TWI804902B - 豬隻毛色分群之引子對組合及其方法與套組 - Google Patents

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張啟聖
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丁詩同
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Abstract

本發明係提供豬隻毛色分群之引子對組合及其方法與套組；針對臺灣有色豬種與白色豬種(包括肉豬及種豬)，萃取其gDNA，以豬隻生物晶片，應用全基因組關聯分析(GWAS)進行臺灣豬隻毛色差異性候選基因分析，並選拔出一些有效的候選SNPs，將不同外觀毛色豬種進行分群。

Description

豬隻毛色分群之引子對組合及其方法與套組
本發明係關於鑑別豬隻毛色之引子組、方法及套組，尤其是關於適於使用單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism, SNP)技術，以篩選豬隻毛色之引子組、方法及套組。
臺灣飼養豬隻可區分為具有全身白毛之白色肉豬與全身具有色豬毛之有色肉豬兩大類，白色豬種包括藍瑞斯、約克夏與三品種雜交豬；有色豬種主要包括杜洛克、盤克夏與臺灣黑豬。白色肉豬與有色肉豬在去毛之屠體外觀上不易區分，但在價格上有色肉豬，特別是臺灣黑豬因肉質與風味優異，往往具有較高的市場價格，但臺灣黑豬僅佔臺灣肉豬總生產頭數約12.7%，因此市場上有以白毛豬肉矇混為黑毛豬肉販售的情形。
前案例如CN 110241226A號，揭示一種太湖流域地方品種豬各個品種及生肉製品的SNP標記組合和鑑定方法。經由萃取生豬肉或肉製品的基因體DNA，以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)方式放大目標訊號，電泳後以SNaPshot定序，得到SNP組合後用以將太湖流域地方品種豬與常見之西方豬種區分；或TW I417545號，係一種可同時檢測豬隻多種分子標記之基因型的一種方法，其包含在同一反應中使用多種引子組，針對不同的分子標記進行引子延伸反應並且分析其產物。其分析之基因群與豬隻經濟性狀有關，例如雌激素受體(ESR)、視黃醇結合蛋白4 (RBP4) 、鈣離子釋放通道接受體(CRC)、鈣激活蛋白酶抑制蛋白(CAST) 、催乳素受體(PRLR)、岩藻醣轉移酶(FUT1) 、黑色素皮質受體4 (MC4R) 、酸肉基因(RN)、及心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)；或CN 102618660A號為檢測豬的毛色基因型及其應用。係以待測豬隻之基因體DNA為模板，透過PCR方式放大目標訊號，產物利用限制酶作用後切割定序，藉以鑑定其表現型。
目前尚未有特別針對檢測豬隻毛色基因的相關發明，故為了解決市場上不肖商人以白毛豬肉矇混為黑毛豬肉販售賺取利差的情形，進而使本發明人著手開發相關的檢測方法。是以，本發明人致力於研發簡易且準確的豬隻毛色檢測方法套組，進行毛色品種檢測試劑套組之開發，檢測目的即為檢驗受測gDNA來自於白色肉豬或是有色肉豬，以確保目前臺灣販售豬肉之品種來源。
為解決上述問題，本發明提供一種用以鑑別豬隻毛色分群之方法，其係包含(a)檢測一豬隻之基因體DNA (genomic DNA)樣本中20個SNP位點之基因型，該20個SNP位點為(1) Chr:2_84351681、(2) Chr:2_49306110、(3) Chr:7_57663757、(4) Chr:6_94601670、(5) Chr:13_44939426、(6) Chr:X_117766657、(7) Chr:2_2183220、(8) Chr:1_233804857、、(9) Chr:5_46621798、(10) Chr:8_47465937、(11) Chr:3_51923062、(12) Chr:8_47469422、(13) Chr:15_50030308、(14) Chr:8_46116179、(15) Chr:5_46266348、(16) Chr:18_44836934、(17) Chr:15_140216062、(18) Chr:1_233505936、(19) Chr:8_44090690及(20) Chr:8_46133043； (b) 依照基因型進行下列公式之評分，
Figure 02_image001
SNP基因型之分數表
SNP位點 Ref a Alt b 分數 c
W/W W/M M/M
(1) Chr:2_84351681 T C 1 1 1
(2) Chr:2_49306110 T G 3 0 1
(3) Chr:7_57663757 T C 1 1 0
(4) Chr:6_94601670 G A 1 3 3
(5) Chr:13_44939426 A G 3 1 1
(6) Chr:X_117766657 G A 1 3 3
(7) Chr:2_2183220 C T 3 1 1
(8) Chr:1_233804857 C T 1 3 1
(9) Chr:5_46621798 A G 1 1 0
(10) Chr:8_47465937 C T 3 0 1
(11) Chr:3_51923062 A G 1 1 1
(12) Chr:8_47469422 G A 3 0 0
(13) Chr:15_50030308 C A 3 1 1
(14) Chr:8_46116179 G A 3 0 1
