CN112430669B - 一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊羊毛直径细度离散的SNP分子标记及其应用，所述的影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第15593201个核苷酸位点A/G突变。本发明还提供用于鉴定上述SNP分子标记的特异性引物对及含有该特异性引物对的试剂盒，可以用于高山美利奴羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程，且试剂盒具有操作简单的优点，减少高山美利奴羊羊毛直径离散优良性状的育种时间，降低育种成本，缩短培育周期，加快培育进程，具有很高的应用价值。

Description

一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记及其应用。
背景技术
羊毛纤维直径是决定其价值的一个主要方面，它与其经济性状关系非常密切，对羊毛生产、加工、贸易有着重要影响，决定了羊毛的经济价值和纺纱性能。而羊毛纤维细度变异占羊毛总利润的61％,直接影响着毛纱和织物品质。细度离散是反映纤维细度的分布或分散情况，产生原因主要与羊的品种、饲养管理、自然环境以及羊毛的生产、加工，流通等有关。控制羊毛细度离散的措施有选种与选育，羊毛的分级整理，改善环境，制定营养的饲养管理方法等。SNP是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。SNP分子标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点。本领域技术人员通过定位和功能基因组技术筛选与细毛羊重要性状相关的分子遗传标记，分析分子遗传标记对候选性状的遗传效应，探讨对候选性状的分子遗传基础；应用SNP标记进行基因组扫描，定位影响羊毛生长发育与细度和生长期变化、抗病性能相关的分子标记，进一步分离具有重要遗传效应的功能基因；建立和优化标记(基因)辅助选择与标记辅助导入聚合育种的方法，通过以上筛选的分子标记，建立各种辅助标记选择模型，并对可能获得的后代进行个体育种值的评分，选择适合性状的标记基因型或单倍型，在育种群体内展开育种选择和杂交导入；建立优良基因从供体高效导入到受体的方法，并进行杂交后代的测定，验证分子标记辅助选择，进而培育具有特定形状的高山美利奴羊。
针对上述技术问题，本发明提供了一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记及其应用，其主要目的是为了培育符合养殖需求的高山美利奴羊新品种，也为细毛羊分子标记辅助育种提供依据，加强高山美利奴羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记，所述的SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第15593201位点的碱基处；突变碱基为A或G。
本发明的第二目的是提供一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记，含有所述的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位，突变碱基为A或G。
本发明的第三目的是所述的SNP分子标记在高山美利奴羊育种中的应用。
优选地，当所述的SNP分子标记碱基为A时，基因型为AA；当所述的SNP分子标记碱基为G时，基因型为AG或GG；
所述的SNP位点的AA基因型和AG基因型的细毛羊的羊毛纤维直径显著小于GG基因型。
用于检测所述的SNP分子标记的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如下所示：
F：5'-AACTCTGCTCCCAACCAATG-3'；
R：5'-GACAGGGTCTACAAGAAATG-3'。
含有所述的特异性引物对的试剂或者试剂盒。
所述的特异性引物对在检测高山美利奴羊羊毛直径离散程度中的应用。
利用所述的特异性引物对检测高山美利奴羊羊毛直径离散程度的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)提取待测高山美利奴羊血液基因组DNA；
(2)利用如权利要求5所述的特异性引物对将步骤(1)获得的待测高山美利奴羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位，突变碱基为A或G；
(4)根据步骤(3)获得的测序结果，确定待测高山美利奴羊血液的所述SNP分子标记的基因型；
(5)依据步骤(4)获得的SNP分子标记的基因型判定高山美利奴羊羊毛直径离散程度。
优选地，所述的步骤(2)中的PCR扩增体系25μL：金牌Mix(green)22μL，上、下游引物各1μL，模板1μL；PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，56℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸1min。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记，所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第15593201个碱基处；变异类型为A/G，存在三个基因型，当所述的第22号染色体上第15593201个碱基为A时，基因型为AA；当所述的第22号染色体上第15593201个碱基为G时，基因型为AG或GG；通过不同基因型与羊毛直径离散的关联分析，发现所述AA和AG基因型的高山美利奴羊羊毛直径离散显著小于GG基因型个体，P<0.05；AA和AG基因型个体间未表现出显著差异，P>0.05。通过检测高山美利奴羊第22号染色体上第15593201个核苷酸位点的碱基，能够判断高山美利奴羊羊毛直径离散，为高山美利奴羊羊毛直径离散的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够增加高山美利奴羊羊毛直径离散的遗传进展，采用与羊毛直径离散相关的分子标记进行羊毛性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选羊毛直径离散低的高山美利奴羊，提高品种甄选的精确度，减少高山美利奴羊羊毛直径离散优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。
