KR101426466B1

KR101426466B1 - 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR101426466B1
Application number: KR1020130040184A
Authority: KR
Inventors: 양태진; 김경희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2014-08-06

Abstract

본 발명은 dCAPS 프라이머 세트, SSR 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트로서, 서열번호 1 내지 6으로 표시된 3개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 고려인삼 (Panax ginseng) 천풍 품종 및 화기삼을 구별하기 위한 프라이머 세트 에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마커는, 엽록체 게놈(genome) gene region 염기서열을 대상으로 개발된 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열로 이루어진다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는, 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9로 표시된 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진다.

Description

고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트{Complete sequencing of Chloroplast genomes of Panax ginseng-derived Maker, DNA primer sets and Kits for discrimination of Panax ginseng cultivars and Panax species and uses thereof}

본 발명은 고려인삼 천풍 품종 및 화기삼 구별을 위한 엽록체 유전자 유래 프라이머 세트 및 이를 이용하여 만든 키트에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 dCAPS (derived cleaved/cut amplicon polymorphism sequence) 프라이머 세트, SSR (simple sequence repeat) 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트로서, 서열번호 1 내지 6으로 표시된 3개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 고려인삼 (Panax ginseng) 천풍 품종 및 화기삼을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 천풍 및 화기삼 품종을 구별하기 위한 키트에 관한 것이다.

고려인삼(Panax ginseng)은 아시아 극동지방에서 자생하는 대표적 약용식물로, 자생지 분포 형태가 우리나라의 삼국시대에 고구려의 영토 및 한반도와 일치하며, 고대의 많은 문헌 기록에서 볼 수 있듯 그 전통이 깊고 역사적으로 명성이 높으며, 전통적으로 국제 인삼 시장에서 고려인삼의 가치와 품질이 고가로 인정되는 바, 한국이인삼의 종주국이라고 할 수 있다.

인삼의 육종은 채종까지 3년, 생육상과 뿌리의 형질 등을 조사하여 우량개체를 선발하는데 5~6년의 기간이 소요되는 등의 특수성으로 인해 우수한 인삼 품종을 육성하기 위해서는 수십 년이 걸리는 어려움이 있다.

이러한 난관 속에서도 한국인삼연초연구원으로부터 순계 분리 육종을 통해 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선 등 9개 품종이 개발되어 등록되어 있으나, 생육과 증식속도가 느리고 종자의 증식량이 낮은 인삼의 생식 특성으로 인해 종자 생산체계가 제대로 확립되지 못하여 우수 품종이 실제 농가에 보급되는 비율은 미미한 실정이다. 또한 육성된 우수 품종들 간의 식별 방법과 기존의 재래 혼계종과의 식별 방법은 생육 과정 중에 경험적인 형태적 관찰을 통해서만 이루어지고 있기 때문에 보다 체계적이고 과학적인 기술이 요구되는 실정이다.

형태적으로 구분하는 방법에 있어서도, 파종 후 많은 시간이 지나서야 식별이 가능하기 때문에 이를 악용하여 재래 혼계종의 종자를 개발된 품종의 종자로 둔갑하여 비싼 값에 판매하는 행위가 일어나고 있으며, 이로 인한 농가의 피해가 증가하리라 예상되고 있다. 개발된 품종들에 있어서도 품종 간 식별이 어려운 단점 및 증식 과정의 비의도적 오염과 혼입 등에 의해 품종의 균일도가 현저히 낮아 명품 인삼을 생산하는데 장애 요인으로 지적되고 있다. 또한, 6년에 걸쳐 생산한 생산품은 뿌리 부위만 유통이 되기 때문에 우수한 품종의 생산품과 우수하지 않은 품종 및 재래 혼계종의 식별이 생육 단계가 아닌 생산품에서 가능하여야 하는데 이에 대한 기반 기술은 거의 없는 상태이며 이를 위한 최선의 방법은 품종을 DNA 수준에서 식별할 수 있는 마커의 활용이다.

최근 다양한 분자생물학적 기법의 발달과 더불어 생물정보학적 영역의 진보도 빠르게 이루어짐에 따라 인간, 동물뿐 아니라 식물에서도 다양한 마커 시스템이 개발되고, 방대한 유전체 정보가 생산되고 데이터베이스화되어 활용되고 있지만, 인삼에서 이와 같은 영역의 연구는 거의 미비한 실정이다. 약용식물로 널리 알려진 인삼은 약리적 성분이나 효능에 관한 연구는 활발하게 진행되어 왔으나 육종이나 유전학, 유전체학 등과 관련된 부분은 연구가 매우 미흡한데, 그 원인으로는 한 세대의 진전에 소요되는 연한이 3~4년으로 길며, 종자증식속도 또한 개체 당 40립 정도로 느리고, 환경에 대한 생육의 변이가 크다는 점 등을 들 수 있으며 이러한 문제들로 인해 체계적 관리가 어려운 실정이다.

