CN102363813A - 一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，主要包括以下步骤：根据绵羊KAP1.1基因序列设计一对引物；从绵羊血液中提取基因组DNA，利用该引物对绵羊的基因组DNA进行PCR扩增；使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出KAP1.1基因外显子中的60bp和30bp插入/缺失的变异位点；多态性分析。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明不仅为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为绵羊的细度性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速优质细毛羊的育种进程。

Description

一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法

技术领域

本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用分子标记检测绵羊毛纤维直径的方法。

背景技术

我国是一个农业大国，畜牧业是我国农业的重要组成部分，畜牧业在国民经济中占有举足轻重的地位。据统计，2010年畜牧业收入的增长速度已超过种植业，成为农民收入的主要来源之一。大力发展畜牧业仍然是我国农业产业结构调整、农业和农村经济发展以及农民增收的重点。

养羊业是我国畜牧业的传统产业，细毛羊在我国养羊业中占重要位置，细毛羊是兵团畜牧业的主要畜种，也是兵团畜牧经济中最具特色和代表性的优势产业。我国人口众多，又是世界服装出口大国，细毛羊业的发展与我国畜牧业和纺织业的经济效益和市场竞争力密切相关，影响着区域经济的发展和社会稳定。培育成功的中国美利奴细毛羊享誉国内外。细毛羊业的发展为优化兵团农业结构，促进毛纺工业发展，提高畜牧业整体效益，以及加快养羊良种化进程都做出了重大贡献。

我国是世界上消耗羊毛最多的国家，羊毛的自给率仅为1/3，供求缺口很大，每年需要从国外进口大批细羊毛，总价值达到60亿美元左右，其中大部分是细绵羊毛和超细绵羊毛。近年来，随着毛纺产品向自然、舒适、轻薄、柔软的方向发展，世界羊毛品质也出现了划时代的变革，主要表现在羊毛细度上。中国对进口羊毛品质和细度的要求越来越高，我国和澳大利亚双边羊毛贸易的品质结构以羊毛细度作为标准，羊毛细度是体现加工价值的一个重要的指标，过去毛纺部门需求毛细度以60～64 支为主，近年来66～70支羊毛的需求不断增加，羊毛越细，加工附加值越高。

中国美利奴羊（新疆军垦型）的培育从1972年开始，刘守仁等在新疆生产建设兵团协作组以紫泥泉种羊场为育种场在短期内通过级进杂交方法成功培育中国美利奴羊（新疆军垦型）。分为六个品系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、毛用多胎品系、U品系。A品系具有体格大，产毛量高，毛密的特点。B品系具有毛长，羊毛品质好的特点。超细毛品系具有毛细的特点，主体细度达到15～18μm（80～90支）。肉用多胎品系兼具肉品质好和繁殖率高的特点。毛用多胎品系兼具毛品质好和繁殖率高的特点。截止2002年已向全国23个省、自治区推广优质种羊12万只，为我国细毛羊事业的发展和改良工作做出了重大贡献。但是，如何进一步提高羊毛细度，培育超细毛种羊，以及快速扩大种群规模仍然是一个重要问题。分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性别、环境的干扰，实现早期、快速、准确的选择优质细毛羊，组建并扩大优质细毛羊种群。因此，寻找羊毛细度（毛纤维直径）相关基因及分子标记，应用现代分子育种新技术快速培育超细毛羊、快速扩大优质细毛羊种质规模势在必行。

研究表明，羊毛纤维的复杂结构主要由角蛋白家族组成。这些蛋白对于羊毛纤维的机械性能和主要构造起主要作用。羊毛纤维主要由三部分组成：角质层、皮质层和一少部分有髓粗毛组成。羊毛纤维的90%由皮质层组成，皮质层由嵌入角蛋白关联蛋白-KAPs里面的丝状的微纤维组成。微纤维包括角蛋白中间丝蛋白，而角蛋白中间丝蛋白是我们已知的“硬”ａ-角蛋白。这些角蛋白是低硫蛋白，由两个蛋白家族构成，分别是Ⅰ型角蛋白和Ⅱ型角蛋白。 根据氨基酸组成，KAPs分成三类：高硫角蛋白关联蛋白（KAP1.n、KAP2.n、KAP3.n），超高硫角蛋白关联蛋白（KAP4.n、KAP5.n、KAP10.n）和高甘氨酸-酪氨酸角蛋白关联蛋白（KAP6.n、KAP7.n、KAP8.n）。KAP基因大多为小片段，大小一般在0.6Kb～1.5Kb之间，并且都不含内含子。