(15) Chr:5_46266348 G A 3 1 1
(16) Chr:18_44836934 C T 1 1 1
(17) Chr:15_140216062 C T 1 1 1
(18) Chr:1_233505936 A G 0 3 0
(19) Chr:8_44090690 T G 3 0 0
(20) Chr:8_46133043 G A 3 0 1
a：參考序列之基因型 b：交替基因型 c：基因型 ：W/W=野生型純合子； W/M=雜合子； M/M=突變型純合子； 其中，0~19分為白色豬隻，20分以上為有色豬隻。
進一步地，步驟(b)評分40分以上為黑色豬隻。
進一步地，其中檢測20個SNP位點之方法為係使用DNA定序、毛細管電泳、核酸質譜分析法、單鏈構象多態性(SSCP)、電化學分析、變性高效液相色譜(HPLC)、限制性片段長度多態性法或雜交分析法。
進一步地，其中該核酸質譜分析法包含下列三步驟：(1) 將該豬隻之gDNA樣本以針對該20個SNP位點之專一性引子對進行PCR；(2) 使用黏合於該21個SNP位點之延長引子(extension primer)進行單一鹼基延伸反應；以及(3) 以質譜儀分析產物分子量，得到該20個SNP位點的定型結果。
進一步地，其中該專一性引子對為下列20組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)、第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)、第十二組引子對(SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24)、第十三組引子對(SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26)、第十四組引子對(SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28)、第十五組引子對(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30)、第十六組引子對(SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32)、第十七組引子對(SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34)、第十八組引子對(SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36)、第十九組引子對(SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38) 及第二十組引子對(SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40)。
進一步地，其中該延長引子(extension primer)為下列20個：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：60。
本發明亦提供一種用以鑑別豬隻毛色分群之引子對組合，該引子對組合包含下列20組引子對：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)、第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)、第十二組引子對(SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24)、第十三組引子對(SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26)、第十四組引子對(SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28)、第十五組引子對(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30)、第十六組引子對(SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32)、第十七組引子對(SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34)、第十八組引子對(SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36)、第十九組引子對(SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38) 及第二十組引子對(SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40)。
進一步地，該第引子對組合包含下列20個延長引子(extension primer)：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：60。
本發明亦提供一種用於鑑別豬隻毛色分群之套組，包含一PCR擴增反應試劑、單一鹼基延伸反應試劑及上述之引子對組合。
本專利找到20個SNP位點基因型，可有效辨別豬隻毛色，因此本發明可應用於臺灣豬隻產業，對於豬隻進行快速且準確性高的檢測，特別是黑毛豬生產育種體系，具有商業價值。此外，本發明所得之有色及白色豬種族群全基因體資料，未來可作為豬種(肉豬)育種、毛色選拔(特別是白毛豬及黑毛豬的區別，此些候選SNPs 點位可以應用於黑豬認證之用)和生產制度之參考資料。
