CN111826424A - 芍药干旱胁迫下实时荧光定量pcr内参基因及其专用引物和应用 - Google Patents

芍药干旱胁迫下实时荧光定量pcr内参基因及其专用引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因及其专用引物和应用，该内参基因是EF‑1α、ACT1、ACT2、UBQ1、UBQ2、UBQ3、eIF、His、TUB或RNA Pol II，内参基因的序列分别是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10。本发明能够满足实时荧光定量PCR检测芍药中基因相对表达水平的要求，提高了芍药基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。

Description

芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因及其专用引物和 应用
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因及其专用引物和应用。
背景技术
实时荧光定量PCR是在传统PCR基础上发展起来的一项既可定性、又可定量的PCR技术。因具有特异性强、灵敏度高且重复性好的优点，它是分析功能基因表达水平的常用方法之一。但采用该技术的检测结果常受到样本的影响，因此常采用内参基因来校准样品间误差，以保证其结果的准确性。内参基因是一类在不同条件或不同组织中均能稳定表达的持家基因，但并不是所有持家基因都可以作为内参基因。因此，常需要根据具体实验需要对内参基因筛洗。
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是我国的传统名花，因其花朵硕大、花色雅丽、花型丰富、花朵繁茂，而深受人们的喜爱，在园林中广泛应用。干旱常会对芍药的生长发育产生影响，它在干旱胁迫下会表现出叶片发黄和卷曲发干等现象，甚至使得全株干旱枯死，这显著降低了芍药植物的观赏价值。而开展全面深入的芍药响应干旱胁迫的分子生物学研究对于提高芍药耐旱能力起着关键作用。筛选合适的内参基因，利用实时荧光定量PCR技术分析芍药干旱胁迫下相关基因的表达水平，有助于阐明芍药响应干旱胁迫的分子机理。目前，仅见到用于芍药花瓣不同发育时期和不同组织的基因表达的内参基因筛选(李健，芍药实时定量PCR内参基因的筛选和验证，分子植物育种，2017，15(7)：2544-2549)，关于特异用于芍药干旱胁迫下基因表达的内参基因一直未见筛选。
发明内容
本发明针对现有技术的局限性，提供一种适用于芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因，该基因能够满足实时荧光定量PCR检测芍药中基因相对表达水平的要求，提高了芍药基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。本发明还提供了上述内参基因的专用引物和应用。
本发明采用的技术方案：
一种芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因，所述芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因是EF-1α、ACT1、ACT2、UBQ1、UBQ2、UBQ3、eIF、His、TUB或RNA Pol II，所述内参基因是EF-1α的序列如SEQ ID NO.1所示；所述内参基因是ACT1的序列如SEQ ID NO.2所示；所述内参基因是ACT2的序列如SEQ ID NO.3所示；所述内参基因是UBQ1的序列如SEQID NO.4所示；所述内参基因是UBQ2的序列如SEQ ID NO.5所示；所述内参基因是UBQ3的序列如SEQ ID NO.6所示；所述内参基因是eIF的序列如SEQ ID NO.7所示；所述内参基因是His的序列如SEQ ID NO.8所示；所述内参基因是TUB的序列如SEQ ID NO.9所示；所述内参基因是RNA Pol II的序列如SEQ ID NO.10所示。
作为优选，本发明所采用的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因优选是EF-1α、ACT1、ACT2、UBQ1、UBQ2、UBQ3、eIF、His、TUB或RNA Pol II，所述内参基因是EF-1α的序列如SEQ ID NO.1所示；所述内参基因是ACT1的序列如SEQ ID NO.2所示；所述内参基因是ACT2的序列如SEQ ID NO.3所示；所述内参基因是UBQ1的序列如SEQ ID NO.4所示；所述内参基因是UBQ2的序列如SEQ ID NO.5所示。
作为最优选，本发明的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因优选是EF-1α。
本发明内容还包括用于扩增如前所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的专用引物：
所述内参基因是EF-1α的引物序列是：
EF-1α正向引物5’-ATGCGTTGGTTTGTTCCT-3’；
EF-1α反向引物5’-GTGTTCAAAGCACCGAGG-3’；
所述内参基因是ACT1的引物序列是：
F：5’-GGTTCTCAAGCCTTAGCG-3’；
R：5’-CGGTTCAGCGAGTAGCAT-3’；
所述内参基因是ACT2的引物序列是：
F：5’-AGAGTGGTTGGACTATTTAC-3’；
R：5’-GCATCAGACACCATAGAA-3’；
所述内参基因是UBQ1的引物序列是：
F：5’-TTGCGTGGAGTATCGGAG-3’；
R：5’-GCCAATGAAACATAATGCG-3’；
所述内参基因是UBQ2的引物序列是：
F：5’-CTACATACACTTGGACGG-3’；
R：5’-CTGCAAGACGTATTCTGT-3’；
所述内参基因是UBQ3的引物序列是：
F：5’-GCGATTGAAGAAGGCACT-3’；
R：5’-CCCGATTAGACTCACCGA-3’；
所述内参基因是eIF的引物序列是：
F：5’-AGTTCAGCGAAGACGGAT-3’；
R：5’-ATGTTCGGGATTTCAAGG-3’；
所述内参基因是His的引物序列是：
F：5’-GTGGAAGTGAAGAAGGCT-3’；
R：5’-TATACCGATGTCTGGGTG-3’；
所述内参基因是TUB的引物序列是：
F：5’-TATCTGTTGGAGACCCTT-3’；
R：5’-CAGCATTTAGTGTTAGTCG-3’；
所述内参基因是RNA Pol II的引物序列是：
F：5’-GGTTTGTGACATTTCCTG-3’；
R：5’-ATAGTTTGGTGCATCTCC-3’。
所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因在芍药实时荧光定量PCR中的应用。
所述的专用引物在芍药实时荧光定量PCR中的应用。
芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
1)基于前期芍药品种在正常生长以及干旱胁迫处理叶片的RNA-seq数据库，根据RNA-seq数据库中Unigene的RPKM值获得表达稳定的Unigene适于用作候选内参基因；
2)针对步骤1)获取得到的候选内参基因，分别设计实时荧光定量PCR检测引物；
3)以芍药三年生盆栽苗为材料，在自然干旱处理前连续3天在每天同一时间正常浇水，而后进行自然干旱处理；样品采集后立即提取总RNA，反转录合成cDNA，以获得的cDNA产物作为PCR扩增的模板以及以步骤2)设计得到的引物对不同干旱胁迫时间的芍药叶片进行实时荧光定量PCR验证；
4)将获得的实时荧光定量PCR数据通过BestKeeper和GeNorm软件进行候选内参基因的稳定性分析，最终筛选出最稳定表达的基因。
作为优选，本发明所采用的芍药品种是大富贵。
所谓优选，本发明所采用的自然干旱处理时间分别为0天、4天、8天和12天。
作为优选，本发明在步骤3)中，实时荧光定量PCR的条件是：实时荧光定量PCR反应体积为25μL，包含12.5μL的2×SYBR Premix Ex TaqTM，正向引物/反向引物各1μM，cDNA模板2μL，灭菌蒸馏水8.5μL；
所述实时荧光定量PCR的程序是：95℃预变性30s，接下来95℃～5s、55℃～30s和72℃～30s共40个循环；循环结束后绘制溶解曲线：65℃～95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每个样本均设置3个定量PCR重复。
本发明的有益效果是：
