CN107868840B - 一种亚麻中与全生长日数相关联的ssr分子标记和应用 - Google Patents

一种亚麻中与全生长日数相关联的ssr分子标记和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子育种技术领域，特别涉及一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用。该SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物扩增得到的SSR分子标记、由序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物扩增得到的SSR分子标记或由序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物扩增得到的SSR分子标记中的一种或几种。本发明3个分子标记在124份亚麻核心种质资源中均表现出与全生长日数呈现显著性关联，是稳定存在的全生长日数主效应位点，可以直接将本发明所提供的引物应用于筛选优良种质、基因定位和克隆以及分子标记辅助育种。

Description

一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用
技术领域
本发明涉及分子育种技术领域，特别涉及一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用。
背景技术
亚麻(学名：Linum usitatissimum L.)，是一年生草本植物，可分成纤维用亚麻、油用亚麻和油纤兼用亚麻三种类型。亚麻是人类最早使用的天然植物纤维，距今已有1万年以上的历史。亚麻是纯天然纤维，由于其具有吸汗、透气性良好和对人体无害等显著特点，越来越被人类所重视。同时，亚麻还是油料作物，亚麻油含大量不饱和脂肪酸，特别是富含亚麻酸，很多研究表明对高血脂症和动脉粥样硬化等疾病有预防作用。
分子标记是以生物体的遗传物质核酸的多态性为基础的遗传标记，具有数量丰富、遗传稳定、不受基因表达与否的限制以及操作简便等特点，并可通过分子标记直接检测基因组的遗传变异。它能从遗传物质DNA水平上准确的揭示同物种内不同种、变种、品种、品系间个体的差异，具有无与伦比的优越性。分子标记目前已被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位等方面，并被认为是鉴别品种、品种系(含杂交种、自交系)及分析种质资源遗传多样性的有利工具。目前已有多种分子标记技术被应用于亚麻的基础性研究中，其中SSR标记由于具有扩增稳定，特异性高，共显性，开发成本相对低等优点，是目前开发最多的亚麻分子标记。利用分子标记可进行基因定位并做进一步的基因克隆、在分子育种和对植物的性状进行鉴定和选择，判断目的基因在杂交后代个体中的存在，还可以进行关联分析。
全生长日数是作物的重要性状，通过选育不同生长日的作物品种能更好的适应当地的气候，提高作物的产量。亚麻的全生长日数是数量性状遗传，受为数甚多的基因支配；各个基因对性状的作用都很微小，这些基因彼此间没有显隐性关系，而其作用一般是累加的。因此开发与全生长日数关联度大的SSR分子标记，在分子育种、基因克隆、种植鉴定等方面的实际应用中具有很高的研究价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用。该分子标记在124份亚麻核心种质资源中均表现出与全生长日数呈现显著性关联，是稳定存在的全生长日数主效应位点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记，SSR分子标记为第一SSR分子标记、第二SSR分子标记或第三SSR分子标记中的一种或几种；
第一SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物扩增得到；
第二SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物扩增得到；
第三SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物扩增得到。
本发明还提供了该亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记在亚麻分子育种、基因克隆或种质鉴定中的应用。
作为优选，分子育种为分子标记辅助育种或遗传修饰育种。
本发明还提供了一种试剂盒，包括序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物组成的引物对，序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物组成的引物对，或序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物组成的引物对中的一种或多种。