附图说明
图1高山美利奴羊第22号染色体上第15593201个核苷酸位点PCR电泳检测
图2高山美利奴羊第22号染色体上第15593201个核苷酸位点的测序结果
A为AA基因型，B为AG基因型，C为GG基因型
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所述的SNP是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
本发明以下实施例中所述的多态信息含量：polymorphism informationcontent，简称PIC；
本发明以下实施例所述的基因型频率：Genotype frequency；
本发明以下实施例所述的等位基因频率：Gene frequency；
本发明以下实施例所述的杂合性又称群体的平均杂合性或杂合度，它是群体遗传变异的另一个度量参数，是指某一基因座上的等位基因是杂合体的频率。
实施例1高山美利奴羊不同基因型与羊毛直径离散之间的相关性
1材料
1.1样品采集
样品来自甘肃省绵羊繁殖技术推广站，采集具有生产记录的228只高山美利奴羊血样，每只羊静脉采血5mL于加入EDTA-K2抗凝剂的采血管中，血样采集完毕后迅速混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于-20℃冰箱冷冻保存，用以DNA的提取。每只羊羊毛直径离散由农业农村部动物毛皮及制品质量监督检验测试中心(兰州)测定。
1.2主要试剂及仪器
EDTA-K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计美国Thermo FisherScientific公司；DL2000 Marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；金牌Mix(green)购自北京擎科新业生物技术有限公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；PCR仪购自BioRad公司。
2方法
2.1血液基因组DNA的提取
采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，将提取出的DNA置于紫外分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μL、OD260/OD280在1.7-1.9之间即满足实验需要，存放于-20℃保存备用。
2.2引物设计
参考国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体基因序列(GenBank登录号：NC_019479.2)，SNP标记位于第15593201位，利用primer premier5.0软件设计一对特异性引物，包含所述的SNP位点。
引物序列：
F：5'-AACTCTGCTCCCAACCAATG-3'；
R：5'-GACAGGGTCTACAAGAAATG-3'。
扩增片段长度292bp，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
2.3PCR扩增与测序
PCR扩增体系25μL：金牌Mix(green)22μL，上、下游引物各1μL，模板1μL。
PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，56℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸1min。
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用直接测序法进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，SNP标记位于SEQ ID No:1所示核苷酸序列的47位。
由北京擎科新业生物技术有限公司完成测序。利用生物分析软件Vector NTIadvance11.5软件对PCR产物测序结果进行比对，分析测序峰图，完成分型。
2.4统计分析
根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用Popgen32软件计算所述SNP位点的基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、位点杂合度(He)、Hardy-Weinberg平衡检验，利用PIC计算软件计算多态信息含量。采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与羊毛直径离散的关联性，结果以“平均值±标准差”表示。
3结果
3.1 PCR扩增及测序结果
用1.5％琼脂糖凝胶检测高山美利奴羊第22号染色体所述SNP位点扩增产物(见图1)，条带清晰无杂带，特异性良好，PCR产物片段大小为292bp符合预期大小，可以进行下一步实验。
PCR产物经纯化并测序后所得到的峰图及序列见图2。由图2可知，所述SNP位点发生A-G突变，存在AA、AG、GG三种基因型。
3.2统计分析结果
从群体遗传学角度对高山美利奴羊第22号染色体所述SNP位点的基因型频率(Genotype frequency)和等位基因频率(Gene frequency)进行分析。由表1可见，在所述SNP位点上，AG基因型频率最高，为优势基因型，A等位基因频率为57％，表现为优势等位基因。由χ2适应性检验表明，SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.490，多态信息含量为0.370，0.25＜PIC＜0.50，属于中度多态。