本發明以下敘述為此技術領域中通常知識者可輕易明瞭此發明之必要技術，且只要不違反其中的精神及範圍，就可以多樣的改變及修飾這個發明來適應不同的用途及狀況。如此，其他的實施例亦包含於申請專利範圍中。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語之含義與本發明所屬領域之一般技術人員通常理解的含義相同。在整個本申請中使用的下列術語應具有以下含義。
本發明係先針對臺灣有色豬種與白色豬種(包括肉豬及種豬)，萃取其gDNA，以豬隻生物晶片，應用全基因組關聯分析(GWAS)進行臺灣豬隻毛色差異性候選基因分析，篩選出連鎖不平衡(linkage disequilibrium)之位點進而選拔出有效的SNP位點；因此，本發明係關於提供一種用以鑑別豬隻毛色分群之方法，其係包含(a)檢測一豬隻之基因體DNA (genomic DNA)樣本中20個SNP位點之基因型，該20個SNP位點為(1) Chr:2_84351681、(2) Chr:2_49306110、(3) Chr:7_57663757、(4) Chr:6_94601670、(5) Chr:13_44939426、(6) Chr:X_117766657、(7) Chr:2_2183220、(8) Chr:1_233804857、、(9) Chr:5_46621798、(10) Chr:8_47465937、(11) Chr:3_51923062、(12) Chr:8_47469422、(13) Chr:15_50030308、(14) Chr:8_46116179、(15) Chr:5_46266348、(16) Chr:18_44836934、(17) Chr:15_140216062、(18) Chr:1_233505936、(19) Chr:8_44090690及(20) Chr:8_46133043； (b) 依照基因型進行下列公式之評分，
Figure 02_image001
SNP基因型之分數表
SNP位點 Ref a Alt b 分數 c
W/W W/M M/M
(1) Chr:2_84351681 T C 1 1 1
(2) Chr:2_49306110 T G 3 0 1
(3) Chr:7_57663757 T C 1 1 0
(4) Chr:6_94601670 G A 1 3 3
(5) Chr:13_44939426 A G 3 1 1
(6) Chr:X_117766657 G A 1 3 3
(7) Chr:2_2183220 C T 3 1 1
(8) Chr:1_233804857 C T 1 3 1
(9) Chr:5_46621798 A G 1 1 0
(10) Chr:8_47465937 C T 3 0 1
(11) Chr:3_51923062 A G 1 1 1
(12) Chr:8_47469422 G A 3 0 0
(13) Chr:15_50030308 C A 3 1 1
(14) Chr:8_46116179 G A 3 0 1
(15) Chr:5_46266348 G A 3 1 1
(16) Chr:18_44836934 C T 1 1 1
(17) Chr:15_140216062 C T 1 1 1
(18) Chr:1_233505936 A G 0 3 0
(19) Chr:8_44090690 T G 3 0 0
(20) Chr:8_46133043 G A 3 0 1
a： 參考序列之基因型 b：交替基因型 c： 基因型: W/W=野生型純合子；W/M=雜合子； M/M=突變型純合子；且， 其中，0~19分為白色豬隻，20分以上為有色豬隻。於較佳實施例中，該評分40分以上為黑色豬隻。
上述方法中，檢測20個SNP位點之方法為係使用包含但不限於DNA定序、毛細管電泳、核酸質譜分析法、單鏈構象多態性(SSCP)、電化學分析、變性高效液相色譜(HPLC)、限制性片段長度多態性法或雜交分析法。
本文所述之「單核苷酸多型性(single-nucleotide polymorphism, SNP)」係指DNA序列中的單一鹼基對(base pair)變異，即DNA序列中A、T、C、G的改變。在一族群中，基因組是存在著DNA序列差異性(sequence differentiation)的，而單核苷酸多型性是最普遍發生的一種遺傳變異，大多數SNPs位在基因组的非編碼區；存在於編碼區的SNP約僅有20萬個，稱之為cSNP(coding SNP)，有些cSNPs的序列改變並不影響轉譯後的胺基酸序列，通常不會影響個體的表現型；有些則會改變轉譯後的胺基酸序列，進而影響蛋白質的功能，從而可能產生特殊的疾病或是有別於其他人的生物特徵。
本文所述之「全基因組關聯分析(Genome-wide association study, GWAS)」係指在全基因組範圍內找出存在的序列變異，即SNP。
本文所述之「連鎖不平衡 (linkage disequilibrium)」係為某一群體中，不同座位某兩個等位基因出現在同一條染色體上的頻率高於預期的隨機頻率的現象。由於不同基因座位的某些等位基因經常連鎖在一起遺傳，而連鎖的基因並非完全隨機地組成單體型，有些基因總是較多地在一起出現，致使某些單體型在群體中呈現較高的頻率，從而引起連鎖不平衡。