本发明还提供了该亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记的获取方法，包括如下步骤：
步骤1：根据亚麻基因组序列设计SSR引物，利用SSR引物对亚麻种质进行检测，得到具有多态性的SSR标记的基因型；
步骤2：利用Tassel软件的连锁不平衡分析程序，分析步骤1中得到的具有多态性的SSR标记的基因型，计算出连锁不平衡配对检测的K矩阵图，SSR标记的基因型相互连锁的基因只保留一个；
步骤3：利用Structure软件和具有多态性的SSR标记的基因型对亚麻种质进行群体结构分析，生成Q值矩阵；
步骤4：利用Tassel软件的GLM程序，以步骤3中得到的Q值作为协方差，在显著性水平p＜0.01下，将分子标记数据和亚麻种质全生长日数的数量性状数据进行GLM程序线性模型的逻辑回归率检验，输出各SSR位点的显著性水平p及其对表型变异的解释率R2数据；
步骤5：重复步骤4，对表型变异进行分析；
步骤6：选取步骤5表型中共同存在的显著性水平p＜0.01的SSR位点，得到亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记。
在本发明提供的具体实施例中，步骤1中根据亚麻基因组序列设计SSR引物的数量为250对，具有多态性的SSR标记的基因型的数量为378个。
在本发明提供的具体实施例中，步骤1中亚麻种质的数量为124份。
作为优选，步骤3中，利用Structure软件对亚麻种质进行群体结构分析时，设定亚群数目K值为1～10，每个K值运行3次，通过计算ΔK确定亚麻的最合适种群结构。
在本发明提供的具体实施例中，步骤4中，亚麻种质全生长日数的数量性状数据为两年的各个亚麻品种的全生长日数数据。
本发明提供了一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用。该SSR分子标记为第一SSR分子标记、第二SSR分子标记或第三SSR分子标记中的一种或几种；第一SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物扩增得到；第二SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物扩增得到；第三SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物扩增得到。本发明具有的技术效果为：
本发明的3个分子标记在124份亚麻核心种质资源中均表现出与全生长日数呈现显著性关联，是稳定存在的全生长日数主效应位点，可以直接将本发明所提供的引物应用于筛选优良种质、基因定位和克隆以及分子标记辅助育种，在培育早熟和晚熟亚麻品种或研究中具有重要意义。
同时，本发明也为分子标记育种提供了有益的借鉴。
附图说明
图1为本发明SSR引物PCR扩增的变性聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳条带图的部分结果；
图2为本发明中全基因组连锁不平衡直观图的结果；
图3为本发明群体结构分析中对数似然值随亚群个数的变化的结果图；
图4为本发明群体结构分析中△K值随亚群个数变化的结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记及其引物和应用中所用序列、试剂和仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1材料和方法
1.1材料
表1 124份亚麻核心种质
1.2方法
1.2.1全生长日数性状基本统计分析
亚麻分别于2011年和2012年种植于云南省祥云试验地种植，采用随机区组设计，每份资源种植在4m2小区内，每份资源每个小区随机调查20株。调查亚麻的全生长日数，调查方法参考《亚麻种质资源描述规范和数据标准》采集和整理(王玉富等，2006)。
将124份亚麻核心种质全生长日数性状的数据导入SPSS18.0软件，进行描述性统计分析，输出最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数、偏度值和峰度值。
1.2.2DNA的提取、电泳及检测
(1)基因组DNA的提取(用omega试剂盒提取)
1)将亚麻种子置于培养箱中培养出苗，待幼苗长到4-5cm左右，取1-2克幼苗置于一个1.5ml的离心管中，用镊子夹住离心管，浸入液氮以冷冻样本，用研磨棒研成粉末。加入600μL Buffer P1涡旋混匀，确保所有的组织团都分散均匀。置于65℃水浴10min，中途混匀2次。
2)加入140μL Buffer P2，涡旋混匀，13000rpm离心10min，小心取上清(不超过700μL)，转入新的1.5ml离心管中，加入500μL异丙醇，颠倒混匀。
