CN114480702B - 干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量pcr内参基因及其筛选方法和应用 - Google Patents

干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量pcr内参基因及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用，通过对培育的沙棘苗进行了干旱胁迫，选择5个梯度干旱胁迫下的沙棘不同组织器官，采用实时荧光定量PCR技术检测沙棘转录组数据库中22个候选内参基因在不同胁迫程度下不同组织部位的表达情况，然后用软件对内参基因的表达稳定性进行评价得出干旱胁迫下沙棘不同组织器官中相对最稳定的内参基因。本发明筛选出在干旱胁迫条件下在沙棘根中相对稳定表达的内参基因为TATA；茎中为RPL13‑2，UEP‑2和PEPC‑2；叶中为HIS3‑2。本发明为今后发掘沙棘抗旱相关基因以及其功能的研究提供了有效的稳定内参基因，为沙棘抗旱差异表达基因的筛选提供了有效的校正工具。

Description

干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因及其筛选 方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用。
背景技术
沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)是一种落叶性灌木或乔木，属胡颓子科沙棘属植物。因其生长快、适应性强并能在贫瘠的土地上生长，为良好的非豆科固氮树种，因此成为公认的优良土壤改良植物。同时作为典型的克隆植物，沙棘能够在短期内迅速郁闭成林，具较高的水土保持效益。再者由于它的固氮能力强，能够为其他植物创造适宜生存的环境，故称为优良的先锋树种和混交树种。在高寒干旱的青藏高原，干旱是影响植物生长发育及分布的主要因子，而沙棘因具有上述优点而成为水土保持的“生态先锋树种”。
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是一种进行精准核酸定量的重要试验方法，在基因表达研究中被广泛使用。目的基因表达评价的准确度在很大程度上依赖于所选择的内参基因(Reference gene，RG)的表达的稳定性。以前的研究认为内参基因在不同的组织、不同的生长阶段中都是恒定表达的，所以可以用内参基因表达量作为标准，但越来越多的研究表明，内参基因的表达水平会受不同实验条件而发生变化，因此，根据具体的实验条件选择稳定的内参基因是保证基因表达分析结果的可靠性的重要前提。沙棘作为重要的生态经济型植物，对其抗旱基因的发掘对于抗旱转基因植物的培育具有重要意义，而稳定内参对沙棘抗旱基因的发掘及其功能研究至关重要。
发明内容
基于上述技术问题，本发明通过对培育的沙棘苗进行了干旱胁迫，选择5个梯度干旱胁迫下的沙棘不同组织器官，采用实时荧光定量PCR技术检测沙棘转录组数据库中22个候选内参基因在不同胁迫程度下不同组织部位的表达情况，然后用软件对内参基因的表达稳定性进行评价得出干旱胁迫下沙棘不同组织器官中相对最稳定的内参基因。目的是提供干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用。
本发明保护干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因，所述干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因中，根组织材料稳定内参基因为TATA；茎组织材料稳定内参基因为RPL13-2，UEP-2和PEPC-2；叶组织材料稳定内参基因为HIS3-2；所述内参基因TATA的序列号如SEQ ID.NO.1所示；所述内参基因RPL13-2的序列号如SEQ ID.NO.2所示；所述内参基因UEP-2的序列号如SEQ ID.NO.3所示；所述内参基因PEPC-2的序列号如SEQID.NO.4所示；所述内参基因HIS3-2的序列号如SEQ ID.NO.5所示。
本发明还保护用于扩增前所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的专用引物：
所述内参基因TATA的引物序列是：
F：5’-AAGTTGGCAGCACGAAAGTATG-3’；
R：5’-GGGGAATTTAACATCACAAGAACC-3’；
所述内参基因RPL13-2的引物序列是：
F：5’-TGGTGGACTTGTTAGGCAGAAA-3’；
R：5’-TAGCAGGAGCCCGAAAGTG-3’；
所述内参基因UEP-2的引物序列是：
F：5’-GGCTTCGTGGAGGTATTATTGAAC-3’；
R：5’-GGGTGAAGACGAGCATAGCA-3’；
所述内参基因PEPC-2的引物序列是：
F：5’-GTCGTCCATCAAAACGCAAG-3’；
R：5’-AAGCCAAGCCACACAGGTAAA-3’；
所述内参基因HIS3-2的引物序列是：
F：5’-CCGTAAATCAGCCCCAACC-3’；
R：5’-GAACAAGCCTCTGGAATGGAA-3’。
所述干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因在沙棘荧光定量PCR中应用。
所述的专用引物在沙棘荧光定量PCR中应用。
本发明还保护上述干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的筛选方法，具体步骤包括如下：
