CN103014151A - 黄瓜种子纯度的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄瓜种子纯度的快速检测方法，属于蔬菜种子生物检测技术领域。方法包括‘浙秀1号’DNA的提取；PCR扩增的体系、成分及程序；SSR引物的筛选；扩增产物的检测与‘浙秀1号’品种标准图谱的制备；待测样品种子纯度的鉴定等步骤。本方法选用三对引物中的任意一对进行PCR扩增，根据凝胶条带上的相对位置，对照该种标准图谱，在4-5小时内即能快速、准确地检测出“浙秀1号”的种子纯度，具操作方便，重复性好，结果准确等特点。本发明可在‘浙秀1号’的制种、繁种、经销企业推广应用。

Description

黄瓜种子纯度的快速检测方法

技术领域

    本发明涉及检测蔬菜作物种子质量的生物技术领域，具体涉及利用SSR分子标记组合快速检测黄瓜品种‘浙秀1号’种子纯度的方法。 

背景技术

种子纯度是种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准。目前应用于黄瓜种子纯度鉴定的方法主要是田间表型鉴定，但是田间表型鉴定存在周期长、工作量大、易受环境因素影响、表型特征会有一定程度偏差等问题，严重影响了品种纯度鉴定的效率及准确性。随着黄瓜育种进程的加快，需要进行品种纯度鉴定的材料越来越多，田间表型鉴定已越来越不能也不能满足育种工作和生产经营的需要。分子标记技术的出现为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、高效的方法。DNA分子标记反映了DNA水平上生物个体间的遗传差异，具有数量丰富、多态性高、可以在植株生长的任何阶段进行，鉴定快速，并不受基因表达和环境条件的影响等优点而逐渐得到应用。其中，SSR分子标记是常用的标记方法之一，该方法利用真核生物基因组中存在的大量微卫星重复序列设计引物，通过PCR扩增串联的重复序列，依据微卫星的重复次数在同一物种不同基因型间的差异，揭示长度多态性。SSR标记广泛、随机、均匀地分布于整个基因组，具有共显性遗传，分布广、稳定性和多态率高，操作简单、重复性好、对DNA质量要求较低等特点，因此，SSR分子标记能准确高效地鉴别大量等位基因。同时，利用SSR位点的差异，可以将呈父母本互补带型的杂交种与其亲本、甚至一些异源花粉造成的杂交种区分开，因此成为品种鉴定的理想分子标记。将对规范黄瓜种子产业，促进农业增产、农民增收具有重要意义。本研究应用SSR分子标记技术同时筛选出3对SSR引物，它们均可用于‘浙秀1号’黄瓜种子纯度的鉴定，且能相互验证，更可提高结果的准确性，具有较高的应用价值。目前，同时具有3对有效引物用于鉴定黄瓜种子纯度的尚未见有报道。 

发明内容

本发明目的是，针对多依赖表型抗性鉴定的传统种子纯度鉴定方法中，人为因素和环境因素影响大、费时、费力、准确率低等缺点，提供一种适用于黄瓜品种‘浙秀1号’全年、快速、准确检测种子纯度的方法。 

本发明目的通过以下技术方案得以实现： 

黄瓜品种‘浙秀1号’种子纯度的快速检测方法，该方法按以下步骤进行：

（1）‘浙秀1号’DNA的提取：取1粒‘浙秀1号’黄瓜种子，去除种皮后，利用CTAB法提取基因组DNA；

（2）PCR扩增的体系、成分及程序：PCR扩增反应总体系为20μl，体系成分为：‘浙秀1号’黄瓜种子基因组DNA 20ng，10pmol/μl上游引物、下游引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer 2μl，无菌重蒸水补齐至20μl；扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（3）对699对SSR引物进行筛选，其中有3对引物分别在‘浙秀1号’杂交种和其双亲之间存在扩增多态性，带型为双亲的互补带型，故可分别用于‘浙秀1号’种子纯度的鉴定；

所述黄瓜品种‘浙秀1号’快速检测种子纯度的引物序列为： 

（3）扩增产物的检测与‘浙秀1号’品种标准图谱的制备：在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却，取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在胶片观察灯上照相、观察并记录结果后，三对引物即可制备成‘浙秀1号’品种的三种标准图谱；其中，CSⅥ-37.2-F770扩增出的片段长度约为250bp，CSⅥ-24.9-F757扩增出的片段长度约为210bp，CSⅤ-18.5-F664扩增出的片段长度约为230bp；