本发明根据芍药干旱胁迫下的转录组数据库和常用的内参基因，找到10个适于芍药干旱胁迫下的内参基因，并依此设计了实时荧光定量PCR检测引物，通过综合分析筛选到最优用于芍药干旱胁迫下荧光定量内参基因EF-1α，有利于提高芍药干旱胁迫下基因表达分析研究的稳定性和可靠性。
附图说明
图1是本发明候选内参基因EF-1α实时荧光定量PCR的扩增曲线；
图2是本发明候选内参基因EF-1α的溶解曲线；
图3是GeNorm软件对10个候选内参基因表达稳定值(M)的排序。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但这并不限制本发明的范围。
本发明以芍药主栽品种‘大富贵’为材料，在自然干旱处理前连续3天在每天17：00时正常浇水，而后进行自然干旱处理。样品采集后立即提取总RNA，反转录合成cDNA，而后将不同干旱胁迫时间的芍药叶片进行实时荧光定量PCR验证，采用BestKeeper和GeNorm软件对数据进行分析，从而筛选出芍药‘大富贵’不同干旱胁迫时间下最稳定表达的内参基因。
芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
1)采用Primer Premier5.0软件设计并合成10个芍药候选内参基因的特异性实时荧光定量PCR检测引物，并对其进行验证和下一步的扩增；
2)分别选取正常生长和不同干旱胁迫时间的芍药叶片为实验材料，提取总RNA，分别反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR分析；
3)将获得的实时荧光定量PCR数据通过BestKeeper和GeNorm软件进行候选内参基因的稳定性分析，最终筛选出最稳定表达的基因；
芍药为三年生的盆栽苗；芍药干旱处理时间分别为0天、4天、8天和12天；
实时荧光定量PCR的条件和程序分别为：
实时荧光定量PCR的条件：实时荧光定量PCR反应体积为25μL，包含12.5μL的2×SYBR Premix Ex TaqTM，正向引物/反向引物各1μM，cDNA模板2μL，灭菌蒸馏水8.5μL。
实时荧光定量PCR的程序：95℃预变性30s，接下来95℃～5s、55℃～30s和72℃～30s共40个循环；循环结束后绘制溶解曲线：65℃～95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每个样本均设置3个定量PCR重复。
本发明通过BestKeeper和GeNorm软件对10个内参基因稳定性进行评价，经过综合分析，筛选出芍药干旱胁迫下稳定表达的内参基因，获得一个最优的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因EF-1α，序列如SEQ ID NO.1所示。
芍药干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，该引物序列如下：EF-1α正向引物5’-ATGCGTTGGTTTGTTCCT-3’；EF-1α反向引物5’-GTGTTCAAAGCACCGAGG-3’。
实施例1：芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选
基于前期芍药品种‘大富贵’正常生长与干旱胁迫12天叶片的RNA-seq数据库，获得86285个Unigene的RPKM值，找到10个表达稳定的Unigene适于用作候选内参基因(见表1)。
表1 RNA-seq中代表各Unigene表达水平的RPKM值
转录组中序列编号 正常生长 干旱胁迫12天 序列编号
Unigene0046727 306.69 311.52 SEQ ID NO.1
Unigene0044909 7.39 7.04 SEQ ID NO.2
Unigene0067578 4.57 4.43 SEQ ID NO.3
Unigene0056262 31.12 30.62 SEQ ID NO.4
Unigene0034013 5.71 5.73 SEQ ID NO.5
Unigene0058719 5.86 5.89 SEQ ID NO.6
Unigene0041533 13.44 13.60 SEQ ID NO.7
Unigene0028749 19.71 19.58 SEQ ID NO.8
Unigene0038511 4.31 4.54 SEQ ID NO.9
Unigene0038736 23.22 23.83 SEQ ID NO.10
针对以上找到的10个在干旱胁迫下表达稳定的候选内参基因，分别设计实时荧光定量PCR检测引物，其序列如表2所示：
表2 10个在干旱胁迫下表达稳定的候选内参基因引物序列
Figure BDA0002585311260000051
Figure BDA0002585311260000061
实施例2：候选内参基因的表达稳定性分析
以芍药主栽品种‘大富贵’三年生盆栽苗为材料，在自然干旱处理前连续3天在每天17：00时正常浇水，而后进行自然干旱处理(0天、4天、8天和12天)。样品采集后立即采用Trizol试剂进行RNA提取，反转录使用5×M-MLV Buffer反转录酶(TaKaRa，Japan)，利用Oligo dT 18引物进行cDNA的合成，具体操作均参照试剂盒说明书进行。以获得的cDNA产物作为PCR扩增的模板，采用
Figure BDA0002585311260000063
Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa，Japan)试剂盒及表2中的引物组合进行实时荧光定量PCR反应，反应程序：95℃～30s，[95℃～5s，55℃～30s，72℃～30s]×40个循环；溶解曲线程序：65℃加热至90℃，5s，每0.5℃收集一次荧光信号，每次反应要设置三个重复。在PCR完成后，获得相应的域值循环数，即Ct值，具体列于表3。
表3芍药不同干旱胁迫时间下候选内参基因的平均Ct值
Figure BDA0002585311260000062
Figure BDA0002585311260000071
BestKeeper软件分析：BestKeeper软件是基于内参基因Ct值获得每个基因之间产生配对的相关系数(r)、标准偏差(SD)和变异系数(CV)，再通过比较各个值的大小，最终确定稳定性较好的内参基因。判定原则为相关系数越大、标准偏差和变异系数越小，内参基因稳定性越好，反之，稳定性越差；当SD＞1时，则该内参基因表达不稳定。分析结果列于表4，ACT2、UBQ3、ACT1和RNA Pol II的SD数值均大于1，而其余基因SD数值均小于1，内参基因的稳定性依次为EF-1α＞His＞eIF＞UBQ2＞UBQ1＞TUB，表达最稳定的是EF-1α，最不稳定的为RNA Pol II。
表4 BestKeeper软件分析结果(SD＜1表示基因表达稳定，可以作为内参基因使用)
排名 基因名称 SD值 CV值
1 EF-1α 0.12 0.52
2 His 0.18 0.77
3 eIF 0.27 1.03
4 UBQ2 0.30 1.00
5 UBQ1 0.32 1.21
6 TUB 0.68 2.38
7 ACT2 1.01 3.39
8 UBQ3 1.06 3.67
9 ACT1 1.10 3.70
10 RNA Pol II 1.16 5.21
GeNorm软件分析：GeNorm软件通过计算出每个内参基因稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差；软件默认值为1.5，M值小于1.5的基因可以作为内参基因使用，且M值越低表示基因越稳定。分析结果列于表5，10个内参基因的M值均小于1.5，内参基因的稳定性依次为UBQ2≥UBQ1＞EF-1α＞His＞eIF＞TUB＞ACT1＞UBQ3＞ACT2＞RNA Pol II(图3)。
表5 GeNorm软件分析结果
排名 基因名称 稳定值
1 UBQ2 0.29
1 UBQ1 0.29
3 EF-1α 0.31
4 His 0.43
5 eIF 0.48
6 TUB 0.58
7 ACT1 0.80
8 UBQ3 0.95
9 ACT2 1.09
10 RNA Pol II 1.24
候选内参基因的表达稳定性综合评价：综合考虑Ct值、BestKeeper和GeNorm软件的分析结果，内参基因的稳定性依次为EF-1α＞UBQ2＞His＞UBQ1＞eIF＞TUB＞UBQ3＞ACT2＞ACT1＞RNA Pol II，鉴定出EF-1α是适于芍药干旱胁迫条件下最稳定的内参基因，可以应用于芍药干旱胁迫下基因的表达水平研究。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因及其专用引物和应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1550
<212> DNA
<213> EF-1α基因(Artificial Sequence)
<400> 1