또한 아시아의 극동지방에서만 자생해 오던 인삼을 재배화하였기 때문에 유전자원이 극히 제한적이며, 약배양이나 영양번식과 같은 육종에 있어 보조적으로 활용할 수 있는 수단의 부재 역시 인삼의 유전 육종적 연구를 어렵게 하는 요인이 되고 있다. 유전학이나 유전체학적 측면에서 이루어진 인삼의 연구 성과에 대해 살펴보면, 인삼에서 주요한 약리적 효능을 내는 성분인 진세노사이드 (ginsenoside)의 합성경로와 연관된 유전자에 관한 연구 (Jung et al., 2003, Plant Cell Rep. 22: 224-230), 종 구분을 위한 DNA 마커 개발 (Ha et al., 2002, J Agric Food Chem 50: 1871-1875), BAC (bacterial artificial chromosome) 라이브러리 제작과 그로부터 밝혀진 2000여개의 BAC end 서열 (Hong et al., 2004, Mol Gen Genomics. 271: 709-716), EST (expressed sequence tag) 라이브러리 제작으로 밝혀진 6000여개의 서열 (Kim et al.,2006, Plant Cell Rep. 25: 599-606) 정도를 들 수 있지만, 이러한 정보들은 약 3000Mb로 추정되는 인삼 유전체의 1%에도 미치지 못하는 미미한 수준이라 할 수 있다.

SNP (Single nucleotide polymorphism) 은 유전자좌에서 보이는 염기서열의 다형성으로, 염기서열 하나의 변이 차이로 관찰된다. 생물의 유전체에는 같은 종 간 혹은 종 내에서는 다수의 염기서열의 변이를 보일 수 있다. 그러나 엽록체 유전체는 핵 DNA와는 다르게 독립적으로 복제되고 그 DNA가 유전되는 특징이 있으며 비교적 변이 없이 보존되므로 엽록체 DNA에서 발생한 염기서열 하나의 차이는 종 특이적 특징이 될 수 있다.

dCAPS (Derived cleaved/cut amplicon polymorphism sequence) 염기 서열상 존재하는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 마커로 이용하기 위한 마커 개발 방법 중의 하나로 Derived CAPS (dCAPS)마커는 염기 서열상 존재하는 SNP를 PCR 과정에서 변환하여 제한효소 자리를 만들어 내어 특정 서열을 인식하는 제한효소 처리로 변이를 파악하는 마커 개발법이다.

SSR (Simple sequence repeat) 혹은 microsatellite는 유전자좌에서 보이는 다형성으로, 단순 반복 염기서열의 반복 횟수 차이로 관찰된다. 생물의 유전체에 존재하는 많은 수의 simple sequence repeat (SSR) 들을 microsatellite라고 하는데 microsatellite는 2 - 6개의 뉴클레오티드가 단순 반복되어 있는 경우가 많고 이는 DNA 복제시 불균형 교차 등으로 인해 생성되는 것으로 알려져 있으며, 단순 반복서열의 반복수는 식물의 종간 혹은 종내에도 다양한 차이를 보이기 때문에 다형성의 수준이 높은 multi-allelic, co-dominant 마커이고 재현성도 뛰어나다. Microsatellite는 그 주위의 DNA 염기서열로부터 고안된 프라이머를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 통해 증폭시킬 수 있으며, 증폭된 산물은 단순 염기서열 반복수의 차이로부터 다형성을 보인다. 현재 인간, 생쥐에서 고밀도로 포화된 SSR 유전자지도가 작성되어 있고, 벼와 콩 등의 작물에서도 포화 유전자지도가 작성되어 있으며, 식물에서 가장 많이 발견된 반복염기서열은 AT, AG와 AC의 순으로 그 빈도가 높은 것으로 알려져 있다 (Mogante et al., 2002, Nature Genetics 30: 194-200).

한편, 한국공개특허 제2011-0019265호에서는 고려인삼의 품종간 및 화기삼과의 구별을 위한 발현유전자 유래 ＳＳＲ 프라이머 세트 및 이들의 용도가 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0842434호에서는 인삼에서 유래된 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0084772호에서는 ＭＬＰ 유전자에 특이적인 고려인삼 천풍 구별용 ＳＮＰ 프라이머와 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 고려인삼 천풍 구별방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 고려인삼 전체 품종에서 천풍의 구별을 위한 엽록체 발현유전자 유래 ＳＳＲ 프라이머 세트 및 고려인삼 엽록체 서열의 SNP를 기반하여 제작된 DCAPS 프라이머 및 이의 용도에 관해서는 알려진 바가 없다.

대한민국 공개특허공보 제10-2011-0019265호 대한민국 등록특허공보 제10-0842434호 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0084772호

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 현재까지 알려진 인삼 엽록체 DNA 염기서열을 수집하거나 본 연구실에서 생산한 완전한 천풍과 연풍의 chloroplast 염기 서열을 assembly 완성을 통해, 서열들로부터 SNP 및 SSR 모티프를 찾아내고 그 주변의 서열로부터 프라이머를 제작하여 PCR하고 전기영동을 통해 다형성을 확인하여 개발한 엽록체 유전체 발현유전자 유래 ＳＳＲ 프라이머 세트 및 SNP에 기반을 두고 제작한 dCAPS 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼 (Panax ginseng) 품종 중 천풍을 정확하게 구별하고 상기 프라이머 세트(서열번호 5 및 6)로 화기삼을 구별함으로써 본 발명을 완성하고자 한다.