在羊毛纤维蛋白中有很多变异，尤其对于基质蛋白，尽管在数千年针对羊毛纤维的品质选育中，变异逐渐减少，但是，毛纤维异质性仍然存在。很多研究报道角蛋白和KAP基因家族存在多态性。角蛋白及亚家族编码基因存在多个插入／缺失和单核苷酸（SNP）突变，这些基因多样性与羊毛性状（细度、强度、弹性和弯曲度等）存在相关关系（管峰等，2007）。羊毛细度是一个高遗传力性状，达到0.59，但在不同绵羊品种间略有差异（Safari等，2007），同时羊毛纤维的细度是一个复杂的调控过程，受到多种影响因素的调控和制约，与体重、体脂含量、繁殖率等也存在相互制约关系。最近在KAP1.1、KAP1.3基因编码区发现了多个SNP位点，但是和羊毛性状之间的关系尚需进一步研究（Itenge-Mweza等，2007）。刘桂芬等（2005）用微卫星标记对新疆优质细毛羊进行专门的遗传多样性及羊毛细度候选基因进行分析，选择21号染色体上高硫蛋白家族中KAP1.1、KAP1.3中的部分序列和1号染色体高甘氨酸一酪氨酸蛋白KAP6.1的外显子进行研究，结果发现KAP1.1、KAP1.3所在区域中位点W08667与羊毛细度相关（P<0.05）。张亚妮等研究了KAP基因与内蒙古绒山羊经济性状的关系得出KAP基因的部分位点与绒细度存在相关。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低、精确度高的采用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测绵羊毛纤维直径，从而预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法。

本发明通过以下技术方案实现：  

一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征主要包括以下步骤：

（1）根据绵羊KAP1.1基因序列设计一对引物：

KF1: <210>1；

KR1: <210>2。

（2）从绵羊血液中提取基因组DNA，利用该引物对绵羊的基因组DNA进行PCR扩增；

（3）使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出KAP1.1基因外显子中的60bp和30bp插入 / 缺失的变异位点；

（4）多态性分析：当绵羊KAP1.1基因外显子缺失60bp时，PCR扩增片段长度为281bp，将其命名为CC基因型；当绵羊KAP1.1基因外显子缺失30bp时，PCR扩增片段长度为311bp，将其命名为BB基因型；当绵羊KAP1.1基因外显子含有60bp和30bp插入时，PCR扩增片段长度为341bp，将其命名为AA基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带，分别为341bp和311bp，将其命名为AB基因型；341bp和281bp，将其命名为AC基因型；311bp和281bp，将其命名为BC基因型。

实验证明具有BB基因型绵羊的平均毛纤维直径显著小于具有AA、BC、AC、AB和CC基因型绵羊的平均毛纤维直径（P<0.05）。

其中用于分析多态性的位点选自绵羊KAP1.1基因如下序列中的60个和30个碱基的插入/缺失，

1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg

       61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg

      121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat

      181 ccagaccagc tgctgccaac cga(tctccat ccagaccagc tgctgccagc caa)cctccat

      241 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg

      301 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g，

以上序列下划线部分为60个碱基的插入/缺失，单划线部分为30个碱基的插入/缺失。

其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型,其中用于分析基因多态性的部位是外显子。而且是由KF1和KR1表示的引物扩增的部分外显子区。

其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12%或14%任一种均可。

所述的PCR扩增退火温度最好为65℃。其中绵羊毛纤维直径是绵羊的毛细度。

本发明巧妙地采用PCR扩增和凝胶分离的方法检测绵羊KAP1.1基因外显子中的60bp和30bp插入/缺失的变异位点。由于AA基因型和BB基因型的KAP1.1基因片段长度仅差30个碱基，由于BB基因型和CC基因型的KAP1.1基因片段长度也仅差30个碱基，使用琼脂糖凝胶电泳很难将两种基因型分离，因此本发明采用12%或14%的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离六种基因型。按照以下步骤：