本文所述之「DNA定序」，係指分析特定DNA片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的排列方式。本文中可採用任何習知技術進行DNA定序。
本文所述之「毛細管電泳」係指利用毛細管中被分析的帶電分子在電場作用下，因移動速率不同而達到分離不同分子的目的。
本文所述之「核酸質譜分析法」係指利用基質輔助雷射脫附飛行時間核酸質譜儀檢測基因突變。基因的突變導因於去氧核醣核酸上核苷酸的改變，突變型與野生型核苷酸質量上不同，在質譜儀上的飛行時間也不同，因此利用此特性可以在頻譜上的不同位置出現訊號，用以判定突變核苷酸的存在。
本文所述之「單鏈構象多態性」分析，係指一種分離核酸的技術，可以分離相同長度但序列不同的核酸。在一定條件下，單鏈DNA可形成特有的二級結構，不同DNA鏈上單個鹼基的改變可引起其二級結構的改變，從而改變DNA鏈在非變性膠中的電泳遷移率形成的多態性稱作單鏈構象多態性。單鏈DNA片段呈複雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部鹼基配對等分子內相互作用力來維持，當有一個鹼基發生改變時，或多或少會影響其空間構象使其改變，而空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。
本文所述之「電化學分析」，係指利用測量樣品的電位(potential)、電流和電阻(或導電度)，以分析樣品中待測物組成及濃度的方法。
本文所述之「高效液相層析法」，是一種色譜分析技術，用來分離混合物，可以用來定性及定量混合物中的各種成分。它依賴泵加壓移動相(固定相)帶動樣品以令其通過填充有吸附劑的固定相分離管柱(靜相)，導致樣品的各個成分與固定相之不同親和力而分離。
本文所述之「限制性片段長度多態性」係指DNA分子由於核苷酸序列的不同而產生的一種可以用來相互區別的性質。鹼基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點出現，從而引起不同個體在使用同一限制酶時，DNA片段長度出現差異，因此可藉由該差異來區分不同的基因型。
前述之「基因的突變位點的檢測方法」較佳係利用偵測核酸的片段分子量來達成。由於不同分子的分子量皆不同，因此可以精確地偵測僅有一鹼基差異的兩個不同的核酸片段，該方法包括以下步驟：進行一PCR，擴增包含該突變位點的核酸片段；進行去磷酸化反應；進行一延伸反應，其中使用延伸引子辨識該突變位點的位置，並在該延伸引子的3’端延伸與該突變位點的鹼基互補的單一核苷酸，而獲得被延伸的延伸引子；進行純化反應；以及以質譜儀檢測該被延伸的延伸引子的分子量大小，根據該分子量大小決定該突變位點的基因型。
以下為本發明之具體實施例：
[實驗材料]
本發明之實驗材料為藍瑞斯(44頭)、約克夏(32頭)、杜洛克(49頭)、盤克夏(21頭)、高畜黑豬(20頭)、DK黑豬(21頭)、平埔黑豬(40頭)、桃園豬(12頭)、梅山豬(18頭)與六堆黑豬(8頭)之基因體DNA(gDNA)。
[篩選豬隻毛色相關基因之方法]
將上述之豬隻檢體gDNA確認其gDNA品質後，以Thermo Fisher Scientific生產之具有658,692個SNPs位點之高密度基因型分型晶片(Axiom™ Porcine Genotyping Array, Cat. No. 550588)進行上機分析，所獲得之SNPs位點數據，以PLINK 1.9軟體進行全基因組關聯分析(Genome-wide association study; GWAS)進行數據分析與基因型頻率檢定，篩選出連鎖不平衡(Linkage disequilibrium)的基因位點，結果顯示20個性候選SNP位點會與有色豬隻與白色豬隻的毛色差異相關，並以此20個SNPs位點設計後續檢測毛色引子組序列。
[本發明之引子組]
本發明提供一種用以鑑別豬隻毛色之引子組，其中引子的設計係根據上述SNP分析結果之20組與毛色相關之基因群進行設計，且經多次試驗後，確認以下針對目標基因群設計之SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：40條引子，另針對SNP位點設有SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：60之單一鹼基延長引子，可利用MassARRAY iPLEX技術特異性地檢測並辨別出受測gDNA之毛色，如下表1所示。
表1
SNP位點 引子對 延長引子
(1) Chr:2_84351681 ACGTTGGATGTCAAGCAAAGAGAGCAAGCG (SEQ ID NO: 1) ACGTTGGATGATTTCTGCTGCACCACGATG (SEQ ID NO: 2) GCTCCACACTGCAAA(SEQ ID NO: 41)
(2) Chr:2_49306110 ACGTTGGATGGTTATTATGGTAGGAAGAGC(SEQ ID NO: 3) ACGTTGGATGGGACATGAGACTGTTCTTGG(SEQ ID NO: 4) AGGAAGAGCCAGGTG(SEQ ID NO: 42)
(3) Chr:7_57663757 ACGTTGGATGTTTGCATTTCCGGGCATCTC(SEQ ID NO: 5) ACGTTGGATGCTGGTCAGGAGGCATTTTTG(SEQ ID NO: 6) AGACCTCCATTGGCCCC(SEQ ID NO: 43)