본 발명자들은 고려인삼 천풍의 동정을 가능하게 하는 새로운 DNA 마커를 개발하기 위하여 인삼 엽록체를 이용한 지속적인 연구를 수행한 결과, 두 품종 천풍과 연풍 chloroplast 게놈 시퀀스 정보 완전 분석으로 총 3종의 새로운 엽록체 DNA 마커를 밝혀냈으며, 이들이 고려인삼 품종 내에서 천풍의 식별에 적합함을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한 고려인삼과 화기삼의 식별을 위한 계속된 연구로 고려인삼과 중국삼, 화기삼을 대상으로 화기삼의 식별이 정확함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 고려인삼 천풍의 동정을 위한 DNA 마커 및 화기삼 동정을 위한 DNA 마커를 제공하기 위한 것이고, 또한 엽록체 DNA 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이며, 또한 이러한 DNA 마커를 아가로스 젤 상에서 쉽고 빠르게 확인하기 위한 염기서열 특이적 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 마커는 고려인삼 천풍 품종과 다른 고려인삼 품종 간에 single nucleotide polymophism(SNP)을 보이는 엽록체 게놈(genome) gene region 염기서열을 대상으로 개발된 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 마커는 고려인삼 천풍 품종과 다른 인삼 간에 Indel polymophism을 보이는 엽록체 게놈 rpl32 gene 과 tRNA-UAG gene intergenic region 염기서열을 대상으로 개발된 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 마커는 고려인삼과 화기삼 간에 Indel polymorphism을 보이는 엽록체 게놈 ycf1 gene region 염기 서열을 대상으로 개발된 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 4와 5로 표시된 1개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼 품종간 천풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 6 및 7로 표시된 1개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼을 포함하는 다른 인삼간 천풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 8 및 9로 표시된 1개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼을 포함하는 다른 인삼간 화기삼을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 인삼 종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

상술한 본 발명의 구성에 따르면, 본 발명에 따른 고려인삼 천풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 통하여, 인삼의 품종구분, 동일 품종의 개체 분석을 통한 이형주의 식별 및 제거를 통한 품종의 순도 향상, 이를 이용한 우수 품종의 종자보급체계 향상, 생산된 인삼 뿌리로부터 품종 식별을 통한 고려인삼 제품의 명품화 등에도 유용하게 사용할 수 있기 때문에, 인삼 종주국으로서 국내 인삼 산업을 활성화하는데 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

상기 마커는 고려인삼 천풍을 거의 다른 모든 종류의 인삼에서 구별할 수 있고 식물 엽록체의 유전은 모계 유전하는 특성이 있으므로 인삼의 긴 육종 년 한을 고려한다면 인삼의 종자 선별 단계에서 천풍의 식별을 판단해 천풍 종자의 불법 유출 등을 탐지하고 보호하는 방법으로 활용 가능하다.

도 1a 내지 도 1d는 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위한 dCAPS 프라이머 디자인과 분석데이터이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위한 SSR 프라이머1 디자인과 분석데이터이다.
도 3a 내지 도 3c는 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위한 SSR 프라이머2 디자인과 분석데이터이다.
도 4는 본 발명의 기반이 되는 고려인삼 천풍 품종과 타품종간 엽록체 서열 다형성 지역을 나타내는 엽록체 전체 게놈 지도를 나타낸다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 및 작용효과를 설명한다.

본 발명은 우리나라에서 재배되고 있는 고려인삼(高麗人蔘)의 품종 중에서 선발육종을 통해 품종등록이 완료된 대표적 우수품종인 천풍과 고려인삼 품종 간의 엽록체 유전체 서열의 비교분석을 통해 고려인삼 천풍의 구별을 목적으로 하는 것과 인삼의 엽록체 유전체 서열의 비교분석으로 화기삼의 종 간 구별을 목적으로 하는 것으로 이는 인삼 세포 내 엽록체 유전체 DNA의 염기서열 차이를 이용한 천풍 품종 및 인삼 종 간의 구별 방법을 분자생물학적인 방법을 통해 정립한 것이다.

인삼의 판별은 지금까지 주로 외형적인 특징 및 이화학적인 분석에 의존해서 이루어져왔다.

하지만 이러한 식별은 그 기준이 불명확하고 개체 간에도 차이가 있는데, 특히 이화학적 분석의 대상이 되는 2차 대사산물은 식물체의 연령이나 생육환경 등에 따라 변이를 나타내기 때문에 품종을 정확히 구별하는 척도로서는 이용되기 어려운 경우가 많다.

식물체의 이러한 외형적, 이화학적 특성과는 달리 유전적인 성질은 환경에 따른 변화가 적고 변이가 거의 없는 고유한 정보이기 때문에 그 기본구조인 DNA를 이용한 분석은 식물체의 분류 또는 종간 구별에 있어 매우 유용한 도구로서 활용되고 있다.

따라서 외형적으로 쉽게 차이를 확인할 수 없거나 가공 과정을 통해 외형이 훼손되거나 성분에 변화가 생겨 판별이 어려울 경우 이러한 DNA 마커를 효율적으로 이용할 수 있다.

고려인삼은 약리효과에 있어서 인삼 다당체나 사포닌의 종류가 많아 외국삼과에 비해 경제적 가치가 더욱 크게 평가받고 있다.

특히, 고려인삼 천풍은 선발육종을 통한 육성 품종으로 수삼 뿐 아니라 인삼의 가공시장에서도 우수한 품질로 평가받고 있다.

고려인삼 우수 품종의 재배 및 육종 활성화를 위해 또한 WTO나 FTA 등의 자유무역추세와 맞물려 외국삼의 국내 유통에 대비하여서도 고려인삼의 우수 품종과 외국삼과의 식별이 요구된다.

