CN103361425B - 用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法 - Google Patents
用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。该方法包括（1）黄瓜基因组DNA的提取；（2）利用筛选得到的特异性引物进行PCR扩增；（3）对PCR扩增产物进行凝胶电泳；（4）根据凝胶条带上的相对位置判断种子纯度。本发明的方法可将‘粤秀3号’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。
背景技术
种子质量是农业生产中的重要元素，其质量的优劣程度直接影响农产品的质量和产量。传统的品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法从农业生产角度具有稳定可靠的优点，但从遗传学角度看，品种的纯度和真伪鉴定是实质上是对品质基因型的鉴定，只有通过鉴定DNA分子本身才能准确可靠的鉴定品种的基因型。DNA 分子标记技术是随着分子生物学的发展而发展起来的一种新型的鉴定方法。它具有简便、快速、准确的特点。目前常用的分子标记技术包括AFLP，SRAP，SCAR，SSR等，SSR分子标记分布广泛，且具有共显性和高多态性等特征。
黄瓜是世界上重要的蔬菜作物。有限的亲本资源以及杂交品种的不断涌现，使得品种间尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之黄瓜为自花授粉作物，人工去雄不及时，常会出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大损失。
‘粤秀3号’黄瓜是以A-2为母本，C-8为父本育成的华北型黄瓜一代杂种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的品种。为了保证优良品种产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重要。
发明内容
本发明的一个在于提供一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的引物。
本发明的另一个目的在于提供提供一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供提供一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的方法。
本发明所采取的技术方案是：
用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的引物，为下述引物组1或引物组2，其中，引物组1的序列为：
3B-10-F：5’-CATCACGACCCTCTCCATCT-3’（SEQ ID NO:1）；
3B-10-R：5’-GGGTTTGATAGTGGAGATTATTCA-3’（SEQ ID NO:2）；
引物组2的序列为：
2B-41-F：5’-CACCGAGAACGAAAGAAGGA-3’（SEQ ID NO:3）；
2B-41-R：5’- TCTAAGGTGGGAGGGAAACC-3’（SEQ ID NO:4）。
用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的试剂盒，其包括上述的引物组1或/和引物组2。
一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤：
（1）提取待检黄瓜种子或幼苗基因组DNA；
（2）以黄瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1引物组1或引物组2进行PCR扩增；
（3）对扩增的产物进行凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，其中，引物组1产生128bp的母本特异标记，产生158bp的父本特异标记，引物组2产生177bp的母本特异标记，189bp的父本特异标记。
PCR扩增的20μl反应体系为：基因组DNA 5ng，Mg2+0.15mmol·L-1，dNTP 0.2mmol·L-1，SSR引物0.25 mmol·L-1，Taq 酶0.2U，10×PCR buffer:2.0μl，ddH20补足至20μl。
PCR扩增的程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。
所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
本发明的方法可将‘粤秀3号’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
附图说明
图1为引物组1对黄瓜‘粤秀3号’种子纯度鉴定的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P1：母本A-2；P2：父本C-8：F1：粤秀3号种子）；
图2为引物组2对黄瓜‘粤秀3号’种子纯度鉴定的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（P1：母本A-2；P2：父本C-8：F1：粤秀3号种子）；
图3为引物组1对不同黄瓜品种种子的PCR扩增结果（从左到右依次为：P1：母本A-2；P2：父本C-8：粤秀3号；中农108号；园丰6号；津绿5号；中农8号；津研四号）；
图4为引物组2对不同黄品种种子的PCR扩增结果（从左到右依次为：P1：母本A-2；P2：父本C-8：粤秀3号；中农108号；园丰6号；津绿5号；中农8号；津研四号）；
图5为引物组1的田间检测结果；
图6为引物组2的田间检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 杂交黄瓜‘粤秀3号’种子纯度检测方法的建立。
1、筛选纯度鉴定的SSR引物。
从所公布的黄瓜SSR引物在亲本间进行筛选，选出共显性差异标记条带的两组引物，其中，
引物组1的序列如下所示：
3B-10-F：5’-CATCACGACCCTCTCCATCT-3’（SEQ ID NO:1）；
3B-10-R：5’-GGGTTTGATAGTGGAGATTATTCA-3’（SEQ ID NO:2）；
引物组2的序列为：
2B-41-F：5’-CACCGAGAACGAAAGAAGGA-3’（SEQ ID NO:3）；
2B-41-R：5’- TCTAAGGTGGGAGGGAAACC-3’（SEQ ID NO:4）。
两组引物的标记带型清晰、重复性好，引物能产生的母本特异性标记和的父本特异性标记。
2、利用上述特异性引物对杂交黄瓜‘粤秀3号’种子进行纯度鉴定。
（1）黄瓜DNA的提取
实验材料为黄瓜‘粤秀3号’商品种及其母本A-2、父本C-8子叶，分别提取基因组DNA。步骤如下：