(4) Chr:6_94601670 ACGTTGGATGGTGTGTCATTGTTCCATGTG(SEQ ID NO: 7) ACGTTGGATGGGGTGTAGTCTCTGTCCTG(SEQ ID NO: 8) TGTTCCATGTGTCTACC(SEQ ID NO: 44)
(5) Chr:13_44939426 ACGTTGGATGAGTCTCTGGTTCTAATTGGC(SEQ ID NO: 9) ACGTTGGATGATGTCCAGCATTCTGGATTG(SEQ ID NO: 10) TTGGCAGCTTATGGAAA(SEQ ID NO: 45)
(6) Chr:X_117766657 ACGTTGGATGAGATAGCACCTGCAAAGACG(SEQ ID NO: 11) ACGTTGGATGTGCCTGACCTGATTTTCAAG(SEQ ID NO: 12) GAGAGTGCCAAGAGTTA(SEQ ID NO: 46)
(7) Chr:2_2183220 ACGTTGGATGAGCCCTCGCTGCTTGTAAGT(SEQ ID NO: 13) ACGTTGGATGTCCTCTGGTATTTGGGAAGC(SEQ ID NO: 14) TGCTTGTAAGTCCCTCCCT(SEQ ID NO: 47)
(8) Chr:1_233804857 ACGTTGGATGGAAGAAAGGGATACCTCTAC(SEQ ID NO: 15) ACGTTGGATGCTCTGACTTCAGAAAAAACAG(SEQ ID NO: 16) ACTTGCAAGCATTTCTTAT(SEQ ID NO: 48)
(9) Chr:5_46621798 ACGTTGGATGCAAGTAGCCCTCAGCAAAAG(SEQ ID NO: 17) ACGTTGGATGCCCTTTGATGTGAAGTCTAC(SEQ ID NO: 18) GAAGTCTACTGTCACTGATTA(SEQ ID NO: 49)
(10) Chr:8_47465937 ACGTTGGATGCCACCTGACTCCAGAATATG(SEQ ID NO: 19) ACGTTGGATGGGACAGTCTCTGAGTAATGG(SEQ ID NO: 20) GCAATTGGTGCTTGATGAAGG(SEQ ID NO: 50)
(11) Chr:3_51923062 ACGTTGGATGAACACTGCAAAGCCCTATGG(SEQ ID NO: 21) ACGTTGGATGTGCACACAACCTTTGCTCTG(SEQ ID NO: 22) GCAAAGCCCTATGGCAGGAAGA(SEQ ID NO: 51)
(12) Chr:8_47469422 ACGTTGGATGGTATATAGACTATCCATAG(SEQ ID NO: 23) ACGTTGGATGCTGTGTAAAATGATTGATAGG(SEQ ID NO: 24) AGACTATCCATAGTCTATTACCT(SEQ ID NO: 52)
(13) Chr:15_50030308 ACGTTGGATGTTGGTCTTCCCTTGAGCTTC(SEQ ID NO: 25) ACGTTGGATGCTGTTGTGGTTTGGACTTGG(SEQ ID NO: 26) TTCATAAAAATGACATCTGACTG(SEQ ID NO: 53)
(14) Chr:8_46116179 ACGTTGGATGCATGGCTGGATATCTGGAAG(SEQ ID NO: 27) ACGTTGGATGAAATTTGGCTCCCCTGACTG(SEQ ID NO: 28) CTGGATATCTGGAAGTTATGAAG(SEQ ID NO: 54)
(15) Chr:5_46266348 ACGTTGGATGTCAGCTCTCAGCTCCTATTG(SEQ ID NO: 29) ACGTTGGATGGGACACTGAGGCAGGAATAG(SEQ ID NO: 30) CTCCTATTGGTGTCCTGGCTTCCT(SEQ ID NO: 55)
(16) Chr:18_44836934 ACGTTGGATGAGTTATTGGATAGTTTAATC(SEQ ID NO: 31) ACGTTGGATGCACATAGAACAAATCATGCTG(SEQ ID NO: 32) TTGAGAAGTAATTGACATTAGTTTC(SEQ ID NO: 56)
(17) Chr:15_140216062 ACGTTGGATGTAGAGTGTCTCACGATTGGC(SEQ ID NO: 33) ACGTTGGATGTAAATACACGTGGCCAAGGG(SEQ ID NO: 34) GCAGTGTGGACCGTGGACTAGAGCA(SEQ ID NO: 57)
(18) Chr:1_233505936 ACGTTGGATGGGGTGGCAAAGGTATCAGAG(SEQ ID NO: 35) ACGTTGGATGTTGTCAGTCTGCTCTTCCAC(SEQ ID NO: 36) GCAAGTCTATCATCTCTCTCTATAGC(SEQ ID NO: 58)
(19) Chr:8_44090690 ACGTTGGATGCTTCTTTGAGCCACAGTTCG(SEQ ID NO: 37) ACGTTGGATGGCTGCAATCTCTATGTTGCC(SEQ ID NO: 38) TATCCCTGTGTCCACAGCTCTTCAGTC(SEQ ID NO: 59)