현재 개발된 천풍 특이적 DNA 마커의 경우 신속하고 정확하게 천풍과 기타 품종의 식별에 효과적으로 응용될 수 있을 것으로 예상된다.

또한 본 발명의 하나인 화기삼 식별 마커는 수삼 및 인삼가공제품에서 뿐 아니라 종자 단게에서 정확하게 식별하여 종자의 순도 검정에도 효과적으로 응용될 수 있으리라 판단된다.

본 발명은 고려인삼 품종과 천풍 간의 유전적인 차이를 확인할 수 있는 DNA 마커의 개발에 관한 것이다.

본 발명에서는 DNA 마커를 개발하기 위하여 천풍 인삼 시료를 수집하고 엽록체 DNA를 추출하여 이미 완전히 해독된 인삼 엽록체 게놈 염기서열에 기반하여 제작한 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 이후 분자생물학적인 방법을 통해 고려인삼 품종들과 천풍 엽록체 간의 DNA 다형성(polymorphism)을 분석하여 실제 눈으로 확인할 수 있는 품종간의 차이점을 발견하였다.

식물의 엽록체 게놈은 한 개의 세포에 동일한 엽록체 게놈이 수백 개 이상 존재하기 때문에 핵 게놈에 비해 상대적으로 분석이 용이하고, 양친 유전자간의 교잡 없이 모계 유전을 통해서만 후대로 전이되어 종내 변이가 거의 없기 때문에 특정 종 혹은 동일 종내 특정 계통을 구분하는 마커로서 가장 신뢰할 수 있으면서도 신속하게 분석할 수 있는 마커이다.

인삼 엽록체 게놈은 2004년 김 등에 의해 이미 그 염기서열이 완전히 해독되었는데 본 연구에서는 알려진 엽록체 게놈의 정보의 이용과 함께 새로이 천풍과 연풍의 염기서열을 완전 해독하고 이를 이용하여 고려인삼 품종 중에 천풍만을 구분할 수 있는 종 특이 변이를 탐색하여 마커를 개발하고자 하였다.

이러한 유전적 변이는 생명현상에 여러가지 직간접적인 영향을 끼치는 것으로 확인되고 있기 때문에 염기서열의 다형성에 대한 연구는 앞으로의 유전자의 기능을 밝히는 연구에 큰 도움이 될 것이다.

본 발명 역시 이러한 이론적인 배경을 토대로 실시되었으며, 본질적으로 품종간의 정확한 판별 방법 개발이 요구되는 고려인삼과 화기삼의 식별에 대해서 실제로 적용해 보고자 수행되었다.

실험을 위한 재료로 고려인삼 9품종과 대표적 재래종인 자경종, 황숙종으로 총 11종의 고려인삼 품종과 미국삼, 중국삼 종을 사용하였다.

11개 고려인삼 품종은 KT&G (Korea Tobacco and Ginseng)의 실험 포장에서 수집하였다.

엽록체 DNA의 추출은 CTAB 방법을 통해서 실시하였다.

추출된 엽록체 DNA는 본 실험실에서 새로이 완전히 해독된 인삼 엽록체 염기서열에 기반하여 제작된 프라이머를 이용, PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭시켰고, 아가로스 젤을 통해 증폭된 DNA 길이를 확인하였고, 증폭된 산물을 다시 제한효소 처리하여 특정 제한 효소 인식 부위 절단 후의 아가로스 젤 상의 DNA 길이를 확인하였다.

또한 DNA에 형광염색시약(Syto9)을 붙인 후 Light Cycler을 이용하여 HRM(high resolution melting) 곡선을 그어 염기서열에 따른 흡광도를 분석하여 고려인삼 품종들과 천풍의 염기서열 차이를 확인하였고, 최종적으로 ABI3730XL 자동염기서열 분석기(sequencer)를 이용하여 다형성을 나타내는 마커의 게놈상 실제 염기서열을 확인하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트에서, 고려인삼 품종은 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 마커와 서열번호 4 내지 9로 표시되는 3개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 고려인삼 (Panax ginseng) 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 서열번호 4 내지 9로 표시된 3개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어져 있으며, 홀수로 표시된 서열번호가 정방향 프라이머이며, 짝수로 표시된 서열번호가 역방향 프라이머이다.

본 발명은 국내에서 육성된 고려인삼의 품종 중 천풍의 식별에 사용할 수 있는 dCAPS 마커 및 SSR 마커 이를 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 관한 것이다.

dCAPS 마커는 염기서열 하나의 변이에 기반하여 제작되었으며 SSR 마커는 단순반복서열 (simple sequence repeat)의 주변서열로부터 제작하였으며, PCR을 통해 증폭하여 전기영동을 통해 산물을 확인함으로써 품종간 혹은 개체간 혹은 종간 식별하는 방법으로 이를 이용한 목적에 활용하는 방법에 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다.

프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다.