步骤1，材料的获取：采集野生中国沙棘种子，将种子播于花盆中，待苗木长至15～20cm时将苗木随机分组，进行干旱胁迫处理，其中干旱胁迫处理中对照组(CK)正常浇水；干旱胁迫处理组(DS)停止浇水，分别在干旱胁迫的3天(DS1)，6天(DS2)，9天(DS3)时，收集沙棘苗样本，第9天沙棘苗萎蔫后开始复水，并在复水24h后采样(FS)，分别采集对照、干旱胁迫和复水处理的沙棘的根、茎、叶，用超纯水清洗并用滤纸吸干表面水分后立即放入冻存管中，不同组织部位的每个样本重复采集三次，将采集后的样本装袋编号，用液氮速冻后放入-80℃超低温冰箱中保存，备用；
步骤2，沙棘不同组织RNA提取及cDNA模板准备：沙棘根、茎、叶在液氮中分别研磨成细粉，使用植物RNA快速提取试剂盒提取沙棘根、茎、叶中总RNA，-80℃冰箱中保存备用；1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性；取1μL检测样品，用微量核酸蛋白测定仪检测OD260/280值和RNA浓度，测值介于1.9-2.1且单峰度为合格样品；使用II 1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行沙棘总RNA反转录，将得到的反转录产物置于-20℃的冰箱中保存；
步骤3，选取候选内参基因，合成PCR扩增引物：根据沙棘转录组测序技术获得沙棘中相对稳定表达的内参候选基因的核普酸序列，经过序列分析以及与NCBI数据库Blast比对，确定22个基因序列为沙棘内参候选基因的序列，随后又基于此序列设计合成荧光定量PCR扩增引物；
步骤4，将步骤2所获得的沙棘根、茎、叶的cDNA产物进行实时荧光定量PCR分析；
步骤5，稳定内参基因筛选：将实时荧光定量Ct值输入到分析软件NormFinder进行内参基因稳定性分析，确立表达最稳定的内参基因。
进一步的，所述步骤4的荧光定量PCR扩增反应体系为：95℃预变性30s；95℃变性5sec；按照步骤3所述的22个候选内参基因的荧光定量PCR扩增引物对应的退火温度49～60℃下退火30s，72℃延伸30s，40～45个循环。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对培育的沙棘苗进行了干旱胁迫，选择5个梯度干旱胁迫下的沙棘不同组织器官，采用实时荧光定量PCR技术检测沙棘转录组数据库中22个候选内参基因在不同胁迫程度下不同组织部位的表达情况，然后用软件对内参基因的表达稳定性进行评价得出干旱胁迫下沙棘不同组织器官中相对最稳定的内参基因。本发明筛选出在干旱胁迫条件下在沙棘根中相对稳定表达的内参基因为TATA；茎中为RPL13-2，UEP-2和PEPC-2；叶中为HIS3-2。本发明为今后发掘沙棘抗旱相关基因以及其功能的研究提供了有效的稳定内参基因，为沙棘抗旱差异表达基因的筛选提供了有效的校正工具。
附图说明
图1为本发明22个候选内参基因的电泳图；
图2为本发明筛选的稳定内参基因TATA的溶解曲线；
图3为本发明筛选的稳定内参基因RPL13-2的溶解曲线；
图4为本发明筛选的稳定内参基因UEP-2的溶解曲线；
图5为本发明筛选的稳定内参基因PEPC-2的溶解曲线；
图6为本发明筛选的稳定内参基因HIS3-2的溶解曲线；
图7为本发明筛选的稳定内参基因TATA的扩增曲线；
图8为本发明筛选的稳定内参基因RPL13-2的扩增曲线；
图9为本发明筛选的稳定内参基因UEP-2的扩增曲线；
图10为本发明筛选的稳定内参基因PEPC-2的扩增曲线；
图11为本发明筛选的稳定内参基因HIS3-2的扩增曲线。
图2-11中，从左至右，依次代表沙棘的根、茎、叶组织的相应曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的筛选
(1)材料的获取
在青海省西宁市大通县(北纬37°14′45″，东经101°30′15″，海拔2920m)随机采集野生中国沙棘的种子，将种子用高锰酸钾进行表面消毒，然后在培养箱中40℃温水浸泡处理48h进行催芽，期间每10-12h将种子用清水冲洗以防霉烂，随后播于高12cm，直径15cm的花盆中(泥炭：园土：珍珠岩＝40：30：30(体积％))于温室中培养并覆盖塑料薄膜，待1/3以上的种子发芽后移去塑料膜。
待苗木长至15～20cm左右时将苗木随机分组，进行干旱胁迫处理，其中干旱胁迫处理中对照组(CK)正常浇水；干旱胁迫处理组(DS)停止浇水，分别在干旱胁迫的3天(DS1)，6天(DS2)，9天(DS3)时，收集沙棘苗样本，第9天沙棘苗萎蔫后开始复水，并在复水24h后采样(FS)，分别采集对照、干旱胁迫和复水处理的沙棘的根、茎、叶，用超纯水清洗并用滤纸吸干表面水分后立即放入冻存管中，不同组织部位的每个样本重复采集三次，将采集后的样本装袋编号，用液氮速冻后放入-80℃超低温冰箱中保存，备用。
(2)沙棘不同组织RNA提取及cDNA模板准备
沙棘根、茎、叶在液氮中分别研磨成细粉，使用北京艾德莱公司的RN33-EASY spinplus植物RNA快速提取试剂盒，提取沙棘根、茎、叶中总RNA，-80℃冰箱中保存备用；1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性(详见附图1)；取1μL检测样品，用微量核酸蛋白测定仪检测OD260/280值和RNA浓度，测值介于1.9-2.1且单峰度为合格样品；使用II1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行沙棘总RNA反转录，将得到的反转录产物置于-20℃的冰箱中保存。