cctaaaactt actcaccttc tctataaatc cagttactgc ggcgagggct atcgactctt 60
gctctccatc tcctccgacg cttctcaggg acaacaatct ccggaaagcc atggccgtgg 120
ccggtatatt gcacgctggg aatacaaaca agaatgctta caaggcactc attgctggtg 180
agtattctgg cgtcaaagtt gaattggtca acgagtttga gatgggagtt tccaataaaa 240
ctcccgagtt ttataagatg aatccaattg gaaaggtccc agtgctggag acacctgaag 300
gccctgtctt tgagagcaat gctattgcgc gctatgtcag tcgcttgaag gctgataatc 360
ctctttatgg ctcttcccag attgaatatg gccaaattga acaatggatt gatttttctt 420
cattggaaat tgatgctaat atcatgcgtt ggtttgttcc tcgaattggt tttgctcaat 480
accttcctcc tgcggaggaa gctgcaattc aagcattgaa gagagccctc ggtgctttga 540
acacacacct tgcttccaac actttcttgg ttggacactc tgtgacattg gctgatatca 600
ttacaacttg caacttggtt cttggattca ctcgaatcat gaccaaggac ttcaccagag 660
agttccctca tgtagagaga tacttttgga ctatggtgaa ccagccaaac ttccacaaga 720
tattgggtga ggtgaaacaa actgactctg ttccagctgt ttctcagcca ggaaagaaaa 780
aggaggcagc taagaaggat gagccaaaga agaaagaagt agagaagaag aaagaagtag 840
agaagcccaa acctgcagag gttgtcgagg aggaagcacc acccaagccc aaggcaaaaa 900
atgcgcttga tcttttgcct ccaagcacga tggttcttga tgattggaag aggttgtatt 960
caaacacaaa gtctaatttt cgtgaggtgg ctatcaaagg attttgggac atgtatgatc 1020
ctgagggata ctcactttgg ttctgtgact tcaagtacaa tgatgagaac acagtctcct 1080
ttgtgacctt gaacaaggtg ggtggattct tgcagagaat ggatttggct aggaagtatg 1140
cctttggaaa gatgcttgtg attggaaatg ctgcccctta caaggttaag ggtttgtggc 1200
ttttccgtgg gcaagagatt cctcaattca ttatggatga gtgttacgac atggagttgt 1260
atgactggac caaggttgat gtctccgatg aggcacagaa agaacgtgtg aatcagatga 1320
ttgaggatgc ggaaccgttc gagggggaag cattacttga tgccaaatgt tttaagtaaa 1380
aggaggaatt cccactcttc aattcccatt ccttactctt accggtgatt ttgtgtttga 1440
aactgtttag gtcttatctt tgtttggatg tgtttttaag acattcgtga ggtgtttttg 1500
gtgccatgta gacttgagtt ttatcaagta ctttttttta ttaagtttgg 1550
<210> 2
<211> 2031
<212> DNA
<213> ACT1基因(Artificial Sequence)
<400> 2
gttaatataa actcacactg ctctcgtctt tgccgtgctg cgtcccgctg cgactgtttt 60
cgctgttgtg ctctcatcgg aactgcacat tctcagccat agccttttgt tttgtttcct 120
tcccatgctg tccatgcagg agcccacata gatcccattt ggctgctgca tccagtgttt 180
taaaaggcgg aaggcgtgca aagctgaaat tcgtgtgaaa tttcacgaca ctagacgacc 240
ccaacttcac gtccaccatg ggaagagagc agctgcccta atcttcatca ttacaaatcg 300
aattatgagg cctttttggt ttatgaataa tctttttttg tgttttattt tataataaga 360
ctttaatttt acagggaatt attgtttatt attattttta tttttaaaat tttggcttca 420
tactactagt ttggctccct gaagtgaaga ttggtgggtt cgctcctgca gacatgtatg 480
gaggtgatga agtttcagcc atagttgttg atttaggttc acatacctgc aaagccggtt 540
atgcaggtga agatgctccc aaggctgtct ttccaacagt tgttggatca attgatcaaa 600
tggaagttga tgaccctgaa aatactgaaa acaattctgg gtctgttcaa gattctaaga 660
acaatgtcag accccttgat tctgacaaaa gcaagggaaa gcgtaaatta tatgttggtt 720
ctcaagcctt agcgtatcgc cgagatcata tggaggtgct ctcaccttta aaggatggaa 780
ttgttgttga ctgggatatt gttgacaaca tatgggacca cactttcagg gaatgtctat 840
tgattgatcc taaagagcat ccaatgctac tcgctgaacc gtcatttaac actcaacaac 900
aaagagagag gacagcagag cttatgtttg agaaatacaa agttcctgca atatttttgg 960
gcaagaatgc agttctaaca tcttttgcat ctgggcgtgc tacatcatta gttgtggata 1020
gtggtggagg atctacttct gtagcccctg tgcatgatgg ttatgttatt caaaaggctg 1080
ttgcaacttc tcccattgga ggggaacttc tttctgattg cttaatgaaa agcttggaaa 1140
gcaaaggcat cacgataaaa cccagacatt ctttcaaaag aagggaaatg cggccaggag 1200
agtttcagac agtagatctt gattttccaa gtacaactga aagttataag ctctattccc 1260
agagggtaat tgcaagtgat attaaggaat gcgtgtgtcg agccccagat actccatatg 1320
atgaaagggc atattcaaac attccgacga catcatatga gctccctgac gggcagacat 1380
tagaaattgg atctgataaa ttcaagattc ctgatgttct gttcaaccca tctttggttc 1440
agacaattcc tggtatggag agctttcaag agattgctgc ttctgctcgt ggtcttcccc 1500
aaatggttat tgagagcatt aacaagtgcg atgtggacat tcggaaagaa ctatttagca 1560
gtatattgct tgctggtggc acgacatcca tgcaacagtt gaaggaacgt ctcgagaaag 1620
acttactaga ggagtctcct catgctgcta gagttaaagt attagcaagt ggaaattcaa 1680