3)13000rpm离心2min，弃上清，用纸巾将多余上清液吸干。加入300μL65℃的超纯水(已加入Rnase)涡旋混匀，溶解DNA，65℃水浴5min。加入150μL Buffer P3及300μL冰乙醇，混匀。
4)将结合柱和收集管置好，结合柱标号(GPS预处理：取新的结合柱装在收集管中，加入200μL Buffer GPS平衡缓冲液，室温放置5min，13000rpm离心2min，弃滤液。加入700μL灭菌水，室温放置5min，13000rpm离心2min，弃滤液，结合柱处理好)，将约750μL混匀液转入处理好的结合柱中，13000rpm离心1min，弃收集管及液体。
5)将结合柱置于新的收集管中，加入650μL DNA Wash Buffer，13000rpm离心1min，弃液体，重复一次，13000rpm空甩柱子离心4min，以甩干柱子的膜基质。
6)将结合柱转入新的1.5ml离心管中，加入100μL65℃预热的Elution Buffer至新的柱子膜中央，在65℃温箱中置5min，13000rpm离心1min以洗脱DNA。再用100μL洗脱液重复一次，共收集200μLDNA洗脱液，编号，装盒置-20℃冷藏。
(2)SSR引物合成
利用自主开发的共350对亚麻SSR引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物。
(3)SSR-PCR扩增
1)PCR反应体系：Eppendorf PCR管中反应总体积为10μL，具体反应体系如下：
2)PCR扩增条件
最后保温在4℃。扩增反应均在Biometra PCR仪上进行。
(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳
对SSR引物扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1)所需试剂的配制
①45％丙烯酰胺溶液 200mL 用棕色瓶装置室温
丙烯酰胺86.8g
N,N-亚甲双丙稀酰胺3.2g
加水至120mL，37℃促溶，用硝酸纤维素膜(0.45μm)过滤，随后蒸馏水定容至200mL，PH保持在7以下。
②10×TBE贮存液1L
Tris碱108g
硼酸55g
EDTA(0.5mol/L，PH8.0) 40mL
加蒸馏水定容到1L。
③10％过硫酸铵
0.4g过硫酸铵加水定容至4mL。
④显色液
氢氧化钠6g
硼砂0.07g
加水定容至400mL。
2)凝胶的制备
①玻璃板的清洗及硅化
用去污粉将玻璃板洗净，再用蒸馏水冲洗，随后用无水乙醇擦净晾干，最后用擦镜纸蘸取玻璃硅烷将其硅化，晾干。
②电泳槽组装
最后加入过硫酸铵600μL，TEMED45μL，混匀后立即灌胶。
3)电泳
将样品与适量6×loading buffer混合，点入加样孔中，使用1×TBE缓冲液，在恒功率9W下电泳4～5个小时，待二甲苯青到达胶板末端。
4)银染
①染色：将胶放入含有400mL染色液(0.5％AgNO3)的托盘中，再将托盘放置到摇床上，轻摇30min。
②漂洗：用蒸馏水水洗2次，以洗净表面所含银离子。
③显色：将胶板转入含有400mL显色液和1.6mL甲醛的托盘中，在摇床上摇至显带为止。
5)照相：将胶放入加有蒸馏水的白瓷盘中，用数码相机照相，然后取出用保鲜膜保存。部分标记的电泳图如图1所示。
6)数据分析：
利用QuantityOne 4.6.3软件，结合人工读带，同一位置上清晰的条带记为1，无条带记为0，确定变异数目，获得位点等位变异矩阵。采用Powermarker3.25(Liu,et al.)计算多态信息含量(PIC)，多态性条带数。利用Structure2.2(Pritchard,et al.,2007)软件，计算材料相应的Q值(第i个材料其基因组变异源于第k个群体的概率)，采用混合模型和等位变异发生频率相关模型进行群体遗传结构分析。
1.2.3连锁不平衡分析
基因间的连锁不平衡是关联分析的基础。连锁不平衡程度通常用R2(squaredallele-frequency correlations)和D'(standardized disequilibrium coefficients)两个参数来表示，R2和D'的取值范围介于0～1。通常，R2和D'值越大、越接近1，说明两基因位点间的连锁不平衡程度越大。然而当R2和D'都等于0时，两基因座处于遗传平衡状态即不连锁，而R2和D'都等于1时，两基因位点处于完全连锁状态。
本发明应用TASSEL软件的Linkage Disequilibrium分析程序，将统计的分子标记的条带转换为等位基因形式，计算LD配对检测的K矩阵图，分析群体LD水平，输出R2和显著性水平P值，对存在完全连锁的标记只保留其中一个。
1.2.4群体结构分析方法
本发明运用STRCTURE软件对124份亚麻核心种质进行群体结构分析。设定K值为1～10，每个K值运行3次，根据似然值最大的原则，选择合适的K值。