表1高山美利奴羊羊毛羊第22号染色体g15593201A>G SNP位点多态性
Figure BDA0002799730600000051
3.3高山美利奴羊不同基因型与羊毛直径离散的关联分析
采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊不同基因型与羊毛直径离散的关联性，AA和AG基因型的高山美利奴羊羊毛直径离散显著小于GG基因型个体(p<0.05)，AA和AG基因型个体间并未表现出显著差异(p>0.05)。通过检测高山美利奴羊第22号染色体所述SNP位点的碱基，能够判断高山美利奴羊羊毛直径离散，结果见表2。
表2高山美利奴羊不同基因型与羊毛直径离散之间的相关分析
Figure BDA0002799730600000052
Figure BDA0002799730600000061
注：同一行数据间标有不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
综上所述，本发明所述的SNP分子标记位于国际绵羊参考基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第15593201个碱基处；变异类型为A/G，存在三个基因型，当所述的第22号染色体上第15593201个碱基为A时，基因型为AA；当所述的第22号染色体上第15593201个碱基为G时，基因型为AG或GG；通过不同基因型与羊毛直径离散的关联分析，发现所述AA和AG基因型的高山美利奴羊羊毛直径离散显著小于GG基因型个体，P<0.05；AA和AG基因型个体间未表现出显著差异，P>0.05。通过检测高山美利奴羊第22号染色体上第15593201个核苷酸位点的碱基，能够判断高山美利奴羊羊毛直径离散，为高山美利奴羊羊毛直径离散的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。
通过所述的特异性引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，通过优选该SNP分子标记的优势等位基因，能够增加高山美利奴羊羊毛直径离散的遗传进展，采用与羊毛直径离散相关的分子标记进行羊毛性状甄选时，具有操作简单的优点，可以辅助筛选羊毛直径离散低的高山美利奴羊，提高品种甄选的精确度，减少高山美利奴羊羊毛直径离散优良性状的育种时间，降低育种成本，增加核心竞争。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
<120> 一种影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 292
<212> DNA
<213> 绵羊(ARIET IS.)
<400> 2
aactctgctc ccaaccaatg tcatctccct ttattttgtt gatgttataa atttcacctt 60
tatatctttt ctacctagaa cagctatttc taatgatttt tattcaattt tctattaaat 120
aatatagaag agtttttata ctaggataca ataatattag ctttagtatt tacttacctt 180
attattttta acaaaaatat ttatttgtca ttctgggttt gaattatcat gtaatacatt 240
tttattttaa actgaaaggt gattcccttt agcatttctt gtagaccctg tc 292

Claims (5)

1.一种检测影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记的检测试剂在检测高山美利奴羊羊毛直径离散程度中的应用，其特征在于，所述的SNP分子标记位于国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第22号染色体上第15593201位点的碱基处；突变碱基为A或G。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述的SNP分子标记碱基为A时，基因型为AA；当所述的SNP分子标记碱基为G时，基因型为AG或GG；所述的SNP位点的AA基因型和AG基因型的细毛羊的羊毛纤维直径显著小于GG基因型。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测影响高山美利奴羊羊毛直径离散的SNP分子标记的检测试剂包含特异性引物对，所述的特异性引物对的核苷酸序列如下所示：
F：5'-AACTCTGCTCCCAACCAATG-3'；
R：5'-GACAGGGTCTACAAGAAATG-3'。
4.一种检测高山美利奴羊羊毛直径离散程度的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)提取待测高山美利奴羊血液基因组DNA；
(2)利用如权利要求3所述的特异性引物对将步骤(1)获得的待测高山美利奴羊血液的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行测序，扩增的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的SNP分子标记位于第47位，突变碱基为A或G；
(4)根据步骤(3)获得的测序结果，确定待测高山美利奴羊血液的所述SNP分子标记的基因型；
(5)依据步骤(4)获得的SNP分子标记的基因型判定高山美利奴羊羊毛直径离散程度。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的PCR扩增体系25μL：含green染料的金牌Mix 22μL，上、下游引物各1μL，模板1μL；PCR扩增程序：98℃2min；94℃10s，56℃10s，72℃10s，共30个循环；72℃延伸1min。
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