CN112048562B - 一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用，所述的影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第7号染色体上第44288858个核苷酸位点A/G突变。本发明还提供用于鉴定上述SNP分子标记的特异性引物对及含有该特异性引物对的试剂盒，可以用于高山美利奴羊超细品系早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。且试剂盒具有操作简单的优点，减少高山美利奴羊羊毛纤维直径优良性状的育种时间，降低育种成本，缩短培育周期，加快培育进程，具有很高的应用价值。

Description

一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其 应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用。

背景技术

高山美利奴羊新品种是世界首例能适应海拔2400～4070m高山寒旱生态区和羊毛纤维直径19.1～21.5μm为主体的毛肉兼用型美利奴羊新品种，为提高细毛羊综合品质提供了优秀种质资源。细毛羊的羊毛产量和纤维细度品质是决定其经济价值的重要指标，并且羊毛品质的客观检验在羊毛销售中越来越受到重视，它与纺织性能、育种和生产三者间结合的越来越紧密，羊毛纤维直径是羊毛纤维检验中最为重要的测试指标，羊毛几乎所有性质都与纤维直径相关或直接由纤维直径决定。

为了加快羊毛产业的发展，从分子水平上选择与羊毛纤维直径性状相关的候选基因或与QTL相连锁的分子标记，成为了育种工作者实现辅助选择的首要条件。近50年来，国内外细毛羊遗传育种专家一直致力于挖掘控制羊毛性状的候选基因或分子标记的研究，但至今没有建立起细毛羊毛性状分子标记体系，且一大批调控羊毛性状的重要基因资源仍未得到有效的挖掘与利用。随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术为育种工作提供了有利工具。该技术是利用与目标基因连锁的分子标记，通过DNA水平的检测即可完成对目标性状的选择，能够提高选择效率，减少工作量，从而加快培育进程。

目前应用较广泛的分子遗传标记技术有：限制性片段长度多态分析技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机引物扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性分析技术(AmplifiedFragment Length Polymorphism，AFLP)、单核苷酸多态性标记(single nucleotidepolymorphism，SNP)等。其中，SNP是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。SNP分子标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点。

现有技术公开了一种与澳洲白绵羊毛发粗细极显著相关的SNP分子标记、分子标记及应用(CN201811297784.3)，并具体公开了所述标记存在A和G两种等位基因，位于国际绵羊基因组Oar_v4.025号染色体上第7270707核苷酸位点Chr25：7270707，且当核苷酸为G时，澳洲白绵羊的毛发较粗。所述的SNP分子标记可用于澳洲白绵羊新品系选育及利用澳洲白绵羊培育新品种过程中的选配及早期选择，可提高选择准确性，加快选育及纯化进展，但是其在研究过程中发现，羊毛生长过程中，细毛羊的营养需求更高，料肉转化率低于粗毛羊，筛选毛发更粗的羊可减少其在羊毛生长上的营养消耗，降低料肉比通过筛选粗毛个体比例进而提高澳洲白绵羊的产肉性能，即就是说粗羊毛的澳洲白绵羊的产肉性能更好。

而本发明针对高山美利奴羊羊毛形状进行研究，意外的发现了一种细毛的美利奴羊新品种，与上述专利内容不同的是，所述的细毛美利奴羊具有毛肉兼用型，所述的细毛形状通过单核苷酸分子控制。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记，所述的SNP分子标记位于高山美利奴羊基因组Oar_v4.0版本第7号染色体上第44288858个位点的碱基处；突变碱基为A或G。所述的高山美利奴羊基因组Oar_v4.0版本第7号染色体的GenBank登录号：NC_019464.2。

进一步地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SNP标记位于SEQ ID No:1所示核苷酸序列的501位。

本发明的第二目的是提供所述的SNP分子标记在细毛高山美利奴羊育种中的应用。

进一步地，当所述的SNP分子标记碱基为A时，基因型为AA；当所述的SNP分子标记碱基为G时，基因型为AG或GG；

所述AA基因型和AG基因型的高山美利奴羊的羊毛纤维直径显著小于GG基因型。

本发明的第三目的是提供用于检测所述的SNP分子标记的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如下所示：

F：5'-AAATGAACAGCAGCAATC-3'；

R：5'-AACAGTGGCAATGGAAGA-3'。

本发明的第四目的是提供含有所述的特异性引物对的试剂或者试剂盒。

本发明的第五目的是提供所述的特异性引物对在检测高山美利奴羊羊毛粗细形状中的应用。

本发明的第六目的是提供所述的特异性引物对检测高山美利奴羊羊毛纤维直径性状的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)提取待测高山美利奴羊血液基因组DNA；

(2)利用所述的特异性引物对将步骤(1)获得的待测高山美利奴羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述的SNP分子标记位于第142位，突变碱基为A或G；

(4)根据步骤(3)获得的测序结果，确定待测高山美利奴羊血液的所述SNP分子标记的基因型；

(5)依据步骤(4)获得的SNP分子标记的基因型判定高山美利奴羊羊毛粗细性状。

优选地，所述的步骤(2)中的PCR扩增体系25μL：Premix Taq 12.5μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 9.5μL。