①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μl 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min（每隔5min摇动一次）。
②静置至室温后在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清（约800μl）转移到新的2ml 离心管。
③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃ 下12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml 离心管中。
④加2/3体积340μl预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次），置于－20℃下培养30min。
⑤在4℃下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μl预冷的 70%乙醇洗涤DNA沉淀（两次），微干。
⑥加入100μl无菌水溶解。
（2）SSR-PCR 扩增：
PCR体系（20μl）
DNA模板：5ng
引物-F：0.25 mmol·L-1
引物-R：0.25 mmol·L-1
dNTP：0.2mmol·L-1
Mg2+：0.15mmol·L-1
10×PCR buffe：2.0μl
Taq酶：0.2U
ddH20补足至20μl
PCR扩增程序
94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。
（3）凝胶电泳
扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1%AgNO3银染15min；银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2CO3显色，显色后在灯箱上拍照分析。
（4）扩增结果
两种引物在黄瓜‘粤秀3号’父母本及杂交一代种子分别能扩增出两条特异带；其中引物组1在母本P1中扩增出条带a，在父本P2中扩增出条带b (见图1）；引物组2在母本P1中扩增出条带c，在父本P2中扩增出条带d (见图2）。
回收特异条带，送英俊公司测序。a、b、c、d四条带的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:5-8所示，杂交种子的扩增产物与父本、母本扩增产物的序列相符。
实施例2 特异性实验
取市场上同种类型的黄瓜品种种子：中农108、园丰、津绿5号、中农8号、津研四号、粤秀3号、母本A-2、父本C-8，分别提取DNA，用引物组1和引物组2分别进行PCR扩增。结果显示，只有粤秀3号有特异的两条带，其他品种只有一条带或者没有条带。图3为引物组1的扩增产物电泳图，图4为引物组2的扩增产物电泳图。
实施例3 田间应用
采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的42株‘粤秀3号’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测。结果表明两组引物检测结果一致，种子纯度为97.6%，与田间调查结果一致，准确率为100%。图5为引物组1的扩增产物电泳图，图6为引物组2的扩增产物电泳图。
以上实施例表明，本发明的方法可将‘粤秀3号’杂交种子与其父母本种子或其他黄瓜品种种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。并且选取任何一个引物均能准确鉴别。
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所，广东科农蔬菜种业有限公司
<120> 用于黄瓜'粤秀3号'杂交种子纯度鉴定的引物及方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catcacgacc ctctccatct 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggtttgata gtggagatta ttca 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccgagaac gaaagaagga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctaaggtgg gagggaaacc 20
<210> 5
<211> 118
<212> DNA
<213> 黄瓜
<400> 5
taattttaca cctgtaacat aatggtgagg gtgtggtata tccaattgaa aattagaaag 60
ttatttaatg aatggattga gtggaaaaga aaaacaaaaa tctagtggtt ggattatg 118
<210> 6
<211> 148
<212> DNA
<213> 黄瓜
<400> 6
atatttttac acctataata taaggtgagg gtgagggtga gggtgagggt gagggtgagg 60
gtgtggtata tccaattgaa aattagaaag ttatttaatg aatggattga gtggaaaaga 120
aaaacaaaaa tctagtggtt ggattatg 148
<210> 7
<211> 179
<212> DNA
<213> 黄瓜
<400> 7
attcagagtt taaaaactag tagtagttat gtaaagaaaa gcttgaggag agaatctagc 60
aatgctgctg cttctgcttc agcttctgct tctgcttctg cttcagcttc tgcttcagct 120
tctgcttctg cagaaatagt tccaaagtct aagaatgctg ttgaacatgt agatcagag 179
<210> 8
<211> 167
<212> DNA
<213> 黄瓜
<400> 8
attcagagtt taaaaactag tagtagttat gtaaagaaaa gcttgaggag agaatctagc 60
aatgctgctg cttctgcttc agcttctgct tctgcttctg cttcagcttc tgcttctgca 120
gaaatagttc caaagtctaa gaatgctgtt gaacatgtag atcagag 167
Claims (4)
1.一种用于黄瓜‘粤秀3号’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤：
（1）提取待检黄瓜种子或幼苗基因组DNA；
（2）以黄瓜基因组DNA为模板，使用引物组1或引物组2进行PCR扩增,
引物组1的序列为：
3B-10-F：5’-CATCACGACCCTCTCCATCT-3’（SEQ ID NO:1），