(3)选取候选内参基因，合成PCR扩增引物
根据沙棘转录组测序技术获得沙棘中相对稳定表达的内参候选基因的核普酸序列，经过序列分析以及与NCBI数据库Blast比对，确定22个基因序列为沙棘内参候选基因的序列，随后又基于此序列设计合成荧光定量PCR扩增引物；其中，沙棘22个荧光定量PCR候选内参基因的引物序列、退火温度、扩增长度、基因登录号及核苷酸序列号等信息见表1：
表1沙棘22个候选内参基因的荧光定量PCR引物信息
(4)稳定内参候选基因的荧光定量PCR扩增：荧光定量PCR按照BIO-RAD CFXConnectTM Optics Module分析仪说明书和Premix DimerEraser(Perfect RealTime)试剂盒使用说明进行操作，进行稳定内参候选基因的荧光定量PCR扩增；95℃预变性30s；95℃变性5sec，表1中各基因的退火温度下退火30s，72℃延伸30s，40～45个循环；循环结束后绘制溶解曲线：55～95℃，每0.5℃收集荧光信号(详见附图2-6)。
(5)建立候选内参基因引物扩增标准曲线
溶解曲线是否为单峰判断各引物的扩增特异性，另外，以10倍梯度稀释cDNA模板，建立候选内参基因引物扩增标准曲线(详见附图7-11)，根据标准曲线斜率确立每对引物的扩增效率(E)，E＝10(-1/斜率)-1，以扩增效率是否介于80～110％之间为标准判断引物是否适用。标准曲线荧光定量反应体系及循环程序同前述。SYBR荧光试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。
(6)稳定内参基因筛选：根据荧光定量PCR所得Ct值，由于候选内参基因数量多达22个，其他分析内参基因的软件一次最多只能处理10个基因，因此本发明只采用Normfinder分析上述候选基因的稳定性，确定表达最稳定的候选内参基因。干旱胁迫：在干旱胁迫条件下若选择根为组织材料则稳定内参基因为TATA；若选择茎为组织材料则稳定内参基因为RPL13-2，UEP-2和PEPC-2；若选择叶为组织材料则稳定内参基因为HIS3-2(详见表2-4)。
表2 NormFinder软件分析22个候选内参基因在不同干旱胁迫梯度下在根中的表达稳定性
表3 NormFinder软件分析22个候选内参基因在不同干旱胁迫梯度下在茎中的表达稳定性
表4 NormFinder软件分析22个候选内参基因在不同干旱胁迫梯度下在叶中的表达稳定性
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 青海大学
<120> 干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 606
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.TATA基因)
<400> 1
acaatggcgg aacaagcttt gcaagggatc cagccagtag atcttacaaa gcatccttcc 60
ggaatcgttc ctacccttca gaatattgtc tccacagtca atttggactg caagttggat 120
ctaaaggcca ttgcactgca agcaagaaac gcagaatata atcccaagcg gtttgcagct 180
gttattatga gaattagaga accgaaaaca actgcgttga tatttgcgtc tggtaagatg 240
gtttgtactg gagctaagag tgaacaacag tccaagttgg cagcacgaaa gtatgctcga 300
ataattcaaa aacttggctt ctcggctaag ttcaaggatt ttaagattca gaatatagtg 360
ggttcttgtg atgttaaatt ccccataagg ctagaaggtc tcgcatactc tcatggtgct 420
ttctcaagtt atgaaccgga gctgtttcca ggtttgattt atcggatgaa acaaccgaaa 480
attgtgctac taatctttgt gtcaggaaaa atagttctta caggggctaa ggtgcgggat 540
gagacctata cagcgtttga gaacatatat ccagttctca ctgagttcag aaaaagtcaa 600
cagtga 606
<210> 2
<211> 657
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.RPL13-2 基因)
<400> 2
aggaggcaga gagcgagagg taaggtgtca acgacaatgg tttctggatc gggtatctgc 60
gcaaaaaggg ttgttgtgga tgcaaggcac cacatgctcg gtcgtttggc atcgatcgta 120
gccaaggaat tgcttaatgg tcaaaaggta gtggttgtga ggtgcgagga gatatgtttg 180
tctggtggac ttgttaggca gaaaatgaag tacatgagat tccttcgcaa acgtatgaac 240
actaagcctt ctcatggtcc cattcacttt cgggctcctg ctaaaatctt ctggcgcacc 300
ctccgaggta tgattcctca caagactaag cgtggggcag ctgcacttgc aagattgaag 360