从绵羊血液中提取基因组DNA，应用KF1和KR1引物进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，根据条带进行基因型判定，并根据基因型，与绵羊毛纤维直径进行关联分析的应用。

与现有技术相比，本发明的优点：本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的标记基因型对绵羊的毛纤维直径进行选择时，将使绵羊毛纤维直径取得很大的遗传进展。利用本发明的分子标记方法对毛纤维直径进行选择，不仅为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为绵羊的细度性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速优质细毛羊的育种进程。

附图说明

图1：是本发明的技术流程图。

图2：绵羊KAP1.1基因PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图中：聚丙烯酰胺凝胶浓度为14%。M泳道：pUC 19DNA/Msp（HapII）Marker；泳道1：CC基因型个体；泳道2、3：AB基因型个体；泳道4、5、12、13：BC基因型个体；泳道6、7、8、9、10：BB基因型个体；泳道 11、14：AC基因型个体；泳道15、16：AA基因型个体。箭头所指为331bp的条带。

图3：为3个分子标记在群体中不同基因型展示图。其中，A为AA基因型位点，B为BB基因型位点，C为CC基因型位点。

具体实施方式

实施例1：下面举例对本发明做更详细地描述：

一、 实验材料

1、样品采集和性状测定

采用一次性注射器从绵羊颈静脉抽取约1ml的血液，注入经高压灭菌并装有约200μl 2%无菌EDTA（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录羊号，-20℃保存备用。

采集绵羊体侧部皮肤毛样，根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织（IWTO）纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行细度、卷曲度、细度离散、自然长度、污毛量、密度、净毛率的测定。

2、药品和酶

三羟甲基氨基甲烷（Tris），Sigma Chemicals Co；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K（Proteinase K），MERCK Co；dNTP（dATP; dTTP; dCTP; dGTP）、Taq酶（配套 10×Taq buffer，25 mmol／L Mg²⁺ ），大连宝生物公司；琼脂糖（Agarose H）、pUC19DNA／Msp（HapⅡ） Marker、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，生工生物（上海）有限公司。

3、主要仪器

Icycler PCR仪（Bio-Rad公司）、梯度PCR仪（Eppendorf公司）、Gel2000凝胶成像系统、Ultrospec 1000紫外分光光度计、Sigma 3K30高速冷冻离心机、Milli-Q超纯水仪、Bio-Rad稳压电泳仪及配套电泳槽。

二、实验方法

1、缓冲液与常用试剂的配制

TE缓冲液：10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高压灭菌。

20×SET 缓冲液：3M NaCl，1M Tris·Cl （pH 8.0）， 20mM EDTA（pH 8.0），高压灭菌。

5×TBE缓冲液：54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA （pH8.0），加水至1L。

50×TAE缓冲液：242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5M EDTA（pH8.0），加水至1L。

1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5M EDTA：186.1g EDTA溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

3M NaAc（pH5.2）：408.1g NaAc·3H₂O 溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml。

200ml银染液：NH₃·H₂O 2ml; 3.6% NaOH 4.2ml；20% AgNO₃ 3.6ml，加去离子水至200ml。

200ml 显色液：1%柠檬酸钠1ml；甲醛100ul；加去离子水至200ml。

血细胞裂解液：10mM Tris·Cl（pH8.0），0.1M EDTA（pH8.0），0.5% SDS。

2、引物的设计与合成

根据KAP1.1基因序列（GenBank登录号：AY835603）设计上游引物KF1和下游引物KR1，引物由生工生物（上海）有限公司合成：

KF1: <210>1；

KR1: <210>2。

3、绵羊基因组DNA的小量提取

（1）取20μl抗凝血液，加入500μl血细胞裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200 μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。

（2）将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5 M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。

