清，置于新的1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

4、澳洲白绵羊全基因组测序分型

利用限制性位点相关DNA测序技术(Restriction-site associated DNAsequencing,RAD-seq)，采用Hiseq X ten测序平台对绵羊耳组织样提取的基因组DNA进行双端测序(PE150)。

获得测序数据后，根据标签序列提取个体数据，过滤掉低质量测序片段，然后采用BWA软件(Li,Durbin,2009)将高质量片段比对到绵羊参考基因组(assembly Oar_v4.0,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝sheep)上，再采用samtools进行变异检测。

对初步获得的SNP数据进行质量控制，质控标准为：call rate>0.7，snp质量值>20，最小等位基因频率>0.01，杂合度<0.9，共得到snp总数175902个。

采用fastphase软件(Scheet,Stephens,2006)对缺失基因型进行填充，并采用相同的质控标准对填充后SNP标记进行再次过滤，最后得到171842个高质量SNP标记。

5、澳洲白绵羊毛发粗细性状的全基因组关联分析(GWAS)

使用EMMAX程序(http://genetics.cs.ucla.edu/emmax/index.html)对毛发粗细打分进行GWAS分析。分析模型如下：

y＝Xb+Zu+m+e

模型中y表示毛发粗细打分，X表示固定效应关联矩阵，b表示为固定效应向量，固定效应包括年-季、同胎数、性别及3个主成分效应，Z表示加性遗传效应关联矩阵，u表示个体加性遗传效应向量，e表示残差，

G表示基因组亲缘关系矩阵，I表示单位矩阵，

分别代表加性遗传效应方差和残差方差，m表示SNP标记效应。

GWAS结果显示，毛发粗细相关的SNP标记位于25号染色体上第7270707核苷酸位点(g.7270707A/G)，达到全基因组5％显著水平(P＝1.87*10-33)。

SNP位点(即SNP标记)g.7270707A/G在149只澳洲白绵羊验证群中，不同基因型个体的毛发粗细打分比较。

验证群149只澳洲白绵羊是经RAD测序基因分型、具有毛发粗细打分记录，但不包含于实施例1的绵羊群体。

由表1可知，g.7270707A/G位点G等位基因数量与毛发粗细打分极显著相关(秩相关检验p<0.01)，G等位基因数量越多，毛发粗细打分越高。

表1验证群149只绵羊在g.7270707A/G位点不同基因型个体打分情况

SNP位点g.7270707A/G在45只澳洲白绵羊验证群中，不同基因型个体的毛发粗细打分比较。

验证群45只澳洲白绵羊未经RAD测序，具有毛发打分记录，不包含于实施例1或实施例2中的绵羊群体。

1、提取澳洲白绵羊基因组DNA

采集具有毛发评分的45头澳洲白绵羊的耳组织样品，粗毛型25头，细毛型20头，放置于装70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。利用上述方法提取耳组织基因组DNA，经过质量、浓度检测后置于-20℃保存备用。

2、目的片段PCR扩增与测序

用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板0.8μL、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物各0.2μL、PCR Mix试剂10μL、双蒸水8.4μL；设置PCR扩增体系：预变性98℃2min；变性98℃15s；退火59℃30s；延伸72℃30s；35个循环；然后72℃延伸5min。

PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中检测，扩增的目的片段大小为300bp，电泳图见图2，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用SnapGene软件与GenBank中绵羊的相关基因片段序列比对、分析，判读g.7270707A/G的基因型。测序序列符合SEQ ID NO:1所述序列信息，在该序列第173位碱基处存在SNP位点g.7270707A/G。由表2可知，g.7270707A/G位点G等位基因数量与毛发粗细打分极显著相关(秩相关检验p<0.01)，G等位基因数量越多，毛发粗细打分越高。

表2验证群45只绵羊在g.7270707A/G位点不同基因型个体打分情况

一种培育粗毛型肉用澳洲白绵羊新品系的方法，包括检测澳洲白绵羊g.7270707A/G核苷酸位点的基因型，选育g.7270707A/G核苷酸位点的GG型个体作为种羊。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津奥群牧业有限公司

<120> 一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP标记、分子标记及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 分子标记(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

acatttggaa ggtacgctta ccgtcaccta ggttgtcttt aaaaaggagc agtctggcac 60

cacccacaaa gacattgata cagtgggtat gcagtgggct cccgacagct acatgaaaaa 120

ataaatactg aaaacaagag taattcagga gccgtgcaaa gtactgtagg aatgagctag 180

ggatagagct gaaaacgaga tgcccgcagc agcactggca gtcgaatgcc caagctgact 240

ccagcatgca gttcttccca cacaatgctt gcgcttccac atgcagtccc caaatagttc 300

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 上游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

acatttggaa ggtacgctta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 下游引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

gaactatttg gggactgcat 20

Claims (1)

1.一种分型SNP标记g.7270707A/G的检测试剂在培育粗毛型肉用澳洲白绵羊新品系选育中的应用，所述SNP标记g.7270707A/G为位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本参考序列25号染色体上第7270707核苷酸位点具有A/G多态性的SNP，选育所述g.7270707A/G核苷酸位点为GG型个体作为种羊，GG型澳洲白绵羊的毛发为粗毛型。

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