优选地，所述的PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃延伸10min。

优选地，所述的步骤(1)中基因组DNA溶液的浓度大于20ng/μL，所述基因组DNA溶液的OD260/OA280值为1.7～1.9。

优选地，所述的步骤(3)中的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，合格后，采用直接测序法进行测序。

本发明的第七目的是提供含有所述的特异性引物对的试剂盒，所述的试剂盒能够检测高山美利奴羊羊毛纤维直径。

本发明的第八目的是提供所述的试剂盒在高山美利奴羊辅助育种中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记，检测高山美利奴羊基因组Oar_v4.0版本第7号染色体上第44288858个位点的碱基；当碱基为A时，基因型为AA；当碱基为G时，基因型为AG或GG；所述基因型AA和AG型的高山美利奴羊个体的羊毛纤维直径显著小于GG基因型个体(p<0.05)，AA和AG基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。通过检测高山美利奴羊基因组Oar_v4.0版本第7号染色体上第44288858个核苷酸位点的碱基，能够判断高山美利奴羊的羊毛纤维直径，为高山美利奴羊超细型的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊超细品系早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够增加高山美利奴羊羊毛纤维直径的遗传进展，采用与羊毛纤维直径性状相关的分子标记进行羊毛纤维直径优良性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选纤维直径细的高山美利奴羊，提高品种甄选的精确度，减少高山美利奴羊羊毛纤维直径优良性状的育种时间，降低育种成本，缩短培育周期，加快培育进程，具有很高的应用价值。

附图说明

图1高山美利奴羊第7号染色体上第44288858个核苷酸位点PCR电泳检测

1～7泳道为高山美利奴羊第7号染色体上第44288858个核苷酸位点的PCR产物；M：DL2000DNA marker

图2高山美利奴羊第7号染色体上第44288858个核苷酸位点的测序结果

A为AA基因型，B为AG基因型，C为GG基因型

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明所述的SNP是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

本发明所述的PIC是指多态信息含量。

本发明所述的OD260/280值指260nm和280nm下吸光光度比值。OD是opticaldensity(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD＝lg(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。

本发明所述的QTL是quantitative trait locus的缩写，中文可以翻译成数量性状座位或者数量性状基因座，它指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置。

实施例1高山美利奴羊不同基因型与羊毛纤维直径之间的相关性

1材料

1.1样品采集

甘肃省绵羊繁殖技术推广站采集109只高山美利奴羊血样，每只羊静脉采血5mL于加入EDTA-K2抗凝剂的采血管中，血样采集完毕后迅速混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于-20℃冰箱冷冻保存，用以DNA的提取。同时采取每只羊的羊毛样品，选取高山美利奴羊体测部用剪刀贴近皮肤处剪下不少于30g毛样，分别装入自封袋中送往农业农村部动物毛皮及制品质量监督检验测试中心进行羊毛纤维直径检测。

1.2主要试剂及仪器

EDTA-K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计美国Thermo FisherScientific公司；DL2000Marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；Premix Taq购自宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)；核酸蛋白检测仪购于Quawell公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；PCR仪购自BioRad公司。

2方法

2.1血液基因组DNA的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，将提取出的DNA置于紫外分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μL、OD260/OD280在1.7-1.9之间即满足实验需要，存放于-20℃保存备用。

2.2引物设计

以SEQ ID No:1所示的、含有SNP分子标记的核苷酸序列为模板，利用primerpremier5.0软件设计一对特异性引物，包含所述的SNP位点。

引物序列：

F：5'-AAATGAACAGCAGCAATC-3'；

R：5'-AACAGTGGCAATGGAAGA-3'。

扩增片段长度241bp，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

2.3PCR扩增与测序

PCR扩增体系25μL：Premix Taq 12.5μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 9.5μL。

PCR扩增程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃延伸10min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用直接测序法进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

由北京擎科新业生物技术有限公司完成测序。利用生物分析软件MEGA 6.0等对PCR产物测序结果进行比对，分析测序峰图，完成分型。

2.4统计分析

根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用Popgen32软件计算所述SNP位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、位点杂合度(He)、Hardy-Weinberg平衡检验，利用PIC计算软件计算多态信息含量。采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与羊毛纤维直径的关联性，结果以“平均值±标准误”表示。

3结果

3.1PCR扩增及测序结果

用1.5％琼脂糖凝胶检测高山美利奴羊第7号染色体所述SNP位点扩增产物(见图1)，条带清晰无杂带，特异性良好，PCR产物片段大小为241bp符合预期大小，可以进行下一步实验。

PCR产物经纯化并测序后所得到的峰图及序列见图2。由图2可知，所述SNP位点发生A-G突变，存在AA、AG、GG三种基因型。

3.2统计分析结果

从群体遗传学角度对高山美利奴羊第7号染色体所述SNP位点的基因型频率(Genotype frequency)和等位基因频率(Gene frequency)进行分析。由表1可见，在所述SNP位点上，AG基因型频率最高，为优势基因型，G等位基因频率为54％，表现为优势等位基因。由χ²适应性检验表明，SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.497，多态信息含量(polymorphism information content，简称PIC)为0.373，0.25＜PIC＜0.50，属于中度多态。