tggaaaggag attcagtgtt tggataggag ggagtatatt ggcatcgctt ggctcatttc 1740
aacaaatgtg gttttcgaag gcggaatatg aagagcatgg tgcttcttat gtccagagaa 1800
aatgcgctta acatgctgac ggggttattt gtatttcttt ttcccaagga aatattatct 1860
gggccacttg caaatcccaa ctggtttctt tttatgttgc tactaattta ttgttctgag 1920
ggttgaggaa ggtctcagat gttaagaggt tgagatccaa aatttgaagg tgtagacagt 1980
aaaaacttag cctaactatg aaatctaaaa tttgaaggtt gagattaaat t 2031
<210> 3
<211> 624
<212> DNA
<213> ACT2基因(Artificial Sequence)
<400> 3
tctctctctc tctctctcat ctttcttctt ttcaaagatg gaaggctctg tggaatctat 60
gagcaaagca agaactgaag ataattctcc agaggagagt ggttggacta tttactttga 120
ggatttcttg tccaagaagg atgagcacat gactactttc tcttctggta ctaatggatc 180
cacttctatg gtgtctgatg cttattcttc agctgccacc aagaagttag tgaatactga 240
cgaggttgct gaaagatatc ctttacagaa aagttgtagg aatttaagtt tcaagaagag 300
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ttttattggg aaagatagtg actgtacaga gctgaagaaa cgagggcttt gcttagtacc 540
attgtccatg cttgtgaacc atcttggttg atggcaattt atcaatgcat cagtactctc 600
tctctctctc tctctctctc tctc 624
<210> 4
<211> 1676
<212> DNA
<213> UBQ1基因(Artificial Sequence)
<400> 4
ttggacacat cagataatag ttaagctcga aatccattca atttctgaca catcagaaat 60
taacaaatca acacaaaacc accacttcgt tttttttttt ttaatccaat tcccattgcc 120
aatcatgtct gtctacgtcc tatccaatta aaaacatttc gatttttaat ggattgaatt 180
gaatttcacc gagtcgagtc gtcgtgttag ggtttctgca aattcaagag gtttctgcaa 240
attcaagatt tcgaggttgc acgataaaga atggcaacaa caaggtcttc gagccgttca 300
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cggcgagcca gcagccgtcg gatgatgcgt gagccatcaa tgatggtacg cgagactgcg 480
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cttcacatgg tttgtgtttg cgtggagtat cggaggcggc ggaggcggac acatgcattt 720
gcggtggagg caggtggaga gagcggcgag aattggagtt cgagttcggg aggggattca 780
tcgcattatg tttcattggc ccaaatacag gaggagggta caagcagtgt cgcaaagcac 840
ctggaatctg caaatactat gttttcgttt gtttggtgga tcattggatt ttattgggta 900
tctgctggtg gccaagcttt ggcacacgac tcgccccaac tttactggct ttgtataata 960
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attgctgttt gctgctgtct tccatgtatt attgcaattt tgtatgctgt ggcagaccag 1080
gaaggagcat ctaaagatga cattgaacaa cttgtaaaat acaagtttcg aaagattagt 1140
ggtaatatcg agaaacaaac tggcgagata gatggcagtc cgtctggagg aattatgact 1200
gaatgtggca ctgattcacc catcgaacac gtcctttcat tagaggacgc ggaatgttgt 1260
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ctggcgcctt gcaatgctat gctgtattgc gggcttttat aaagtgcttt tgtgtatacg 1500
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gattttatgt tgataatggc ttgatagcag tatgggagag cctttgaaat ttagaa 1676
<210> 5
<211> 2018
<212> DNA
<213> UBQ2基因(Artificial Sequence)
<400> 5
ttattcttaa gggtaccttg ttttcacaac aaagaaagac aggagaacgt atgtgccact 60
gaatttatta ttttggaaca tcgaggatca gttcaagatg tccgggttcg tagacttgct 120
attccaaatc ggcgtcaact tgggtcatag tgaagagatc ccaaactata tgattaaaga 180
tctaagtatt tacctactac atacacttgg acggagctta aacgtcgatg tcgtcaacag 240
gcttgccaag caactttatg atgtagattc tcatcctgga aaaaagaaga aaaacagaat 300
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tttacaacgt gatcgaaatg atgggagtgc cagtgcatgt ctatataatc tcagaagaac 720
cacttcctac ttgaacgcca caatacaatg ccttcatcgt gtcccagagt tgaaggcagc 780
tttaactaag tggcatcctc tctttgaaac aagctgtgac catctcttga ctgctgccat 840
gcgtgatctg tttaaacaac ttgataaaaa tgctgagcct gtggcaccca gggtgttttt 900
gcagctgttt gaggaaatga atcctatgtt ggggctgagg gataatcaca accccaagga 960
agctgagaca tgttggaata aacttctggg aaccctttcg tcaaagtctc ataagtcaac 1020
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gggtcagagt gcaggtaaca agatcaattt attcgaggtg gatgcatatg aaatgtgttc 1320
agacgaactt cgtgcgaaat tgcaagcggt tcgcaagaga gctggtatga aagtgtgtgg 1380
gaagagctct agtttgaagg accaagatgt gaagatgtct gatccaaagg cattgggcga 1440
catttgcagg tgatgggtga aatccgcgca gaatctcttg caatatttta gcatcaagtg 1500