프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 뿐만 아니라 온도 및 이언 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드 또 한 뉴클레오티드 유사체(analogue)는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 (Panax ginseng) 천풍 품종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼 를 포함할 수 있다. dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 총 13 인삼 품종 및 종(천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선운, 선원, 선향, 선풍, 청선, 자경, 황숙, 화기삼, 전칠삼)의 인삼의 잎이 사용되었고, 시료는 한국 인삼공사의 음성 포장및 서울대학교 과수원 인삼 농장에서 채취하였으며, 채취한 잎 샘플은 영하 80℃의 액체 질소에 얼려 막자로 갈아 CTAB 방법으로 DNA를 추출하였다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 고려인삼 (Panax ginseng) 천풍 품종 및 화기삼을 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다.

상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc.Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.

이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다.

이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.

상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다.

겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.

또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.

그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

도 1a 내지 도 1d는 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위한 dCAPS 프라이머 디자인과 분석데이터이며, [실시예 1]은 고려인삼 천풍 품종과 다른 고려인삼 품종 간 구별을 위한 실시예이다.

1. 인삼시료의 준비 및 DNA 추출

총 11품종 (천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 금풍(Gumpoong), 고풍(Gopoong), 선풍(Sunpoong), 선운(Sunwon), 선원(Sunweon), 청선(Chungsun), 선향(Sunhyang)), 황숙, 자경의 인삼 잎이 사용되었고, 11품종의 시료는 한국인삼공사의 음성 포장에서 품종별로 채취 하였다.

채취한 잎 샘플은 영하 80℃로 얼려 막자로 갈아 CTAB방법으로 DNA를 추출하였다.

2. 프라이머 디자인( dCAPS 프라이머 디자인)

고려인삼 품종 다형성을 확인하기 위해 천풍과 연풍 엽록체 전체 서열을 비교분석하여 염기서열 하나의 변이를 찾아내 천풍 T, 연풍 G 이를 이용 dCAPS 프라이머를 제작하였다(도 1a).

dCAPS 프라이머는 증폭되는 염기서열에 제한효소 마다 특정 서열을 인식하는 특정 서열을 삽입하여 서열에 변형을 가져와 증폭 산물을 제한효소 처리시 인식 부위에서는 절단되고 다른 서열에서는 절단되지 않는 것으로 PCR 증폭 산물 크기 차이를 발생시킨다.

본 개발된 dCAPS 프라이머는 제한효소 XbaI(TCTAGA)에 의해 연풍 DNA 증폭 산물은 절단되고 천풍 DNA 증폭 산물은 제한효소에 의해 인식되지 않아 절단되지 않음에 착안하여 프라이머를 제작하였다(도 1a).

본 프라이머쌍은 dCAPS (.http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html) 프로그램을 이용하여 예상 PCR 산물의 크기는 150-300bp로 제작하였다.

3. PCR 증폭 및 전기영동 분석

dCAPS 프라이머 PCR은 20ng의 DNA를 주형으로 하여, 10pmole의 프라이머쌍, 0.5mM의 dNTP, 1X 중합효소 버퍼, 1유닛의 Taq (비바젠사)의 농도로 총 25ul을 만들어 수행되었다.

증폭 조건은 94℃로 5분 처리 후, 94℃ 20초, 52-54℃ 20초, 72℃ 20초의 조건으로 35번 반복하고, 마지막으로 72℃로 7분을 처리하였다.

증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스 젤에 전기영동하여 증폭을 확인하고, PCR 증폭 산물 1ul를 취하여 이에 제한효소 XbaI 0.5ul, 제한효소 버퍼4 (20mM Tris-acetate, pH7.9, 10mM magnesium acetate, 50mM potassium acetate, 1mM DTT) 1ul,,Bovine serum albumin (BSA) 1ul,, 멸균수 6.5ul,를 넣어 총 10ul을 만들어 37℃에서 4시간 incubation하여 3% 아가로스 젤에 전기영동하여 천풍과 타품종간의 다형성을 확인하였다.

4. 데이터 분석 및 마커 개발

본 발명자는 마커의 개발을 위해 고려인삼 천풍과 연풍의 엽록체 염기서열을 새로이 완전 분석하여 이의 비교분석을 통해 천풍과 연풍 염기서열의 변이를 찾아냈으며 이를 이용 프라이머를 제작하여 고려인삼 11종 시료에 적용하였다.

시료에 dCAPS 마커 적용 결과, PCR 증폭 산물(도 1b)에 제한효소 XbaI 처리시 천풍만이 XbaI 제한효소에 의해 절단되지 않아 절편의 크기가 212bp로 나타났으며 천풍을 제외한 연풍, 금풍, 고풍, 선운, 선원, 선향, 선풍 모두에서 XbaI 제한효소에 의해 인식 부위가 절단되어 약 24bp가 짧은 188bp로 나타났다(도 1c).

이는 천풍 엽록체 rpoC1 서열이 고려인삼 타품종의 서열과 다른 것으로 이에 기반하여 제작된 dCAPS 프라이머는 고려인삼 종 내에서 천풍을 정확하게 식별해 내어 천풍 특이적 마커가 될 수 있음을 나타낸다.

[ 실시예 2]

도 2a 내지 도 2c는 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위한 SSR 프라이머1 디자인과 분석데이터이며, [실시예 2]는 고려인삼 천풍 품종과 다른 인삼 간 구별을 위한 실시예이다.

1. 인삼시료의 준비 및 DNA 추출

상술한 [실시예 1]과 동일하다.

2. 프라이머 디자인( SSR 프라이머1 디자인)

고려인삼 품종 다형성을 확인하기 위해 천풍과 연풍 엽록체 전체 서열을 모두 비교 분석하여 rpl32-trnUAG에서 7bp 반복서열의 차이를 발견하였으며 이를 이용하여 SSR 프라이머쌍을 제작하였다(도 2a).