gcttacgagg gcgttcctcc accttatgat aaggttaaaa ggatggtcat cccagatgct 420
ctcaaggtgt tgaggcttca gaaggggcac aagtattgct tgttgggtcg tctctcatca 480
gaggttggat ggaaccatta tgataccatt agggaacttg aaaacaagag aaaggagaga 540
tctcaggtgg tatatgagag aaagaagcag cttaataaac ttcgagttaa agcggaaaag 600
gatgccgaag agaagcttgg ttctcagtta gacattcttg ttccagttaa gtactga 657
<210> 3
<211> 316
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.UEP-2 基因)
<400> 3
caatgtcaag gctaagattc aagataagga aggtatccca cctgaccaac agcgattgat 60
cttcgctggg aagcaacttg aagatggccg tactttagct gactataata ttcagaaaga 120
gtcgactctt cacttggttc ttaggcttcg tggaggtatt attgaacctt ctttaatggc 180
attggctagg aaatacaacc aagacaagac tatttgcagg aaatgctatg ctcgtcttca 240
cccaagagct gtaaactgcc ggaaaaagaa gtgtggtcat agcaatcaac tgaggccaaa 300
gaagaagatc aagtag 316
<210> 4
<211> 5176
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.PEPC-2 基因)
<400> 4
aaaaaaacaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa agcctcttat cactaatctt ttttacttta 60
tcgtgaagag atcacccaac gcaacccaat tccctgggag ccttacgtat tttgcgctac 120
atctgggtct ctcaggattc attcttcccc tcactctctg tcctactttt cagctttctg 180
tcaatattta gtttttcttt tcttttttcc ttttcgaagt accaaaaatt gataaatttt 240
cttttgttgg gttcggttca ctaaactcta aagacaatca tttgggtttt taatttctta 300
ccgatatcat cctttgattt tttcgcccga gcatattgtg gtgtatttgg gtgataaatc 360
taggacagag aaagcaaata tgacggctag gaacttggag aagatgactt caatagatgc 420
ccagttgaga ttgttggcac caaagaaggt gtctgaggat gaccatctga ttgagtatga 480
tgctttgctc tgtgataaat ttcttgatat acttcaggat ttacacggag agcaactcag 540
agaaacggtt caagattgtt atgagctttc tgccgaatat gaaagtaagc aagatcctaa 600
gaagttggag gaacttggga atgtgctaac gagtctggat cctggggact caattgttgt 660
tgctaaatca ttctcccaca tgcttaattt ggcaaatttg gctgaggaag tacagattgc 720
ttataggaga aggatcaagt taaaaaaggg taattttgct gatgagaatt ctgctattac 780
tgagtcaaat attgaagaga ccttaaaaag gctagtggtg gagcttaaaa agtcacctga 840
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tcagtctgta cgtagatctc tgcttcaaaa gcacggaagg ataagaaatt gtttgactca 960
actgtatgct aaagatatta ctcctgatga gaagcaggaa ctcgatgagg ctttacatag 1020
ggagctgggt taattgacgt atcccctgtg ctagtaatct actactcaac attgtagaac 1080
atacttgcac tagatctatc aggtaagatg cttatgaact tctgtataaa aatttcttat 1140
gtatgtcatt cttctggtat agattcaagc tgcatttcgc acggacgaaa ttcggaggag 1200
tcctcctacc ccacaagatg agatgcgtgc tggaatgagc tactttcatg agacaatttg 1260