(20) Chr:8_46133043 ACGTTGGATGAAGCATATTTGATGGCCCAG(SEQ ID NO: 39) ACGTTGGATGAGTGACCCTGAAGTCCCTTG(SEQ ID NO: 40) TTTGATGGCCCAGTTTGCCTCATG(SEQ ID NO: 60)
[結果分析]
依照上述之引子組並依照上開計分說明得到之基因型分數(Score)，進行評量得到指數(Index)，計算公式如下：
Figure 02_image003
其中指數低於10分為白色豬隻，20分以上為有色豬隻，黑豬之指數會大於40分。依此方式計算出之指數可有效檢測出受測gDNA屬於何種毛色品種之豬隻。
[本發明之套組]
本發明之套組包含PCR擴增反應試劑、單一鹼基延伸反應試劑及上述之引子組。
綜上所述，本發明具有下列優勢：
1. 本試驗所得之此些候選SNPs位點，未來可作為豬種(肉豬)育種、毛色選拔(特別是白毛豬及黑毛豬的區別，可以應用於黑豬認證之用)和生產制度之參考資料。
2. 本發明之套組能夠快速且準確地將豬隻毛色分群。
3. 本發明在學術上及商業上均具備應用價值。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅為本發明之一較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。
無
無。
無。
<110> 國立臺灣大學
<120> 豬隻毛色分群之引子對組合及其方法與套組
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<221> 引子_結合
<222> (1)..(30)
<400> 1
Figure 110123487-A0305-02-0018-1
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<221> 引子_結合
<222> (1)..(30)
<400> 2
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
無。

Claims (9)

  1. 一種豬隻毛色分群之方法，包含： (a) 檢測一豬隻之基因體DNA (genomic DNA)樣本中20個SNP位點之基因型，該20個SNP位點為(1) Chr:2_84351681、(2) Chr:2_49306110、(3) Chr:7_57663757、(4) Chr:6_94601670、(5) Chr:13_44939426、(6) Chr:X_117766657、(7) Chr:2_2183220、(8) Chr:1_233804857、、(9) Chr:5_46621798、(10) Chr:8_47465937、(11) Chr:3_51923062、(12) Chr:8_47469422、(13) Chr:15_50030308、(14) Chr:8_46116179、(15) Chr:5_46266348、(16) Chr:18_44836934、(17) Chr:15_140216062、(18) Chr:1_233505936、(19) Chr:8_44090690及(20) Chr:8_46133043； (b) 依照基因型進行下列公式之評分，
    Figure 03_image001
    SNP基因型之分數表 SNP位點 Ref a Alt b 分數 c W/W W/M M/M (1) Chr:2_84351681 T C 1 1 1 (2) Chr:2_49306110 T G 3 0 1 (3) Chr:7_57663757 T C 1 1 0 (4) Chr:6_94601670 G A 1 3 3 (5) Chr:13_44939426 A G 3 1 1 (6) Chr:X_117766657 G A 1 3 3 (7) Chr:2_2183220 C T 3 1 1 (8) Chr:1_233804857 C T 1 3 1             (9) Chr:5_46621798 A G 1 1 0 (10) Chr:8_47465937 C T 3 0 1 (11) Chr:3_51923062 A G 1 1 1 (12) Chr:8_47469422 G A 3 0 0
    Figure 110123487-A0305-02-0046-2
     其中，a：參考序列之基因型、b：交替基因型、c：基因型：W/W=野生型純合子；W/M=雜合子；M/M=突變型純合子；0~19分為白色豬隻，20分以上為有色豬隻。
  2. 如請求項1所述之方法，其中，步驟(b)評分40分以上為黑色豬隻。
  3. 如請求項1所述之方法，其中檢測20個SNP位點之方法為係使用DNA定序、毛細管電泳、核酸質譜分析法、單鏈構象多態性(SSCP)、電化學分析、變性高效液相色譜(HPLC)、限制性片段長度多態性法或雜交分析法。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該核酸質譜分析法包含下列三步驟：(1)將該豬隻之gDNA樣本以針對該20個SNP位點之專一性引子對進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)；(2)使用黏合於該20個SNP位點之延長引子(extension primer)進行單一鹼基延伸反應；以及(3)以質譜儀分析產物分子量，得到該20個SNP位點的定型結果。