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cttgtaagga aggtgttgta tctgagcagg aaacgcagtt aacaggggta tatcgtttgt 1620
ttgctatttt gtcttaccat aagtcgtttt acccccatag ggccaagtac aagggtcatt 1680
atgatgcttt tttgaaggca gaaataaatt caaaacaaag gcccttttgg ttacagtatg 1740
ttgacgaaaa tgtttttccg ctacgagcag aacatgtcat tgatattatg agagcagctt 1800
ggggtcacgc accctacatt tgcttgtata gagctctggt tttgaagcca aagactagtg 1860
ttcaagttgc gcattgattg aaacgtgtga gaaaacatgt cttatgggct aagttatgac 1920
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caatttattt tggtctaata atttagaatt tttttttt 2018
<210> 6
<211> 2041
<212> DNA
<213> UBQ3基因(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagctttat ttttctttgc ttttccagat cagaaattag aggtttttag agagagggtt 60
tcccagatca gaattcagag gttttagtga ttgcgtacac gatcgccatg gcgcaatctc 120
ctcttcgagg acaacaatct tttgatggag aaactttcca acacgatgat tcgtttgtgg 180
aaagttttta cgcgtctgcg attgaagaag gcacttcacg aattttggat ttctctgcag 240
aacctttcca agaagatata tcgttcgaac aaatttatac atgtttttct atcttcggtg 300
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gtatccctaa ccctaaacaa ttattggaag caacgctgaa gaatttctgt tctctcacca 660
atggggatac catcttgatt actcatgagg gtaagagttt ctacattgat atagtagaaa 720
ttaaaccatc atctgctgtg agcataatag atacagattg tgaggttgat tttgcccctc 780
cgttggacta taaagaaccc aaaaaaacaa aaacccatat cgtctgcgcc caaagataat 840
ttgtcaaagg aagaccaaga accaaggttc aaacctttca ctggtggggc gagacggttg 900
gatgcagaac ctctgacaga attgggtaaa atacttgtgt caaaagttga tcaattgatt 960
gctgcaaatg ggttaagcag aggagctcaa tccagttctg atgccctctt gaaggaagaa 1020
caaggaaaac ctaagttcaa gccgttcact ggtggtgcga gaagattgga tggacagcca 1080
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ctaagcaggg tcactcaatc aaacattggt tcatcacaga atgcaccagc tgaggaagaa 1200
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acagagtttc cttcattacc tgtgctgaaa aaggagaaat tgattgctgc aaatgggctt 1320
aggagcactc agtcaaactt tggcttgtca tcgaacaatg aacctgcaaa ggaagaagaa 1380
ccaaagttca aacaatctac tgccagggtg aaatcagggg cagaattggc ctcaatacct 1440
gccgggatga ttgctgcaaa tggcctaact tgtgtgccaa cacatgcgcc agctaagaaa 1500
gaacaaatac caaagtccaa tccagaatta gcttcagtac ctgaggatca attgattact 1560
gcaaatggga taagcaggac cactcaatcg gagtttgact cacataagcg cccaatagag 1620
tttgttatgg gttctgactt agtactgcct ccggagaaat tagcaaagac ctcgagagac 1680
ttctcaaagt tcaaaactga gttagcttca gtaccagtgc taaaaaagga tcaatcgatt 1740
gctgcaaaca agctaagcag caccactcag tcgaagtttg gctcacgtaa gcgcccaatg 1800
gagtctctgg attctgactt agtactgcct ccacagaaat taaccaagat ctcgacagag 1860
ttcactaagt tgaatctgtg aggaatgaag tcaaacttga tgctttaggg tggtggtgtt 1920
aggtatttga gtaaattgta aatgttctgc ggacataatg aaatagattt ttccattcct 1980
ctttctttct ttcttgtaat attttagtta catgcccatc aatgatagtt tagtagactt 2040
c 2041
<210> 7
<211> 2305
<212> DNA
<213> eIF基因(Artificial Sequence)
<400> 7
tattaaaaat tctcacctct tatatggcgg cccattttcg tcaattactt ttacatgggc 60
tcgagtccaa caagtctcgg ctcttgtata gtctacaaac ccagagtaat tcctctttca 120
atcggctgaa aaccacacgc catccgaatt aatttcccga ctcaccggga actcagccgc 180
cgactggtcg actcactaga agaacttggc cacatatctc ttctgtttgg tgtacaaagg 240
atttaccaat aagacagatt ttcagagact attagcactg gtttgttctt cagcttcaga 300
caatccccgg gtctgggatg gcagctgtgg actgttcacc accattggag attttagttc 360
gaggacccga gggtttctcg ctttggaatg gtcccccatt caacaatggc caacctgtta 420
tcaagcttga aacagttgct tgcaacagtg cgaagttcag cgaagacgga tccaaacttt 480
ttgttatgaa gtctgactct atgattagca tatatgattg cagaagctca aaagagatca 540
aatcccttga aatcccgaac attttggcag caacattgtc cccctgtggg acttatcttc 600
agacctttca aagatcctca tcaccacagg aaaagaatgt caccttatgg aagacagaca 660
caggtgctcc tgtttaccaa cagttccaga agaacatgac gaaaaccaac tggcccgcaa 720
tccagtttag ctctgatgaa tctattgcat gtcggatggc aacaaatgag atacaatttt 780
ttgatactgg ggatttttct aaaggaattg taaatcgctt aagaattcct ggagtgacta 840
caatagcaat ttctaaggca cctgggactc atgttgctgc atttattcca gagtctaagg 900
ggattcctgc cagtgtccag atattttctt gtgagaaaga tcgacaaagt caacctgttg 960