gaaaggtgta cctaaattct tgcgccgcgt agacactgcc ttaaagaacc taggaataaa 1320
tgaacgtgtt ccttacaatg ccccccttat tcaattttct tcttggatgg gcggtgatcg 1380
tgatggtaac ccaagggtca ctccagaagt tacaagggat gtctgcctgt tggctagaat 1440
gatggctgct aatttgtact tttcccagat agaagatctt atgtttgagc tgtctatgtg 1500
gcgctgcaat gatgagctac gtgctcgtgc tgatgaactt cacagatcat caaagagaga 1560
tgcaaaacac ttcatagagt tttggaaaca agttcctaca aatgagccct accgtgtcat 1620
acttggtgat cttagggaca aactttataa cactcgtgaa tatgctcgtc aattaatagc 1680
aaatggagtc tctgagattt ctgaagaagc tactcttact aatctcgagc agttcttgca 1740
gcctcttgaa ctctgctaca gatccctttg ctcctgtggt gaccgaccag tagctgatgg 1800
aagccttctt gatttcttga ggcaagtttc tacatttggg ctttctattg tgagattgga 1860
tatcaggcaa gaatctgata ggcataccga tgtaatggat gctatcacaa agcacctggg 1920
agttggatct tatcgtgaat ggtctgagga gcgcaggcaa gaatggctct tgtctgagct 1980
taggagcaaa cgtccccttt ttggccccga ccttcccaaa actgaagaaa ttgctgatgt 2040
gctcgataca ttccatgtaa ttgcagagct tccctcagac aactttggtg cctatattat 2100
ctccatggca acatccccgt ctgatgtact tgctgttgaa cttttgcaac gtgaatgtgg 2160
gataaagaaa cccctaaggg ttgtcccatt gtttgaaaaa cttgatgatc ttgaggctgc 2220
tcctgcagca gtggctcgtc tcttctcaat agattggtat agaaaccgaa taaatggaaa 2280
gcaagaagtc atgataggat attcagattc aggaaaggat gctgggcgtc tatccgcagc 2340
ttggcagtta tataaggctc aggaggagct cataaaggtg gcaaaagaat atggtgttaa 2400
gcttacgatg tttcatggac gaggtggtac tgttggaagg ggtggtggac caactcatct 2460
tgcaatattg tctcaaccgc ctgacacaat tcacgggtca cttcgtgtga ccgttcaggg 2520
tgaagtaatt gaacaatcat ttggagagga gcacttgtgc tttagaacac tccagcgttt 2580
cactgcagcg acacttgagc atggaatgca tcctcctgtc tctccaaagc cagaatggcg 2640
tgcactcatg gatgagatgg ctgttattgc tacgaaggag tatcgttcaa tagttttcca 2700
agaacctcgt tttgttgagt actttcgcct tgcaacacca gagctggaat atggtcgaat 2760
gaacattgga agtcgtccat caaaacgcaa gccaagtgga ggcattgagt cacttcgtgc 2820
aattccatgg atctttgcat ggacccagac aaggttccat ttacctgtgt ggcttggctt 2880
tggaggagca ttcaagcatg taattaagaa ggatgtaaag aatctaagca tgcttcggga 2940
gatgtataac cagtggccct tcttcagagt cacaattgat ttagttgaaa tggtctttgc 3000
taagggagat cctgtaattg ctgccctgta tgacaagctc ctagtgtcag aagagctatt 3060
gccatttggg gaaaatttga ggtccaaata tgaagaaact aagcgtctcc tgcttcaggt 3120
tgctgggcac aaggatattc tggaaggaaa tccttacttg aagcaaagac taagccttcg 3180
tgattcatat accacaacgc ttaatgtgtg ccaagcctac acactaaagc agattcggga 3240
cccaaattac aatgtgaaaa tgaagtctac ggaatacatg gagtcgagaa aaccagaggc 3300
agagcttttg aagctgaacc cgaccagcga gtatgctcct ggtttggaag acacacttat 3360