1.2.5SSR分子标记与亚麻全生长日数关联分析
运用TASSEL软件的GLM程序，以得到群体Q值矩阵作为协方差，在显著性水平P＜0.01下，将分子数据和数量性状数据进行Q+GLM线性模型的逻辑回归率检验，运行之后得到各位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R2。
2结果与分析
2.1分子标记多态性
利用350对SSR引物对124份亚麻核心种质进行遗传多样性分析，扩增出378个SSR标记位点，共检测出1526个条带，大小在80-569bp之间，各个位点分别检测到2-18个等位基因，平均4.05个，每个SSR标记位点的的基因多样性介入0.005～0.901之间，平均为0.3401，杂合度介入0-1之间，平均为0.2443，多态信息量(PIC)介于0.005～0.893之间，平均为0.2997。
2.2核心种质全生长日数基本统计分析
本发明检测的两年亚麻的全生长日数基本统计分析结果如表2所示，2011年全生长日数的最大值为193，最小值为142，平均为173.6；2012年全生长日数全生长日数的最大值为176，最小值为147，平均为156.6。
表2全生长日数基本统计分析
2.3亚麻SSR位点间的连锁不平衡分析
利用TASSEL软件对378个多态性位点进行群体连锁不平衡分析，如图2所示，得到基因组内连锁不平衡的分布情况。试验得到总共378个标记的71064(即378个标记的任意组合数)个组合，当P<0.01时，仅1893个位点处于LD，占总位点组合数的2.66％。本发明所使用的124个材料连锁不平衡水平很低，适合于全基因组关联分析策略进行初定位。
2.4群体结构分析
群体结构会增加群体的连锁不平衡率，使原本不相关的性状与基因呈现连锁状态，出现假阳性。因此需要对样本的群体结构进行校正。
将350对多态性引物的分子标记数据运用STRUCTURE软件进行群体结构检验，将群体划分为1到10(K＝1，2，3，…，10)的亚群进行3次重复的测试，确认类群数目。将亚群测试过程中运行得出的对数似然值LnP(D)的平均数，绘制成与亚群数K相关的折线图，如图3所示。由图3可知，随着亚群数目K的增加，后验概率对数随之增大，不能确定K的取值。所以采用△K的方法确定K值，采用Evanno等(2005)提出的方法求得△K，绘制△K与K的相关关系图，来确定最佳亚群数，如图4所示。
2.5 SSR位点与亚麻全生长日数的关联分析
运用TASSEL软件的GLM程序，以得到的群体Q值以作为协方差，在显著性水平P＜0.01下，将分子数据分别与亚麻2年的全生长日数数据进行Q+GLM的逻辑回归率检验，输出各位点的显著性水平P及其对表型变异的解释率R2，如表4所示部分结果，寻找与性状相关联的分子标记。2年共有3个标记检测与全生长日数有显著性关联，3个标记分别为GD235、GD475和GD492，在两年均被检测到与全生长日数显著关联，可以认为是与全生长日数相关联的主效QTL，标记的引物信息见表3。
表3与亚麻全生长日数关联标记的引物序列
表4与全生长日数性状显著相关的分子标记(P<0.05)
时间 标记 p_Marker Rsq_marker(R<sup>2</sup>)
2011年 GD235 <0.01 0.1768
2011年 GD475 <0.01 0.2070
2011年 GD492 <0.01 0.1420
2012年 GD235 <0.01 0.1313
2012年 GD475 <0.01 0.1254
2012年 GD492 <0.01 0.1988
对比例1
试验方法同实施例1，其中SSR引物不同，本对比例的SSR引物序列如下表所示：
表5与亚麻全生长日数关联标记的引物序列
试验例1
检测实施例1和对比例1中各SSR标记与亚麻全生长日数的关联强度，结果如下表所示：
表6新申请的3个标记与亚麻两年全生长日数的关联强度
表7 11个标记的与亚麻两年全生长日数的关联强度
由上述结果可知，实施例1中得到的与全生长日数相关的分子标记GD235、GD475和GD492与全生长日数的关联强度显著大于该对比例中的11个SSR标记。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院麻类研究所
<120> 一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记和应用
<130> MP1723359
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcttgtcct gatgacgtgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccaatttc acatgattcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtggagggtt ggctgtttta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaactacag cacacgcaat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccatccat ccagcaagtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttttgtcc tccctctcca 20