ctaggaggag ttttttccga tgttcgtcgg tgcaaatgag ttggaacaat ggttccactg 1020
gtcttttagt tgtggtgcaa tcggatgttg ataagacgaa ccagagttac tatggagaat 1080
caaagctaaa ctacttgaca accgatggaa cccatgaagg gcttgtgcct cttcgtaaag 1140
agggccctgt tcatgatgtt caatggtctt cttctggttt agaatttgct gttgtttatg 1200
gctttatgcc tgcaagcgcg accgtgtttg acaagaagtg caggcctcta ctcgaacttg 1260
gatcaggtcc ttataatact attcgctgga atccaaaagg aaaatgtatc cttagttatg 1320
aaatgttact ttatactctg gggggtttga aattgcccaa tcatccttct tttgacctat 1380
ttaaattttg ttgccttaat catctggttt gcagttctat gtttggccgg ttttggcaac 1440
ttgcctggtg atatggcatt ttgggactac atggagaaaa agcagcttgg tacaactaag 1500
gctgaatggt ctgtaacaag tgaatggtcc ccagacggac gctattttat gactgccaca 1560
acagctccaa gactacaagt cgataatggg tatgtttctc tttggtcata tgtgggttta 1620
agaaagaagg gcttgtacgg tgtgcttttt ttatttttta ttttttaaat ttgcgcaata 1680
ctttgcaaaa actatttatt aacattccca cacatcttga actaaatgct tgaatttggt 1740
agctgcttat taaaaaaaat tatactgttt gtatgctttt tttcttattg aaggataaaa 1800
attttccact acaatggatc cctattcttc aaaaagatgt ttgacaagtt gtaccaggtg 1860
gattggaaac cagaattgcc cgataggttt ggtgaaatta ctgaactcat caagtccatt 1920
gattcattaa aggttgaaga aaccaaacca caaggacaag ggtcgaaacc ttccaaggct 1980
tctacaaagg ccgcctctat gaaccctcct gcatcgaaac ctactgccta tcgtccacca 2040
catgctaagg ctgcagcttc cattcaggcc gagctgtttg gaggaagccc tgcagaagaa 2100
atgagcaaga atgcattgag aaacaagaaa agaagggaga aacaaaagga gaaaaaggct 2160
gctgagggca gtacttgatc gcctgcgggt gtcatgtggg gacggctgct tattgcatta 2220
catcatcaac gcgggagttc aatgtaatat ttgttttcca tgagggcttt ttggtttttt 2280
attataaata attattaagc ccaac 2305
<210> 8
<211> 624
<212> DNA
<213> His基因(Artificial Sequence)
<400> 8
ctttctaaaa gcttttctct ctccaaagtt cagccgatgg cgcccagggc agagaagaag 60
ccggccgaga agaaaccagt ggaagtgaag aaggctgaga agactccggt cgccgctgag 120
aagaaaccca aagccgagaa gaagctcccg aaggaatcaa ccgacaagaa gaagaagagg 180
tcgaagaaga gcgttgaaac ctacaagatc tacatcttca aggtcctgaa gcaggtccac 240
ccagacatcg gtatatcaag caaggcgatg gggatcatga acagcttcat caacgacatc 300
ttcgagaagt tagcccaaga gtcatcgaag cttgctcgct acaacaagaa gcccaccatc 360
acttctcggg agatccagac tgccgtcagg cttgtcttgc ctggtgagct cgccaagcac 420
gctgtgtcgg agggaaccaa ggccgtcacc aaatttacca gttcttaggt tttctatgca 480
ttatgggtat ttagggttta gtgtgctttt ggtcataaat tctgaaattt ctagttgtaa 540
agactagttt tttttgttgc ttgttttaaa tttccagtgt tctatcatct atgtaatttc 600
tggcgttgaa ttacaaatta atca 624
<210> 9
<211> 1951
<212> DNA
<213> TUB基因(Artificial Sequence)
<400> 9
atgattcccc ccataaaagc ttaaacatcc actagcggca gtgctcataa atttccagat 60
ttctctttct cacatttcct ttagctttcc ctctcttttc aaaaaggtat cgcgccagag 120
caaagagaaa tactatatat tcgacctttc tcggatcgaa accccaattt tattgagaaa 180
gaaaagaaaa catgcctaga gaaattatca ctctgcaagt gggacaatgc gggaatcaga 240
tcggaatgga gttctggaag caactatgcc tcgagcacgg catcagtagg gaaggcattc 300
ttgaagactt tgctactcag ggaggtgaca ggaaagatgt atttttctat caagccgatg 360
atcaacacta tatacctcgg gctttactga tagatttgga gcccagagta attaatacta 420
ttcaaaatgg tgaatatcga aacctctata atcatgagaa catatttgtt tcggatcatg 480
gagggggtgc tggaaacaac tgggccagtg gttatcatca gggaaagggc gttgaagagg 540
atatcatgga catgattgac agagaagctg atggaagcga cagtcttgaa ggttttgttc 600
tatgccattc aattgctgga ggaacaggct caggcatggg ttcatatctg ttggagaccc 660
ttaatgaccg ctacagtaag aaacttgttc agacatacag tgtatttcct aatcaaatgg 720
aaacaagcga cgtagtggtc caaccataca actcactatt gacgctcaag cgactaacac 780
taaatgctga ttgtgttgtt gttcttgata ataccgcgct gaatagaatt gccgtggagc 840
gtcttcatct atcaaaccct acctttgctc aaacaaattc tttggtttct acagtaatgt 900
ctgcaagcac aaccacattg agatatccag gatacatgaa caacgacttg gttggccttc 960
ttgcttcttt aattccaacg cctaggtgcc attttcttat gaccggatat acaccactca 1020
cagtggagcg ccaggctaat gtgattcgta aaactactgt attggatgtt atgagaagac 1080
ttcttcagac aaaaaatatt atggtctcct cttatgctcg aacaaaggaa gctagtcaag 1140