（3）12，000 rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。

（4）12，000 rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

（5）将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70%乙醇洗1次。

（6）7,500 rpm，室温离心5min，弃上清。

（7）将DNA干燥后（注意不能太干）溶于200μl TE中。

4、PCR反应

（1）以绵羊基因组DNA为模板进行PCR扩增，25μl反应体系中包含以下溶液或试剂：

    10×PCR reaction buffer          2.5μl

    dNTP Mixture（各2.5mM）        2.0μl

    引物1（10μM）                  0.5μl

    引物2（10μM）                  0.5μl

    EX-Taq（5U/μl）                 0.25μl

    去离子水                       18.25μl

    基因组DNA（50ng/μl）            1.0μl

（2）将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。

94℃变性5 min；94℃ 30 sec，65℃ 30 sec，72℃ 30 sec，33个循环；72℃延伸5 min。

 （3）反应结束后，取PCR反应液（5~10μl）进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。

5、非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳

以浓度为14%、体积为25ml，厚度为0.1cm的胶为例。

（1）清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。

（2）在100ml烧杯内加入30%丙烯酰胺11.7ml，50%甘油2.5ml，5×TBE 5ml，10%过硫酸铵0.175ml，TEMED 8μl，去离子水5.617ml，混匀后迅速灌胶。

（3）当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4℃保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。

（4）凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。

（5）预电泳10min，同时准备点样。

（6）取2μl PCR产物置于PCR管中，加2μl上样Buffer混匀，用微量注射器点样。

（7）120V，电泳8~10h。

6、硝酸银染色方法

（1）电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10~15min。

（2）双蒸水洗胶2遍，每次2min，去除残留乙醇。

（3）用200ml染色液染色30min。

（4）双蒸水洗胶3遍，每次2min。

（5）用200ml显色液显色，约10~30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。

（6）去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。

7、基因型判定

经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，KAP1.1基因在绵羊群体存在六种基因型，对于PCR扩增片段长度为281bp，将其命名为CC基因型；对于PCR扩增片段长度为311bp，将其命名为BB基因型；对于PCR扩增片段长度为341bp，将其命名为AA基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带，分别为341bp和311bp，将其命名为AB基因型；341bp和281bp，将其命名为AC基因型；311bp和281bp，将其命名为BC基因型。（附图）。

8、统计模型建立

根据中国美利奴羊品系选育的特点，构建线性统计模型如下：

 Y_ijkm= μ+ G _i+ L _j+ A_m+G_i×L_j+ G_i×A_m + L_j×A_m + e

其中：Y_ijkm为性状观察值，μ为群体性状均值，G _i为基因型固定效应，L _j为品系固定效应，A_m为年龄效应。G_i×L_j为基因型和品系互作效应，G_i×A_m为基因型和年龄互作效应，L_j×A_m为品系和年龄互作效应，e为随机误差。使用统计软件JMP 4.0（SAS Institute Inc.，Cary，NC，2000）检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。

本实施例是运用本发明的分子标记选择方法在中国美利奴（新疆军垦型）5个品系群体羊毛细度性状的选择应用。

具体为：选用中国美利奴羊（新疆军垦型）5个品系，共计768只，其中超细型品系158只，毛用多胎型品系138只，军垦A型品系167只，军垦B型品系163只，肉用多胎型品系142只。采集绵羊颈静脉血液样本，-20℃保存备用。

同时采集绵羊体侧部皮肤毛样，根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织（IWTO）纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行自然长度、细度、细度离散、卷曲度、污毛量、净毛率、密度的测定，按照细毛羊鉴定标准测定生产性能。其中，羊毛的细度和卷曲度在农业部种羊及羊毛羊绒质量监督检验测试中心（乌鲁木齐）检测。

利用本发明的引物（KF1和KR1）对中国美利奴（新疆军垦型）群体768个个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

KAP1.1基因的PCR产物经电泳分离得到6种基因型，分别为AA基因型、AB基因型、AC基因型、BB基因型、BC基因型、CC基因型。对KAP1.1基因60bp和30bp插入 / 缺失的变异位点的6种基因型在中国美利奴（新疆军垦型）5个品系群体中的分布进行分析，结果表明BB基因型个体最多，基因型频率为0.548。（表1）

