CN108754015A - 用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记pcmi-f001 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI‑F001，涉及经济林木分子鉴定技术领域。本分子标记PCMI‑F001的上游引物PCMI‑F001‑F核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，下游引物PCMI‑F001‑R核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；所述标记在雌性个体中扩增所得特异性条带核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。本发明的特异性分子标记引物(PCMI‑F001‑F/R)可对青杨雌雄性别进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、高灵敏度，是其他现有鉴别方法不能达到的。

Description

用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI-F001

技术领域

本发明属于经济林木分子鉴定技术领域，具体涉及到一种用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI-F001。

背景技术

青杨(Populus cathayana)是杨柳科杨属雌雄异株植物，作为我国常见的经济和生态修复树种，主要分布在中国的华北、西北、辽宁、四川等地区，具有耐干旱、生长快、适用性强和易繁殖等优点，并且其木质轻柔，木材纹理呈直线型，结构细腻，适用于家具、木箱和建筑等经济用材，以及防风固沙、绿化环境等，在经济发展和生态环境方面都有重要意义。目前，科研人员发现雌性青杨与雌性青杨相邻生长，植株根系生长较大但是分支少；雌雄相邻生长根系生长较小但分支多。也就是说青杨雌雄相邻生长对雄性没有影响，但是有利于雌雄植株的生长，增强雌株长势。因此在如果能在造林时就开展雌雄幼苗合理规划，将提高造林效率，而这将建立在青杨幼苗的雌性性别早起鉴定的基础上。传统的鉴定方法主要是通过形态观察、生理生化检测以及氨基酸含量差异检测等，主要针对成年的植株的检测，并且人为因素对检测结果影响较大，导致检测结果不准确。本发明从分子层面上对青杨幼苗雌雄株进行研究，开发出可用于青杨幼苗雌雄株的快速检测引物。从而提高育种效率，缩短育种周期，调节育种性别模式，具有很大的应用潜力和较好的经济价值。

发明内容

本发明的一个目的是为了改善上述问题，提供一种用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI-F001。

本发明开发了一种鉴别青杨苗期性别的特异性分子标记引物，其特征在于该引物核苷酸序列如下：

上游引物PCMI-F001-F：5’-TCCAGCCTAGGTAAGCCTCTT-3’，如SEQ ID No：1所示；

下游引物PCMI-F001-R：5’-AGCCCCTTAACCTTTGGATTT-3’，如SEQ ID No：2所示。

此对特异性分子标记引物是采用普通PCR技术，利用目标起始密码子多态性(Start condon targeted polymorphism，SCoT)标记通用引物对青杨雌株和雄株样品DNA进行扩增，对扩增产物进行电泳，筛选雌雄单株特异性条带进行测序，然后对测序获得的青杨雌雄差异条带序列进行比对，并以此设计特异性引物(PCMI-F001-F/R)。该引物对具有极高的专一性，用此对引物对青杨雌雄单株进行PCR扩增，只有雌株能获得801bp的DNA条带，而雄株没有；其雌株扩增得到的特异片段核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

本发明的另一个目的是提供利用上述特异性分子标记引物对不同青杨幼苗进行雌雄快速鉴定的方法。

本发明采用上述特异性分子标记引物(PCMI-F001-F/R)作为特异性扩增引物，以待测青杨样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现一条801bp的DNA条带，则待测样本为雌性个体；若电泳结果未出现一条801bp的DNA条带，则待测样本为雄性个体。

需要说明的是，本发明特异性性分子标记引物和检测方法仅适用于青杨雌雄个体的鉴别，即待测样本是限定为青杨样本的范围内，本领域普通技术人员采用本发明方法可对青杨个体进行雌性性别的快速鉴定，方法简便、准确、快速，是其他现有鉴别方法不能实现的。

具体的所述方法如下：

(1)取待测青杨样本新鲜叶片0.2-0.5g，加入液氮研磨，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测青杨的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以所述特异性分子标记引物(PCMI-F001-F/R)为扩增引物，进行普通PCR扩增：

PCR反应体系(总体积为10μl)组成如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；32个循环(94℃变性30秒，退火温度59℃复性40秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。

(3)用1％琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得的PCR扩增产物，利用凝胶成像系统进行成像拍照，若电泳结果出现一条801bp的DNA条带，则待测样本为雌性个体；若电泳结果未出现一条801bp的DNA条带，则待测样本为雄性个体。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的特异性分子标记引物(PCMI-F001-F/R)可对青杨雌雄性别进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、高灵敏度，是其他现有鉴别方法不能达到的。本特异性分子标记PCMI-F001可用于青杨苗期雌雄性别的早期鉴定检测，有助于造林时开展雌雄幼苗合理规划，促进雌雄青杨根系生长，进而避免因性别单一而造成的青杨生长不均、抗病虫和抗逆能力差等问题；此外本特异性分子标记可用于雌雄性别标记辅助选择，提高育种效率，缩短育种周期，调节育种性别模式，具有很大的应用潜力和较好的经济价值。

附图说明

图1为采用本发明的特异性分子标记对青杨雌雄个体进行PCR扩增后的电泳图；其中通道L为DNA标准分子量Marker DL2000；通道M1～M12：雄性青杨个体(M1～M4来源于青海西宁，M5～M8来源于山东冠县，M9～M12来源于四川成都)；通道F1～F12：雌青杨个体(F1～F4来源于青海西宁，F5～F8来源于山东冠县，F9～F12来源于四川成都)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的具体实施方式作进一步详述。

实施例1.