表1高山美利奴羊第7号染色体g44288858A>G SNP位点多态性

3.3不同基因型与羊毛纤维直径的关联分析

采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与羊毛纤维直径的关联性，AA和AG基因型的高山美利奴羊个体的羊毛纤维直径显著小于GG基因型个体(p<0.05)，AA和AG基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。通过检测高山美利奴羊高山美利奴羊第7号染色体所述SNP位点的碱基，能够判断高山美利奴羊的羊毛纤维直径。结果见表2。

表2高山美利奴羊不同基因型与羊毛纤维直径之间的相关分析

注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

综上所述，本发明所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第7号染色体上第44288858个碱基处；变异类型为A/G，存在三个基因型，当所述的第7号染色体上第44288858个碱基为A时，基因型为AA；当所述的第7号染色体上第44288858个碱基为G时，基因型为AG或GG；通过不同基因型与羊毛纤维直径的关联分析，发现所述AA和AG基因型的高山美利奴羊个体的羊毛纤维直径显著小于GG基因型个体，P<0.05；AA和AG基因型个体间未表现出显著差异，P>0.05。通过检测高山美利奴羊第7号染色体上第44288858个核苷酸位点的碱基，能够判断高山美利奴羊的羊毛纤维直径，为高山美利奴羊超细型的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊超细品系早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。

通过所述的特异性引物对，可以检测高山美利奴羊的羊毛粗细形状，通过高山美利奴羊的羊毛粗细进而筛选出具有毛肉兼用型的，也可以将制备含有该引物对的试剂盒，进而建立高效准确的分子标记辅助育种技术，采用与羊毛纤维直径性状相关的分子标记进行羊毛纤维直径优良性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选纤维直径细的高山美利奴羊，提高品种甄选的精确度，减少高山美利奴羊羊毛纤维直径优良性状的育种时间，降低育种成本，缩短培育周期，加快培育进程，具有很高的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

<120> 一种影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 绵羊(ARIET IS.)

<400> 1

ctgaaatata ttagccatgg taagttgagt atctcacttt aaaattccac ctgccagtca 60

agccaaccat ttctgcttcc agcccatctg ccatggttct accgtgagag acgggtccct 120

gcatacaagg actcctgaac caggcggggc cgccccgtct tcagtccttg ttattgttca 180

gtcgctaagt tgtgtctctg cagccccatg ggctgtagca caccagcctt ccctgtcctt 240

ctctatctcc cagagtcttc agccctaggc agccatgttt gagccacgat tcagaaggga 300

ggacccagct gacatccctg tcatgtgcca atcagggttg aacatcacta acttcctaaa 360

aatgaacagc agcaatctga ctgcccggga ccagccctta atgcttcagt gtgatgagca 420

tggacagagc cctccatgct aacatgggcc ttggggcctc aggctccttt gggaacctcc 480

tatgttcatg gacatgcatc atctgggtca attcttttct tttttttcgg atctaggtca 540

gttctagtct gaccatgtgt aatatcccag aaattacaaa tctcttccat tgccactgtt 600

tggcccaccc acacctgtca gaatgtgtct ctagacttct gacaagaaac cccagcccag 660

ggacttccct ggtgatccag tggttaacaa actgagcttc caatgcaggg ggtgagggtt 720

ccatacctag tcagggaact aagattccac atgccatgtg gtatggtatg gccaaaaata 780

aaattaaaaa aaagaaaaga aaagaaactc ccagaccatg taggcaggca agagccaggc 840

agcggtctta aggatactgc ctgtaggttt tcgtttcttc tttgtgtgag aactaagcac 900

aatggcaacc aaggttggag tcattaaaaa caggacacaa gaacccaagt cttcgccact 960

aaaacccaac agaactgctc atctctactg cttcccagat g 1001

<210> 2

<211> 241

<212> DNA

<213> 绵羊(ARIET IS.)

<400> 2

aaatgaacag cagcaatctg actgcccggg accagccctt aatgcttcag tgtgatgagc 60

atggacagag ccctccatgc taacatgggc cttggggcct caggctcctt tgggaacctc 120

ctatgttcat ggacatgcat catctgggtc aattcttttc ttttttttcg gatctaggtc 180

agttctagtc tgaccatgtg taatatccca gaaattacaa atctcttcca ttgccactgt 240

t 241

Claims (2)

1.一种检测影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记的检测试剂在检测高山美利奴羊羊毛粗细性状的应用，其特征在于，所述的SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第7号染色体上第44288858个位点的碱基处；突变碱基为A或G。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测影响高山美利奴羊羊毛纤维直径的SNP分子标记的检测试剂包含特异性引物对，所述的特异性引物对的核苷酸序列如下所示：

F：5'-AAATGAACAGCAGCAATC-3'；

R：5'-AACAGTGGCAATGGAAGA-3'。

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