（4）待测样品种子纯度的鉴定：利用上述三对引物，将待测样品种子按上述步骤（1）、（2）及（3）的同样工艺分别制备出指纹图谱后，再分别与相应引物扩增获得的‘浙秀1号’品种标准图谱进行比对，若其中任意一对引物的指纹图谱与相应引物‘浙秀1号’标准图谱凝胶条带的相对位置相同，则可基本确定该样品种子即为‘浙秀1号’，并根据其符合的百分率确定该种子的纯度；若三对引物的指纹图谱与相应引物‘浙秀1号’标准图谱凝胶条带的相对位置均相同，即三对引物结果得到互为验证，使待测样品种子的真伪及其种子纯度的鉴定更为精确、可靠。

检测‘浙秀1号’种子纯度的试剂盒，该试剂盒包括盒体和11支PCR管及利用上述三对引物分别制备‘浙秀1号’黄瓜种子所得的三张标准图谱照片；其中，在5支PCR管中分别装有MgCl₂，dNTP，10×buffer，Taq DNA 聚合酶和Loading Buffer，在另外6支PCR管中分别装有鉴定‘浙秀1号’黄瓜种子纯度的3对引物，序列分别为： 

CSⅥ-37.2-F770上游引物序列为5’-GGATAATCCTGATTCCTGTGG-3’，下游引物序列为5’-  TGTGCAACTGAAAACGAAGC-3’；

CSⅥ-24.9-F757上游引物序列为5’-GATTCTCCGGAAACGGATTT-3’，下游引物序列为5’-GTCGTTTTCCGCGATTCTAC-3’；

CSⅤ-18.5-F664上游引物序列为5’-CACACCATTTACGGTTATGGG-3’，下游引物序列为5’-CATTTGGTTCAGAAAGGGGA-3’。

本发明的有益效果是： 

1、快速高效：该方法在苗期及周年中均可进行鉴定，且检测的过程只需5-6个小时即可完成。

2、准确性高：该方法在DNA水平上进行鉴定，避免了同工酶鉴定和田间表型鉴定等间接鉴定方法所可能带来的误差，故具结果准确、重复性好等优点。 

3、操作简便：采用常规实验手段程序化操作，简便易行。 

4、成本低廉：该方法在苗期、实验室即可进行，减少了后续移栽、管理以及田间鉴定的工作量，节省大量人力、土地和物力。 

5、图谱结果判定简单、可靠：鉴定结果仅需与标准图谱进行比对，与标准图谱的相对位置完全一致则为‘浙秀1号’，与标准图谱的相对位置不一致则不是‘浙秀1号’，避免了人为因素的干扰。 

附图说明

图1 为利用引物CSⅥ-37.2-F770扩增获得的凝胶图谱 

其中，M为marker，1-22是提供参考的标准图谱，其中1-20为‘浙秀1号’，21为母本‘XH65’，22为父本‘XD23’；23-26为人为混入其中的其他自交系；

图2 为利用引物CSⅥ-24.9-F757扩增获得的凝胶图谱

其中，M为marker，1-20为‘浙秀1号’，21为母本‘XH65’，22为父本‘XD23’；23-26为父本‘XD23’；

图3 为利用引物CSⅤ-18.5-F664扩增获得的凝胶图谱

其中，M为marker，1-20为‘浙秀1号’，21为母本‘XH65’，22为父本‘XD23’；23-26为母本‘XH65’。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。 

对实施例所涉材料的说明： 

‘浙秀1号’：经浙江省农作物品种委员会认定：浙认蔬2008028；由浙江省农业科学院蔬菜研究所育成，是雌性系‘XH65’与‘XD23’配制而成的水果型黄瓜一代杂种，植株生长势强，早熟性好；瓜条短圆筒形，瓜皮绿色有光泽，无刺；瓜长约15cm，横径2.4cm，平均单瓜质量83g，口感脆嫩；高抗白粉病、枯萎病，抗霜霉病，每667m²产量7000kg左右，适于全国各地温室、大棚冬春及夏秋季栽培。

实施例1：（利用三对引物分别制作黄瓜品种‘浙秀1号’的标准图谱） 

（1）DNA的提取：取3粒‘浙秀1号’种子，去除种皮后，利用CTAB法分别提取基因组DNA； 

（2）PCR扩增：PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：浙秀1号’种子基因组DNA各20ng，10pmol/μl引物CSⅥ-37.2-F770、CSⅥ-24.9-F757和CSⅤ-18.5-F664的上游引物、下游引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer 2μl，无菌重蒸水补齐至20μl；

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（3）扩增产物的检测与‘浙秀1号’品种标准图谱的制备：在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却，取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在胶片观察灯上照相、观察并记录结果后，三对引物即可制备成‘浙秀1号’品种的三种标准图谱，备用；

    其中，CSⅥ-37.2-F770扩增出的片段长度约为250bp，CSⅥ-24.9-F757扩增出的片段长度约为210bp，CSⅤ-18.5-F664扩增出的片段长度约为230bp。

  