actgaccatg aagggtattg ctgctggcat gcagaacact ggttaaggct ctactagcgg 3420
aggcttgact ctcctaggat gtttctcttc tttagtatct aaatatataa tgtttccttt 3480
aaatgcatgc tctgctgctc atatctgagt ggacatctaa taaaccccca atttgtatgt 3540
tttatcgttt tcttaccttt gcttcggatt tctacttaag agggaaacca tgtggaactt 3600
tagagtctta gattggtgca ttagatgggt atacttctat caagatataa tctttgaaat 3660
tgggaaagaa tgaaagacag acaggagaca taatccaaaa gaagaccatc atgaataaat 3720
aaatttctta tattattata cgatttttac atagaaaatg aaattaatga aggatacaca 3780
gtattcttga attaaatttt catctcgcac ccatgaaaac agaaacaatg atcccaactc 3840
agacttaaat ctgaatcaac ccagccaaaa aagtgaaacc gcttctgcat ctcagtaagc 3900
tgcatcagta ggatcgggta agtaagatga gtgggattca tgattcatct aatgcttggg 3960
cattttcccc aaccacagaa attgcttcct ctatagcttg aacaaaagta gcaatcttgt 4020
atgtgaagaa tcctaccagc attggtatca attccaggtg catgtatcca tattctggaa 4080
caagaatccc attccaccgg ttgtagatca tgaccaatac aacaggaacc aataaccttg 4140
gctgtccaac agctcccttg acaagccctc ttgctccatc tgccatggaa tccacagtat 4200
tccccagcat acgcatgtat gccaaagaac caagcaatcc agcaccaaag ctagctgcta 4260
tttctggcga ataggaaaca taagctgaga ctaaaccaac accgccgata cctactgtaa 4320
ggatttgcat cttctttttt aacttaaagt aatcttccct tgattgagcc gccaacactt 4380
ctgggtcccc ccgggggcgc cttagttctc taaacatcac atcgctgcct cctgttgcag 4440
ccttactagc cttgtcccac ttctcctgtt cacgccttgt tggtaccaat ttccatctgg 4500
atgatgatgt cttggcacca ctttgatttg gcagctcaac ttgaagttgt atttcttgct 4560
tgggagaagc tgtaagttgt ttgctcaaat caacttctaa actgtcaagg ctcattactc 4620
tatttaagct cagaaacccc gatggctttt ccttaacagg agtgtattgc atggaagggt 4680
cggggtcttc aatcaatctt ttcatacgac ccatgaaatc tttgttccag ataaagtcat 4740
cagaggtaag agggtcttct tcttcaccac cccagtactt tcggagcttc gtagtggtcg 4800
gaggaccacc atactcgccg ggagaaaccc cagtagacca ttttacaggt ttcttcttgg 4860
gcaaaatgac ttttgtttgt cttcgatctg gttttgatgg ggtcaaagag tcctgagaga 4920
ttggtgtggc cgaggaggtt actgtgatgt agtaattcag aactgccatt gtggatgacg 4980
attccacggt tatcagctct gacctatgat atttatagta tttttatgca agaataaatt 5040
agaaaaagat ggctattaaa ggattaatta tttcttacga acatatttat aaaattataa 5100
aaataattta gtgataggaa taacgtaata cttatctacc ttaagtcctt aaccatgaaa 5160
aaagggaata ttactt 5176
<210> 5
<211> 411
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.HIS3-2 基因)
<400> 5
atggcccgta cgaagcaaac agctcgtaag tctaccggag gaaaggctcc taggaagcag 60
ctcgctacca aggctgcccg taaatcagcc ccaaccactg gaggagtgaa gaagcctcac 120