프라이머쌍은 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 프로그램을 이용하여 SSR 모티프를 포함하도록 제작하였고, 예상 PCR 산물의 크기는 100 ~ 200bp로 하였다.

3. PCR 증폭 및 전기영동 분석

SSR 프라이머1의 PCR은 20ng의 DNA를 주형으로 하여, 10pmole의 프라이머쌍, 0.5mM의 dNTP, 1X 중합효소 버퍼, 1유닛의 Taq (비바젠사)의 농도로 총 25ul을 만들어 수행되었다.

증폭 조건은 94℃로 5분 처리 후, 94℃ 20초, 54-56℃ 20초, 72℃ 20초의 조건으로 35번 반복하고, 마지막으로 72℃로 7분을 처리하였다.

증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 젤에 전기영동하여 확인하고, capillary 전기영동을 통하여 샘플 간의 다형성을 확인하였다.

젤은 EtBr (ethidium-bromide)로 염색하여, UV등을 이용하여 눈으로 확인하였다.

4. 데이터 분석 및 마커 개발

시료에 SSR 프라이머 pgcp139*r2의 적용 결과 천풍 157bp, 타품종 150bp로 확인되어 고려인삼 엽록체 유전체 rpl32-trnUAG 지역에서 천풍과 타품종 간의 서열의 다형성이 확인된 것으로 이는 고려인삼 종 내에서 천풍을 식별해 내는 천풍 특이적 마커가 될 수 있다(도 2b).

[ 실시예 3]

도 3a 내지 도 3c는 본 발명에 따른 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위한 SSR 프라이머2 디자인과 분석데이터이며, [실시예 3]은 고려인삼과 화기삼 간 구별을 위한 실시예이다.

1. 인삼시료의 준비 및 DNA 추출

상술한 [실시예 1]과 동일하다.

2. 프라이머 디자인( SSR 프라이머2 디자인)

고려인삼 품종 다형성을 확인하기 위해 천풍과 연풍 엽록체 전체 서열을 비교분석하여 ycf1 gene 지역에서 57bp의 반복서열의 차이를 발견하여 이를 이용 프라이머쌍을 제작하였다(도 3a).

프라이머쌍은 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 프로그램을 이용하여 SSR 모티프를 포함하도록 제작하였고, 예상 PCR 산물의 크기는 600 ~ 800bp로 하였다.

3. PCR 증폭 및 전기영동 분석

SSR 프라이머2 PCR은 20ng의 DNA를 주형으로 하여, 10pmole의 프라이머쌍, 0.5mM의 dNTP, 1X 중합효소 버퍼, 1유닛의 Taq (비바젠사)의 농도로 총 25ul을 만들어 수행되었다.

증폭 조건은 94℃로 5분 처리 후, 94℃ 40초, 52-54℃ 40초, 72℃ 60초의 조건으로 35번 반복하고, 마지막으로 72℃로 7분을 처리하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 젤에 전기영동하여 확인하고 샘플 간의 다형성을 확인하였다.

4. 데이터 분석 및 마커 개발

시료에 SSR 프라이머 cpycf101 적용 결과 천풍과 재래종 황숙이 하나의 군, 연풍, 고풍, 금풍, 선운, 선원, 선향, 선풍, 청선, 자경이 하나의 군으로 약 57bp의 증폭 산물 크기 차이를 확인할 수 있었다.

천풍과 황숙은 PCR 증폭된 절편의 크기가 672bp로 나타났고 나머지 9품종은 모두 729bp로 확인되었다. 이에는 상기 서열번호 4 및 5, 6 및 7의 마커간 조합적용으로 천풍과 황숙에서 황숙의 식별이 가능해 진다.

상기 서열번호 1 및 2의 dCAPS프라이머 적용에 의해 천풍은 212bp, 황숙은 188bp로 DNA 절편의 크기 차이로 최종 천풍을 식별할 수 있다(도 3b).

[ 실시예 4]

1. 인삼시료의 준비 및 DNA 추출

본 발명된 프라이머쌍의 확인을 위해 9품종 (천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 금풍(Gumpoong), 고풍(Gopoong), 선풍(Sunpoong), 선운(Sunwon), 선원(Sunweon), 청선(Chungsun), 선향(Sunhyang))과 재래종인 자경(Jakyung), 황숙(Hwangsook) 및 미국삼(Panax quinquefolius), 중국삼(Panax notoginseng)의 인삼 잎이 사용되었고, 시료는 한국인삼공사의 음성 포장에서 천풍, 연풍, 금풍, 고풍 각 9 개체, 자경, 황숙, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선 각 3 개체, 미국삼 4개체, 중국삼 1개체씩 총 62개체를 채취하여 blind test를 실시 하였다.

채취한 잎 샘플은 영하 80℃로 얼려 막자로 갈아 실시예1의 방법과 같은 CTAB방법으로 DNA를 추출하였다.

2. PCR 증폭 및 전기영동 분석

SSR 프라이머1, dCAPS 프라이머, SSR 프라이머2 PCR 증폭 및 전기영동 분석 방법과 실시는 상술한 [실시예 1], [실시예 2] 및 [실시예 3]과 같다.