1.待测青杨样本基因组DNA提取

取待测青杨样本的新鲜叶片0.2-0.5g，加入液氮在研钵中研磨至粉末，然后使用上海生物工程技术有限公司的Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取待测青杨样本基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶对所得DNA进行电泳以检测纯度，并利用美国赛默飞世尔公司的NanoDropTM 1000型超微量紫外分光光度计检测DNA浓度，然后稀释至20-50ng/μL，4度冰箱放置备用。

2.合成特异性分子标记引物

设计基于青杨雌雄性别差异序列的特异性分子标记引物，上游引物PCMI-F001-F：5’-TCCAGCCTAGGTAAGCCTCTT-3’和下游引物PCMI-F001-R：5’-AGCCCCTTAACCTTTGGATTT-3’，由上海生物工程技术有限公司合成。

3.特异性分子标记引物(PCMI-F001-F/R)的PCR扩增

PCR扩增体系(总体积10μL)：10×PCR Buffer(含Mg²⁺)1μL，10mmol/L dNTPs 0.3μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，DNA模板(50ng/μL)1μL，ddH₂O 6.5μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；32个循环(94℃变性30秒，退火温度59℃复性40秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。

4.电泳检测

取步骤(3)PCR扩增产物5～10μL，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果如图1所示。

按照上述方法，利用特异性分子标记PCMI-F001对青杨雌雄个体进行检测，电泳图见图1，其中编号为M1～M12的为雄性青杨个体，没有扩增出一条801bp的DNA条带；编号为F1～F12的雌性青杨个体，均扩增出一条801bp的DNA条带。这表明本发明的特异性分子标记PCMI-F001具有极高的专一性，因此可以用于青杨幼苗雌雄性别的早期快速鉴定。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI-F001

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

tccagcctag gtaagcctct t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

agccccttaa cctttggatt t 21

<210> 3

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

tccagcctag gtaagcctct tcctactctt tatcttttta gaatgcatgt taaagcatgc 60

cggtaatgtg aagaaacaat tcacattact ggcatttgcc aaccattact gggttgggat 120

aatggtggct aaataatggg ctgagccttt gtttcagcca agctcgcgtg gctgggttgg 180

atctagctca cacataaaaa aagcatgtta ggccatttgt ggcctaacaa atcggatgag 240

gctgggctta agccaacttg tatgtgtaaa ttgagcctga ggcccaaccc atgtgactag 300

gtcaagccca aacccaacct taagggtgtt tttggcatgc cacttttttt ttcttatgac 360

ataaggcctt gtttggcctt aatttgccct taattaatta tgaaagctta atttgccctt 420

aattgagcag attggaattt taaaggatca aatttaattt tccaaaccca attaagtgaa 480

atcagggatg aaattgcaat aaaatcgaaa tttggggggg gggggtcaat tatgggtcaa 540

actgatgaaa ttcaagacct gcaaagggca cgtgaattct aggacccaat tcgattgaaa 600

acaagggtaa aatcgaagag attaaaagtt tgaaggtcaa ttaagaatga aattgaaaat 660

attcaagata aaggaccaag ttgaaagagg tgctaaactt agagggttac tttaaaactt 720

gacaagggtg aaattgaatt gattcttgga atcaaaactc aattaaggac ctgattgaat 780

aaatccaaag gttaaggggc t 801

Claims (5)

1.用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI-F001，其特征在于该引物核苷酸序列如下：

上游引物PCMI-F001-F：5’-TCCAGCCTAGGTAAGCCTCTT-3’，如SEQ ID No：1所示；

下游引物PCMI-F001-R：5’-AGCCCCTTAACCTTTGGATTT-3’，如SEQ ID No：2所示。

2.权利要求1所述的用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记PCMI-F001在青杨幼苗雌雄分子鉴定中的应用。

3.一种利用如权利要求1所述的特异性分子标记进行青杨幼苗雌雄分子鉴定的方法，其特征在于该方法首先提取待测青杨雌雄单株样本的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的特异性分子标记PCMI-F001进行PCR扩增得到扩增产物；对得到的扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现一条801bp的DNA条带，则待测样本为雌性青杨幼苗个体；若电泳结果未出现一条801bp的DNA条带，则待测样本为雄性青杨幼苗个体。

4.如权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于PCR扩增体系(总体积10μL)：10×PCRBuffer(含Mg²⁺)1μL，10mmol/L dNTPs 0.3μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，DNA模板(50ng/μL)1μL，ddH₂O 6.5μL。

5.如权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；32个循环(94℃变性30秒，退火温度59℃复性40秒，72℃延伸90秒)；最后72℃延伸10分钟。