表1  KAP1.1 基因插入 / 缺失位点不同基因型在绵羊群体中的分布

                                                          单位：只

品系	AA	AB	AC	BB	BC	CC	总计
								超细型品系	3	11	1	110	32	1	158
毛用多胎型品系	10	44	20	20	38	6	138
								A型品系	1	27	5	111	20	3	167
B型品系	3	17	7	84	48	4	163
								肉用多胎型品系	3	24	2	96	11	6	142
总计	20	123	35	421	149	20	768
								基因型频率	0.026	0.160	0.046	0.548	0.194	0.026

对KAP1.1基因60bp和30bp插入 / 缺失的变异位点的6种基因型与中国美利奴（新疆军垦型）群体768个个体的羊毛纤维直径等7个性状进行最小二乘分析，结果表明不同基因型间的中国美利奴（新疆军垦型）群体的平均羊毛纤维直径存在显著差异（P<0.05）（表2）。均值比较时同一行无相同字母者差异显著 （a-b p<0.05）。

 

表2  KAP1.1 基因位点不同基因型绵羊毛性状的比较（最小二乘均值）

对6种基因型间中国美利奴（新疆军垦型）群体毛品质的最小二乘均值进行多重比较，AA、BB、BC、AC、AB和CC基因型间的毛卷曲度、细度离散、自然长度、污毛重、净毛率和密度差异不显著（P>0.05），而BB基因型羊只的平均纤维直径显著小于AA、BC、AC、AB和CC基因型羊只的平均纤维直径（P<0.05）。

以上结果表明，KAP1.1基因可作为绵羊毛纤维直径的主要候选基因之一，BB基因型可作为分子标记用于预测绵羊毛纤维直径，可以组建以BB基因型个体为主的毛细度较细的群体。

实施例2：

参照图1—图3：与实施例1相比，本实施例不同地方在于绵羊基因组DNA的小量提取：

（1）将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml 离心管中，轻轻混匀。

（2）加入蛋白酶K（10mg/ml）至终浓度100-200 μg/μl和10%的SDS 至终浓度0.5%，55℃消化12h。

（3）待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀。

（4）12,000 rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。

（5）向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比为24：23：1），混合10min。12,000 rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。

（6）向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液（23：1），来回颠倒混合10min，12,000 rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。

（7）向水相中加入1/10体积NaAc（3 M，pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。

（8）将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70%乙醇洗1次。

（9）7,500 rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。

（10）加入200 μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。

另一个不同地方在于用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12%。

本实施例是运用本发明的分子标记选择方法在中国美利奴（新疆军垦型）6个品系群体羊毛细度性状的选择应用。 

选用中国美利奴羊（新疆军垦型）6个品系，共计765只，其中超细型品系189只，毛用多胎型品系147只，军垦A型品系160只，军垦B型品系103只，肉用多胎型品系131只，U品系35只。采集绵羊颈静脉血液样本，-20℃保存备用。

采集绵羊体侧部皮肤毛样，根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织（IWTO）纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行自然长度、细度、细度离散、卷曲度、污毛量、净毛率、密度的测定，按照细毛羊鉴定标准测定生产性能。其中，羊毛的细度和卷曲度在农业部种羊及羊毛羊绒质量监督检验测试中心（乌鲁木齐）检测。

利用本发明的引物（KF1和KR1）对中国美利奴（新疆军垦型）群体6个品系765个个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

KAP1.1基因的PCR产物经电泳分离得到6种基因型，分别为AA基因型、AB基因型、AC基因型、BB基因型、BC基因型、CC基因型。对KAP1.1基因60bp和30bp插入 / 缺失的变异位点的6种基因型在中国美利奴（新疆军垦型）6个品系群体中的分布进行分析，结果表明BB基因型个体最多，基因型频率为0.55。（表3）

表3  KAP1.1 基因插入 / 缺失位点不同基因型在绵羊群体中的分布

                                                            单位：只

品系	AA	AB	AC	BB	BC	CC	总计
								超细型品系	4	17	2	128	37	1	189
毛用多胎型品系	10	46	18	30	39	4	147
								A型品系	1	22	7	107	20	3	160
B型品系	1	14	4	47	34	3	103
								肉用多胎型品系	2	21	3	88	10	7	131
U品系	-	3	1	21	9	1	35
								总计	18	123	35	421	149	19	765
基因型频率	0.024	0.161	0.045	0.550	0.195	0.025