3B-10-R：5’-GGGTTTGATAGTGGAGATTATTCA-3’（SEQ ID NO:2）；
引物组2的序列为：
2B-41-F：5’-CACCGAGAACGAAAGAAGGA-3’（SEQ ID NO:3），
2B-41-R：5’- TCTAAGGTGGGAGGGAAACC-3’（SEQ ID NO:4）；
（3）对扩增的产物进行凝胶电泳；
（4）对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，其中，引物组1产生128bp的母本特异标记，产生158bp的父本特异标记，引物组2产生177bp的母本特异标记，189bp的父本特异标记为。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增的20μl反应体系为：基因组DNA 5ng，Mg2+0.15mmol·L-1，dNTP 0.2mmol·L-1，SSR引物0.25 mmol·L-1，Taq 酶0.2U，10×PCR buffer:2.0μl，ddH20补足至20μl。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
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Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480208B (zh) * | 2014-12-17 | 2016-09-28 | 安徽荃银高科种业股份有限公司 | 一种快速检验杂交西瓜种子荃抗绿霸纯度的方法 |
| CN106916879A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 南京农业大学 | 线粒体基因组多态性构建黄瓜指纹图谱及其应用 |
| CN105755117B (zh) * | 2016-03-03 | 2019-02-12 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 快速鉴定有棱丝瓜‘雅绿6号’杂交种子纯度的核苷酸引物组合及检测方法 |
| CN106434930A (zh) * | 2016-10-08 | 2017-02-22 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 用于黄瓜‘粤青1号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法 |
| CN106755387B (zh) * | 2016-12-14 | 2020-07-21 | 山东省华盛农业股份有限公司 | 一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法 |
| CN107326068A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-11-07 | 南京农业大学 | 黄瓜－酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法 |
| CN111235306A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-06-05 | 江苏绿港现代农业发展有限公司 | 用于水果黄瓜绿美1号种子纯度鉴定的ssr引物及方法 |
| CN111254215B (zh) * | 2020-04-07 | 2021-05-11 | 北京市农林科学院 | 一种鉴定黄瓜杂交种纯度的方法及其使用的snp引物组合 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1266609A (zh) * | 2000-04-05 | 2000-09-20 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 随机“引物对”及用其鉴定作物种子纯度的方法 |
| CN101928766A (zh) * | 2009-06-23 | 2010-12-29 | 天津市农业科学院中心实验室 | 一种快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法 |
| CN102154479A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-17 | 天津科润农业科技股份有限公司 | 用于检测津优303号黄瓜杂交种子纯度的引物序列及检测方法 |
| CN102168134A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-31 | 天津科润农业科技股份有限公司 | 用于检测津优36号黄瓜杂交种子纯度的引物序列及检测方法 |
| CN103014151A (zh) * | 2012-11-06 | 2013-04-03 | 浙江省农业科学院 | 黄瓜种子纯度的快速检测方法 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1266609A (zh) * | 2000-04-05 | 2000-09-20 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 随机“引物对”及用其鉴定作物种子纯度的方法 |
| CN101928766A (zh) * | 2009-06-23 | 2010-12-29 | 天津市农业科学院中心实验室 | 一种快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度的方法 |
| CN102154479A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-17 | 天津科润农业科技股份有限公司 | 用于检测津优303号黄瓜杂交种子纯度的引物序列及检测方法 |
| CN102168134A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-31 | 天津科润农业科技股份有限公司 | 用于检测津优36号黄瓜杂交种子纯度的引物序列及检测方法 |
| CN103014151A (zh) * | 2012-11-06 | 2013-04-03 | 浙江省农业科学院 | 黄瓜种子纯度的快速检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 黄瓜新品种粤秀3号的选育;林毓娥等;《中国种业》;20071231(第6期);51-52 * |
| 黄瓜高密度SSR遗传图谱构建及其应用;任毅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科学辑》;20101231;全文 * |
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