3. 데이터 분석 및 마커 개발

본 발명자는 [실시예 1]에서 확인된 상기 프라이머쌍(서열번호 4 및 5)을 개체 내 변이에 적용 천풍 특이적 마커임을 확인하고자 고려인삼 62개체 (천풍 9, 연풍9, 금풍9, 고풍9, 자경3, 황숙3, 선운3, 선원3, 선향3, 선풍3, 청선3)와 근연종인 미국삼4개체, 근연종인 중국삼1개체를 확보하여 본 개발된 dCAPS 프라이머를 확대 적용하였다.

도 1(도 1a 내지 도 1d) 내지 도 3(도 3a 내지 도 3c)에 CP천풍, YP연풍, GO고풍, GU금풍, SU선운, SO선원, SH선향, SP선풍, JK자경, HS황숙, PQ화기삼, PN중국삼을 나타내고 있다.

시료에 dCAPS 마커 적용 결과, 천풍만이 XbaI 제한효소에 의해 절단되지 않아 절편의 크기가 212bp로 나타났으며 천풍을 제외한 연풍, 금풍, 고풍, 선운, 선원, 선향, 선풍, 청선, 자경, 황숙 모두에서 XbaI 제한효소에 의해 인식 부위가 절단되어 24p가 짧은 188bp로 나타났으며 미국삼과 중국삼에서는 천풍과 같이 제한효소에 의한 절단이 생기지 않아 천풍과 같이 약 212bp의 크기를 나타냈다(도 1d).

이는 천풍 엽록체 rpoC1 서열이 고려인삼 타품종의 서열과 다른 것으로 확인되었으며 이는 고려인삼 품종 내에서 천풍만을 식별해 내는 천풍 특이적 마커가 될 수 있음을 증명한다, 또한 미국삼 중국삼 등의 외래종 간에서 천풍의 식별을 위해서는 본 발명의 구성 중에 하나인 상기 서열 번호 6 및 7, 상기 서열번호 8 및 9의 마커간 조합으로 고려인삼 천풍의 식별이 가능하다.

본 발명자는 실시예 2에서 확인된 상기 프라이머쌍(서열번호 3 내지 4)을 종 내 및 종 간 변이에 적용 천풍 특이적 마커임을 확인하고자 인삼 62개체 (천풍 9, 연풍9, 금풍9, 고풍9, 자경3, 황숙3, 선운3, 선원3, 선향3, 선풍3, 청선3, 미국삼4, 중국삼1)를 확보하여 본 개발된 SSR 프라이머 pgcp139*r2적용하였다.

도면 2c의 시료 표시는 CP천풍, YP연풍, GO고풍, GU금풍, SU선운, SO선원, SH선향, SP선풍, JK자경, HS황숙, PQ미국삼, PN중국삼을 나타낸다. 결과적으로 천풍 157bp, 천풍을 제외한 타품종 및 재래종, 미국삼, 중국삼 모두 150bp로 나타났다(도 2c).

이는 파낙스속(인삼속) 엽록체 유전체 rpl32-trnUAG 지역 인삼 서열에서 천풍이 유일하게 7bp 단위의 반복서열이 3 copy가 존재함을 나타내고 타품종 및 재래종, 미국삼, 중국삼에서는 7bp 단위의 반복서열이 2 copy로 확인된 것으로 서열번호 3 및 4 프라이머 세트는 본 프라이머쌍 단독으로 천풍 특이적 마커가 될 수 있음을 나타낸다.

본 발명자는 [실시예 3]에서 확인된 상기 프라이머쌍(서열번호 8 및 9)을 종 내 및 종 간 변이에 적용 천풍 특이적 마커임을 확인하고자 인삼 78개체 (천풍 9, 연풍9, 금풍9, 고풍9, 자경9, 황숙9, 미마끼3, 선운3, 선원3, 선향3, 선풍3, 청선3, 미국삼4, 중국삼1)를 확보하여 본 개발된 프라이머 cpycf101을 적용하였다.

적용 결과 천풍과 재래종 황숙의 PCR 증폭 산물의 크기가 672bp로 같은 것을 확인하였고 타품종(연풍, 금풍, 고풍, 선운, 선원, 선향, 선풍, 청선) 및 재래종인 자경 간에서 약 57bp 차이가 나는 729bp 크기의 증폭 산물의 차이를 확인할 수 있었다(도 3c).

이는 실제 엽록체 ycf1 유전자 염기서열 상에서 57bp 단위의 반복서열이 천풍과 황숙에서 3 copy, 타품종 및 재래종인 자경에 4 copy를 나타내는 것이다.

고려인삼 천풍과 황숙은 상기 서열 번호 4 및 5, 상기 서열번호 6 및 7의 마커간 조합으로 고려인삼 천풍과 황숙을 각 각 식별할 수 있다.

상기 서열번호 8 및 9의 프라이머 세트는 엽록체 유전체 ycf1 지역에서 고려인삼과 미국삼의 다형성이 나타나 미국삼은 57bp 단위의 반복 서열이 2 copy가 존재해 약 615 bp, 고려인삼(천풍과 황숙 672bp, 9품종은 729bp), 전칠삼(729bp)과는 PCR 증폭 절편의 크기가 다르게 확인되었다.

이의 실제 염기서열의 확인을 위해 ABI3730xl로 resequencing 하였으며 확인 결과 도 3c와 같은 결과를 확인하였다.