对KAP1.1基因60bp和30bp插入 / 缺失的变异位点的6种基因型与中国美利奴（新疆军垦型）群体765个个体的羊毛纤维直径等7个性状进行最小二乘分析，结果表明不同基因型间的中国美利奴（新疆军垦型）群体的羊毛纤维直径存在显著差异（P=0.01）（表4）。表中所示，均值比较时同一行无相同字母者差异显著 （a-b p<0.05）。

 

表4  KAP1.1 基因位点不同基因型绵羊毛性状的比较（最小二乘均值）

对6种基因型间中国美利奴（新疆军垦型）群体毛品质的最小二乘均值进行多重比较，AA、BB、BC、AC、AB和CC基因型间的毛卷曲度、细度离散、自然长度、污毛重、净毛率和密度差异不显著（P>0.05），而BB基因型羊只的平均纤维直径显著小于AA、BC、AC、AB和CC基因型羊只的平均纤维直径（P<0.05）。

以上结果表明，KAP1.1基因可作为绵羊毛纤维直径的主要候选基因之一，BB基因型可作为分子标记用于预测绵羊毛纤维直径。可以组建以BB基因型个体为主的毛细度较细的群体。

<110> 新疆农垦科学院

<120> 一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法

<130>

<141> 2011-10-23

<160> 3

 

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

caaccctcct ctcaacccaa ctcc 24

 

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

cgctgctacc cacctggcca ta 22

 

<210> 3

<211> 341

<212> DNA

<213> 绵羊（Ovis aries）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(341)

<223>

<400> 3

caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg 60

atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg 120

ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat 180

ccagaccagc tgctgccaac cgatctccat ccagaccagc tgctgccagc caacctccat 240

ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg 300

cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g                     341

 

 

 

 

 

Claims (10)

1.一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征主要包括以下步骤：

（1）根据绵羊KAP1.1基因序列设计一对引物：

KF1: <210>1，

KR1: <210>2；

（2）从绵羊血液中提取基因组DNA，利用该引物对绵羊的基因组DNA进行PCR扩增；

（3）使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出KAP1.1基因外显子中的60bp和30bp插入 / 缺失的变异位点；

（4）多态性分析：当绵羊KAP1.1基因外显子缺失60bp时，PCR扩增片段长度为281bp，将其命名为CC基因型；当绵羊KAP1.1基因外显子缺失30bp时，PCR扩增片段长度为311bp，将其命名为BB基因型；当绵羊KAP1.1基因外显子含有60bp和30bp插入时，PCR扩增片段长度为341bp，将其命名为AA基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带，分别为341bp和311bp，将其命名为AB基因型；341bp和281bp，将其命名为AC基因型；311bp和281bp，将其命名为BC基因型，具有BB基因型绵羊的平均毛纤维直径显著小于具有AA、BC、AC、AB和CC基因型绵羊的平均毛纤维直径。

2.如权利要求1所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是：其中用于分析多态性的位点选自绵羊KAP1.1基因如下序列中的60个和30个碱基的插入/缺失，

1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg

       61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg

      121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat

      181 ccagaccagc tgctgccaac cga(tctccat ccagaccagc tgctgccagc caa)cctccat

      241 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg

      301 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g，

以上序列下划线部分为60个碱基的插入/缺失，在括号内的划线部分为30个碱基的插入/缺失。

3.如权利要求1或2所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是：其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型,其中用于分析基因多态性的部位是外显子。

4.如权利要求3所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是：其中用于分析基因多态性的部位是由KF1和KR1表示的引物扩增的部分外显子区。

5.如权利要求1或2所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是：其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12%或14%。

6.如权利要求3所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是：其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12%或14%。

7.如权利要求4所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是：其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为12%或14%。

8.如权利要求1或2所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是所述的PCR扩增退火温度为65℃。

9.如权利要求4所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是所述的PCR扩增退火温度为65℃。

10.如权利要求7所述的预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征是所述的PCR扩增退火温度为65℃。

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