ccaagtacat atcgatatta aatatcattc agggagaagt ggaccctact caggttcatg 1200
aaagtttaca gaggatacgt gagagaaaac ttgttaattt tattgaatgg ggtcctgcga 1260
gcattcaggt tgctttatct agaaagtctc cgtatgttca aactgcccat agggtgagtg 1320
gccttatgct agcaagtcac actagtatca ggcacctctt cagcaagtgc ttgagccaat 1380
atgagaagct gagaaagaag caagcctttc ttgacaacta tcggaaattc ccaatgtttg 1440
ctgacaatga tctttcagag tttgatgaat caagagacat cattgagagt ttggttgatg 1500
aatataaagc ctgtgagtcc ccagattaca tcaaatgggg aatggaggat cctgaacaca 1560
tgttaacagg agaaggcagt gctgcaggaa caatagatcc aaagttagca gtatgaacta 1620
accaaagtga aatagcagtg ttgctcaaac taaactggtt ggaagattgt aagtagagtt 1680
gatgttgatt tcttgctttc tggaacatga aatggtaatg gtaatgataa tgtaatttgg 1740
cttttttttt ttttttgttg gtcttttata atattcaatt tactctggga gaagaagtac 1800
acatggatga gctttttcag acttaatcaa gtattatgta agttggtacc ctgaaatgat 1860
caagtgccag aattaaagct accagattgt tgtagcctgg atccattagg cgttaggtaa 1920
gtgatccccc cgcccccaca agaagtaaaa a 1951
<210> 10
<211> 815
<212> DNA
<213> RNA Pol II基因(Artificial Sequence)
<400> 10
aacctatccc cctctctctc gttgagctag ttgctgctgg caacttttct ccttgaagca 60
agagtatact tcgaaatata agcaaatccc ttcctttcaa ttgcagaggt cttcaaagcc 120
tagttgcgaa gatgttcttc catataattt tggaacgaaa catgcaactc caccctcgcc 180
acttcggtcg tcaactccgt gaaaatctag tttcgaaact catgaaggat gtcgaaggca 240
cttgcagcgg ccgacatggc tttgtagtgg caataacggg tattgaaaac attgggaagg 300
gtttgattcg agacggaaca gggtttgtga catttcctgt aaagtatcag tgtgtcgtgt 360
tcagaccatt taaaggagag atcttggaag ctgttgttac catggttaac aagatgggtt 420
tcttcgccga agctgggcca gttcaaattt ttgtttcaaa ccatttgata cctgatgata 480
tggagtttca atctggagat gcaccaaact atacaacttc agatggatcg gttaagattc 540
aaaaagacag tgaagtgagg ctaaagataa ttgggactcg agtcgatgct acagaaattt 600
tttgtatcgg cacaataaaa gatgatttct tgggtgttat caatgatcct ggaacggctt 660
agaggtgttt ttggaagttg aagttgcttg tttgcgttaa aatatttgta ttataaaatt 720
gggttttttt ttatcttctt aattacatta agttatattg tatctctaat ttccctttaa 780
atagggtaac tcatgtactg aaactctttt gtacc 815
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> EF-1α基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcgttggt ttgttcct 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> EF-1α基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgttcaaag caccgagg 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> ACT1基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 13
ggttctcaag ccttagcg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> ACT1基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 14
cggttcagcg agtagcat 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> ACT2基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 15
agagtggttg gactatttac 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> ACT2基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 16
gcatcagaca ccatagaa 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> UBQ1基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgcgtggag tatcggag 18
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> UBQ1基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 18
gccaatgaaa cataatgcg 19
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> UBQ2基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 19
ctacatacac ttggacgg 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> UBQ2基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 20
ctgcaagacg tattctgt 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> UBQ3基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 21
gcgattgaag aaggcact 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> UBQ3基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 22
cccgattaga ctcaccga 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> eIF基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 23
agttcagcga agacggat 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> eIF基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 24