본 프라이머세트 (서열번호 8 및 9)는 인삼 종간에 미국삼을 식별할 수 있는 co-dominant 마커가 될 수 있음을 확인한 것이다.

고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별을 위해 제작된 프라이머와 이를 이용해서 밝혀낸 마커는 [표 1]과 [표 2]에 나타내었다.

하기 [표 1]은 인삼 엽록체 게놈상의 DNA 마커를 나타낸다. 빨간색 부분은 마커 증폭을 위한 프라이머 서열이며, 초록색 부분은 각 서열 지역에서 품종간 변이를 나타내는 것으로 서열번호 8와 9은 inverted repeat 지역으로 한 곳은 중복을 피하기 위해 제외하였다. 최종 PCR 수행 후 전기영동으로 확인하면 변이 서열의 크기만큼 증폭 산물에서 차이가 나타나는 것을 알 수 있다.

[표 2]는 마커 증폭을 위한 프라이머로서, pgcpd01 마커는 서열번호 4와 5의 프라이머 서열로 증폭되는 마커로 증폭 산물의 크기는 천풍212bp로 나타난다. pgcp139f*r2 마커는 서열번호 6과 7의 프라이머 서열로 증폭되는 마커로 증폭 산물의 크기는 천풍천풍 157bp로 나타난다. cpycf101 마커는 서열번호 8과 9의 프라이머 서열로 증폭되는 마커로 증폭 산물의 크기는 화기삼 729bp로 나타난다.

도 4는 본 발명의 기반이 되는 고려인삼 천풍 품종과 타품종간 엽록체 서열 다형성 지역을 나타내는 엽록체 전체 게놈 지도를 나타낸 것이며, 고려인삼 천풍 엽록체 유전체 지도로 게놈상의 표시된 지역은 본 개발된 프라이머 서열 지역으로 각 각 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 서열번호 8과 9를 나타낸 것이다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였지만, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> Complete sequencing of Chloroplast genomes of Panax ginseng-derived Maker, DNA primer sets and Kits for discrimination of Panax ginseng cultivars and Panax species and uses thereof <130> P2013-122 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 212 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> 5'clip <222> (4) <223> Forward primer <400> 1 aaatatgacc aacagtagtt cgaatatata tatatagaat ttcttttttt atacttctta 60 ctattagata ttgcccataa atttcataat aggtacccaa agattcatag tgaacttcga 120 ggggggcttc ttttgcagaa ataacgcgtt gatctagtcg ccaccgaagc cacaaaggac 180 tatctaaatt gattcgtttc tgccgataag ct 212 <210> 2 <211> 157 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 2 tgtgcgacaa acaaataagt cataaaataa aacattgtaa taatatgaat cgaaaaattg 60 gcttatttcg ccgttaatat gaaattaaaa atttccatta cctattacct attacctatt 120 gtttgaggtt aatcaatatg aaatggaact cgcttcg 157 <210> 3 <211> 594 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 3 ggtattagtc tggatacggc aaaatcattc tattagatcg aataagtaca ttcgatctaa 60 taagtacctt gtgtcagaat tgataaattc tatggctcga atctttagta ttctcttatt 120 tattacctgt gtctactatt taggcagaat accgtcaccc attattacta agaaactgaa 180 agaaacccca acaacggaag aaagggggga aagtgaggaa gaaacagatg tagaaataga 240 aaccccaaca acggaagaaa ggggggaaag tgaggaagaa acagatgtag aaatagaaac 300 cccaacaacg gaagaaaggg gggaaagtga ggaagaaaca gatgtagaaa tagaaacagc 360 ttccgaaacg aagggggcta aacaggaaca agagggatcc accgaagaag atccttctcc 420 ttcccttttt tcggaagaaa aggaggatcc ggacaaaatc gatgaaacgg aagagatccg 480 agtgaatgga aaggaaaaaa caaaggatga attccacttt acagagacat cctataacaa 540 tagcccagtt tataaagttt cttatttgta taagaatcaa gaaaatttta acaa 594 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 4 aaatatgacc aacagtagtt cgaatcta 28 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 agcttatcgg cagaaacgaa 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 tgtgcgacaa acaaataagt ca 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 7 cgaagcgagt tccatttcat 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 8 ggtattagtc tggatacggc aaa 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 9 cgaagcgagt tccatttcat 20

Claims

고려인삼 천풍 품종과 다른 고려인삼 품종 간에 single nucleotide polymophism(SNP)을 보이는 엽록체 게놈(genome) gene region 염기서열을 대상으로 개발된 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 마커.
고려인삼 천풍 품종과 다른 인삼 간에 Indel polymophism을 보이는 엽록체 게놈 rpl32 gene 과 tRNA-UAG gene intergenic region 염기서열을 대상으로 개발된 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 마커.
고려인삼과 화기삼 간에 Indel polymorphism을 보이는 엽록체 게놈 ycf1 gene region 염기 서열을 대상으로 개발된 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 마커.
서열번호 4와 5로 표시된 1개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼 품종간 천풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
서열번호 6과 7로 표시된 1개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼을 포함하는 다른 인삼간 천풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
서열번호 8과 9로 표시된 1개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼을 포함하는 다른 인삼간 화기삼을 구별하기 위한 프라이머 세트.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 종을 구별하기 위한 키트.