Claims (10)

1.一种亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记，其特征在于，所述SSR分子标记为第一SSR分子标记、第二SSR分子标记或第三SSR分子标记中的一种或几种；
所述第一SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物扩增得到；
所述第二SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物扩增得到；
所述第三SSR分子标记是由序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物扩增得到。
2.如权利要求1所述的亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记在亚麻分子育种、基因克隆或种质鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子育种为分子标记辅助育种或遗传修饰育种。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和序列如SEQ IDNO：2所示的下游引物组成的引物对，序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物和序列如SEQ IDNO：4所示的下游引物组成的引物对，或序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物和序列如SEQID NO：6所示的下游引物组成的引物对中的一种或多种。
5.如权利要求1所述亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记的获取方法，包括如下步骤：
步骤1：根据亚麻基因组序列设计SSR引物，利用SSR引物对亚麻种质进行检测，得到具有多态性的SSR标记的基因型；
步骤2：利用Tassel软件的连锁不平衡分析程序，分析步骤1中得到的具有多态性的SSR标记的基因型，计算出连锁不平衡配对检测的K矩阵图，SSR标记的基因型相互连锁的基因只保留一个；
步骤3：利用Structure软件和具有多态性的SSR标记的基因型对亚麻种质进行群体结构分析，生成Q值矩阵；
步骤4：利用Tassel软件的GLM程序，以步骤3中得到的Q值作为协方差，在显著性水平p＜0.01下，将分子标记数据和亚麻种质全生长日数的数量性状数据进行GLM程序线性模型的逻辑回归率检验，输出各SSR位点的显著性水平p及其对表型变异的解释率R2数据；
步骤5：重复步骤4，对表型变异进行分析；
步骤6：选取步骤5表型中共同存在的显著性水平p＜0.01的SSR位点，得到亚麻中与全生长日数相关联的SSR分子标记。
6.根据权利要求5的获取方法，其特征在于，步骤1中根据亚麻基因组序列设计SSR引物的数量为250对。
7.根据权利要求5的获取方法，其特征在于，步骤1中具有多态性的SSR标记的基因型的数量为378个。
8.根据权利要求5的获取方法，其特征在于，步骤1中亚麻种质的数量为124份。
9.根据权利要求5的获取方法，其特征在于，步骤3中，利用Structure软件对亚麻种质进行群体结构分析时，设定亚群数目K值为1～10，每个K值运行3次，通过计算ΔK确定亚麻的最合适种群结构。
10.根据权利要求5的获取方法，其特征在于，步骤4中，所述亚麻种质全生长日数的数量性状数据为两年的各个亚麻品种的全生长日数数据。
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Assignor: INSTITUTE OF BAST FIBER CROPS, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: SSR molecular marker associated with total growth days in flax and its application

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License type: Common License

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