agataccgcc ctggtactgt cgctcttcgt gaaattcgta agtatcagaa gagtactgag 180
ttgctcatca ggaagcttcc attccagagg cttgttcgtg aaattgctca ggatttcaag 240
accgatttgc gtttccagag ccatgcggtt ctagctttgc aggaggcagc tgaggcatac 300
cttgttggtt tgtttgagga cacaaacctc tgtgcaattc atgctaagcg tgtgacaatc 360
atgcccaagg atatccagct tgctcgtaga atcagaggcg agcgtgctta a 411
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.TATA 基因PCR扩增上游引物)
<400> 6
aagttggcag cacgaaagta tg 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.TATA基因PCR扩增下游引物)
<400> 7
ggggaattta acatcacaag aacc 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.RPL13-2基因PCR扩增上游引物)
<400> 8
tggtggactt gttaggcaga aa 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.RPL13-2基因PCR扩增下游引物)
<400> 9
tagcaggagc ccgaaagtg 19
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.UEP-2基因PCR扩增上游引物)
<400> 10
ggcttcgtgg aggtattatt gaac 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.UEP-2基因PCR扩增下游引物)
<400> 11
gggtgaagac gagcatagca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.PEPC-2基因PCR扩增上游引物)
<400> 12
gtcgtccatc aaaacgcaag 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.PEPC-2基因PCR扩增下游引物)
<400> 13
aagccaagcc acacaggtaa a 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.HIS3-2 基因PCR扩增上游引物)
<400> 14
ccgtaaatca gccccaacc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.HIS3-2基因PCR扩增下游引物)
<400> 15
gaacaagcct ctggaatgga a 21

Claims (4)

1.干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为根组织材料稳定内参基因TATA，茎组织材料稳定内参基因RPL13-2、UEP-2或PEPC-2，或者叶组织材料稳定内参基因HIS3-2；所述内参基因TATA的序列为SEQ ID NO.1所示序列；所述内参基因RPL13-2的序列为SEQ ID NO.2所示序列；所述内参基因UEP-2的序列为SEQ ID NO.3所示序列；所述内参基因PEPC-2的序列为SEQ ID NO.4所示序列；所述内参基因HIS3-2的序列为SEQ ID NO.5所示序列。
2.根据权利要求1所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的专用引物，其特征在于，
所述内参基因TATA的引物序列是：
F：5’-AAGTTGGCAGCACGAAAGTATG-3’；
R：5’-GGGGAATTTAACATCACAAGAACC-3’；
所述内参基因RPL13-2的引物序列是：
F：5’-TGGTGGACTTGTTAGGCAGAAA-3’；
R：5’-TAGCAGGAGCCCGAAAGTG-3’；
所述内参基因UEP-2的引物序列是：
F：5’-GGCTTCGTGGAGGTATTATTGAAC-3’；
R：5’-GGGTGAAGACGAGCATAGCA-3’；
所述内参基因PEPC-2的引物序列是：
F：5’-GTCGTCCATCAAAACGCAAG-3’；
R：5’-AAGCCAAGCCACACAGGTAAA-3’；
所述内参基因HIS3-2的引物序列是：
F：5’-CCGTAAATCAGCCCCAACC-3’；
R：5’-GAACAAGCCTCTGGAATGGAA-3’。
3.根据权利要求1所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的应用，其特征在于，所述干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因在沙棘荧光定量PCR中应用。
4.根据权利要求2所述的干旱胁迫下沙棘不同组织的荧光定量PCR内参基因的专用引物的应用，其特征在于，所述的专用引物在沙棘荧光定量PCR中应用。
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