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該專一性引子對為下列20組：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)、第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)、第十二組引子對(SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24)、第十三組引子對(SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26)、第十四組引子對(SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28)、第十五組引子對(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30)、第十六組引子對(SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32)、第十七組引子對(SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34)、第十八組引子對(SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36)、第十九組引子對(SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38) 及第二十組引子對(SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40)。
  6. 如請求項4或5所述之方法，其中該延長引子(extension primer)為下列20個：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：60。
  7. 一種用於請求項2至6任一項所述之方法之引子對組合，其包含下列20組引子對：第一組引子對(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)、第二組引子對(SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4)、第三組引子對(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6)、第四組引子對(SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8)、第五組引子對(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)、第六組引子對(SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12)、第七組引子對(SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14)、第八組引子對(SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16)、第九組引子對(SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18)、第十組引子對(SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20)、第十一組引子對(SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22)、第十二組引子對(SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：24)、第十三組引子對(SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26)、第十四組引子對(SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28)、第十五組引子對(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30)、第十六組引子對(SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32)、第十七組引子對(SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34)、第十八組引子對(SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：36)、第十九組引子對(SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：38) 及第二十組引子對(SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40)。
  8. 如請求項7之引子對組合，其進一步包含下列20個延長引子(extension primer)：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：60。
  9. 一種用於豬隻毛色分群之套組，包含一PCR擴增反應試劑、單一鹼基延伸反應試劑及請求項8之引子對組合。
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