atgttcggga tttcaagg 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> His基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 25
gtggaagtga agaaggct 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> His基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 26
tataccgatg tctgggtg 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> TUB基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 27
tatctgttgg agaccctt 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> TUB基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 28
cagcatttag tgttagtcg 19
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> RNA Pol II基因的上游引物(Artificial Sequence)
<400> 29
ggtttgtgac atttcctg 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> RNA Pol II基因的下游引物(Artificial Sequence)
<400> 30
atagtttggt gcatctcc 18

Claims (10)

1.一种芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因是EF-1α、ACT1、ACT2、UBQ1、UBQ2、UBQ3、eIF、His、TUB或RNA Pol II，所述内参基因是EF-1α的序列如SEQ ID NO.1所示；所述内参基因是ACT1的序列如SEQID NO.2所示；所述内参基因是ACT2的序列如SEQ ID NO.3所示；所述内参基因是UBQ1的序列如SEQ ID NO.4所示；所述内参基因是UBQ2的序列如SEQ ID NO.5所示；所述内参基因是UBQ3的序列如SEQ ID NO.6所示；所述内参基因是eIF的序列如SEQ ID NO.7所示；所述内参基因是His的序列如SEQ ID NO.8所示；所述内参基因是TUB的序列如SEQ ID NO.9所示；所述内参基因是RNA Pol II的序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因优选是EF-1α、ACT1、ACT2、UBQ1、UBQ2、UBQ3、 eIF、His、TUB或RNA Pol II，所述内参基因是EF-1α的序列如SEQ ID NO.1所示；所述内参基因是ACT1的序列如SEQ ID NO.2所示；所述内参基因是ACT2的序列如SEQ ID NO.3所示；所述内参基因是UBQ1的序列如SEQ ID NO.4所示；所述内参基因是UBQ2的序列如SEQ ID NO.5所示。
3.用于扩增如权利要求1所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的专用引物，其特征在于：
所述内参基因是EF-1α的引物序列是：
EF-1α正向引物5’-ATGCGTTGGTTTGTTCCT-3’；
EF-1α反向引物5’-GTGTTCAAAGCACCGAGG-3’；
所述内参基因是ACT1的引物序列是：
F：5’-GGTTCTCAAGCCTTAGCG-3’；
R：5’-CGGTTCAGCGAGTAGCAT-3’；
所述内参基因是ACT2的引物序列是：
F：5’-AGAGTGGTTGGACTATTTAC-3’；
R：5’-GCATCAGACACCATAGAA-3’；
所述内参基因是UBQ1的引物序列是：
F：5’-TTGCGTGGAGTATCGGAG-3’；
R：5’-GCCAATGAAACATAATGCG-3’；
所述内参基因是UBQ2的引物序列是：
F：5’- CTACATACACTTGGACGG-3’；
R：5’- CTGCAAGACGTATTCTGT-3’；
所述内参基因是UBQ3的引物序列是：
F：5’- GCGATTGAAGAAGGCACT -3’；
R：5’- CCCGATTAGACTCACCGA -3’；
所述内参基因是eIF的引物序列是：
F：5’- AGTTCAGCGAAGACGGAT -3’；
R：5’- ATGTTCGGGATTTCAAGG-3’；
所述内参基因是His的引物序列是：
F：5’- GTGGAAGTGAAGAAGGCT -3’；
R：5’- TATACCGATGTCTGGGTG -3’；
所述内参基因是TUB的引物序列是：
F：5’- TATCTGTTGGAGACCCTT -3’；
R：5’- CAGCATTTAGTGTTAGTCG -3’；
所述内参基因是RNA Pol II的引物序列是：
F：5’- GGTTTGTGACATTTCCTG -3’；
R：5’- ATAGTTTGGTGCATCTCC -3’。
4.根据权利要求3所述的专用引物，其特征在于：
当内参基因是EF-1α时，所述引物序列是：
EF-1α正向引物5’-ATGCGTTGGTTTGTTCCT-3’；
EF-1α反向引物5’-GTGTTCAAAGCACCGAGG-3’；
当内参基因是ACT1时，所述引物序列是：
F：5’-GGTTCTCAAGCCTTAGCG-3’；
R：5’-CGGTTCAGCGAGTAGCAT-3’；
当内参基因是ACT2时，所述引物序列是：
F：5’-AGAGTGGTTGGACTATTTAC-3’；
R：5’-GCATCAGACACCATAGAA-3’；
当内参基因是UBQ1时，所述引物序列是：
F：5’-TTGCGTGGAGTATCGGAG-3’；
R：5’-GCCAATGAAACATAATGCG-3’；
当内参基因是UBQ2时，所述引物序列是：
F：5’- CTACATACACTTGGACGG-3’；
R：5’- CTGCAAGACGTATTCTGT-3’。
5.权利要求1或2所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因在芍药实时荧光定量PCR中的应用。
6.权利要求3或4所述的专用引物在芍药实时荧光定量PCR中的应用。
7.根据权利要求1或2所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法包括以下步骤：
1）基于前期芍药品种在正常生长以及干旱胁迫处理叶片的RNA-seq数据库，根据RNA-seq数据库中Unigene的RPKM值获得表达稳定的Unigene适于用作候选内参基因；
2）针对步骤1）获取得到的候选内参基因，分别设计实时荧光定量PCR检测引物；
3）以芍药三年生盆栽苗为材料，在自然干旱处理前连续3天在每天同一时间正常浇水，而后进行自然干旱处理；样品采集后立即提取总RNA，反转录合成cDNA，以获得的cDNA产物作为PCR扩增的模板以及以步骤2）设计得到的引物对不同干旱胁迫时间的芍药叶片进行实时荧光定量PCR验证；
4）将获得的实时荧光定量PCR数据通过BestKeeper和GeNorm软件进行候选内参基因的稳定性分析，最终筛选出最稳定表达的基因。
8.根据权利要求7所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：所述芍药品种是大富贵。
9.根据权利要求8所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：所述自然干旱处理时间分别为0天、4天、8天和12天。
10.根据权利要求9所述的芍药干旱胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤3）中，实时荧光定量PCR的条件是：实时荧光定量PCR反应体积为25μL，包含12.5μL的2×SYBR Premix Ex TaqTM，正向引物/反向引物各1μM，cDNA模板2μL，灭菌蒸馏水8.5μL；
所述实时荧光定量PCR的程序是：95℃预变性30s，接下来95℃~5s、55℃~30s和72℃~30s共40个循环；循环结束后绘制溶解曲线：65℃~95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每个样本均设置3个定量PCR重复。
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