实施例2：（利用引物CSⅥ-37.2-F770对‘浙秀1号’及其父母本与混入种子的检测）

（1）DNA的提取：取20粒‘浙秀1号’，1粒父本‘XD23’、1粒母本‘XH65’和4粒人为混入的其他黄瓜自交系种子，去除种皮后，利用CTAB法分别提取基因组DNA； 

（2）PCR扩增：PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：浙秀1号’、父本、母本和待测样品（本例以人为混入的其他黄瓜自交系种子作为待测样品）的种子基因组DNA各 20ng，10pmol/μl引物CSⅥ-37.2-F770的上游引物、下游引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer 2μl，无菌重蒸水补齐至20μl；

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（3）扩增产物的检测：在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却；每样品各取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端，银染后，在胶片观察灯上照相、观察并记录结果；

（4）种子纯度鉴定：根据引物CSⅥ-37.2-F770 PCR扩增和电泳获得的电泳图谱，参照‘浙秀1号’的标准图谱对凝胶上条带的相对位置进行观察比较，如图1（1-26）所示：其中1-20与‘浙秀1号’标准图谱的相对位置相同，故确定1-20为‘浙秀1号’种子；21与‘浙秀1号’的标准图谱不相同，为母本‘XH65’；22与‘浙秀1号’的标准图谱也不相同，为父本‘XD23’；23-26与‘浙秀1号’的标准图谱均不相同，为人为混入的其他自交系种子。

  

实施例3：（利用引物CSⅥ-24.9-F757对‘浙秀1号’与父母本及待测样品的快速检测）

（1）DNA的提取：取20粒‘浙秀1号’、1粒父本‘XD23’、1粒母本‘XH65’和4粒父本‘XD23’（本例以人为混入的父本种子作为待测样品）的黄瓜种子，去除种皮后，利用CTAB法分别提取基因组DNA；

（2）PCR扩增：PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：浙秀1号’、父本、母本和待测样品的种子基因组DNA各20ng，10pmol/μl引物CSⅥ-24.9-F757的上游引物、下游引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer 2μl，无菌重蒸水补齐至20μl；

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（3）扩增产物的检测：在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却；每样品各取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在胶片观察灯上照相、观察并记录结果；

（4）种子纯度鉴定：根据引物CSⅥ-24.9-F757 PCR扩增和电泳获得的电泳图谱，参照相应引物‘浙秀1号’的标准图谱对凝胶上条带的相对位置进行观察比较，如图2（1-26）所示：其中1-20与‘浙秀1号’标准图谱的相对位置相同，故确定1-20为‘浙秀1号’，21与‘浙秀1号’的标准图谱不相同，为母本‘XH65’，22与‘浙秀1号’的标准图谱也不相同，为父本‘XD23’；23-26与‘浙秀1号’的标准图谱均不相同，而与22相同，故为父本‘XD23’。

  

实施例4：（利用引物CSⅤ-18.5-F664对‘浙秀1号’与父母本及待测样品的快速检测）

（1）DNA的提取：取20粒‘浙秀1号’、1粒父本‘XD23’、1粒母本‘XH65’和4粒母本‘XH65’（本例以人为混入的母本种子作为待测样品）的黄瓜种子，去除种皮后，利用CTAB法分别提取基因组DNA；

（2）PCR扩增：PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：浙秀1号’、父本、母本和待测样品的种子基因组DNA各20ng，10pmol/μl引物CSⅤ-18.5-F664的上游引物、下游引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer 2μl，无菌重蒸水补齐至20μl；

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（3）扩增产物的检测：在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却；每样品各取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端银染后，在胶片观察灯上照相、观察并记录结果；

（4）种子纯度鉴定：根据引物CSⅤ-18.5-F664 PCR扩增和电泳获得的电泳图谱，参照相应引物‘浙秀1号’的标准图谱对凝胶上条带的相对位置进行观察比较，如图3（1-26）所示：其中1-20与‘浙秀1号’标准图谱的相对位置相同，故确定1-20为‘浙秀1号’，21与‘浙秀1号’的标准图谱不相同，为母本‘XH65’，22与‘浙秀1号’的标准图谱也不相同，为父本‘XD23’；23-26与‘浙秀1号’的标准图谱均不相同，而与21相同，故为母本‘XH65’。

序列表

 

<110>浙江省农业科学院

<120>黄瓜品种‘浙秀1号’种子纯度的快速检测方法

<160>6

 

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CSⅥ-37.2-F770分子标记的上游引物

<400>1

GGATAATCCTGATTCCTGTGG 21

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CSⅥ-37.2-F770分子标记的下游引物

<400> 2

TGTGCAACTGAAAACGAAGC 20

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CSⅥ-24.9-F757分子标记的上游引物

<400>3

GATTCTCCGGAAACGGATTT 20

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CSⅥ-24.9-F757分子标记的下游引物

<400>4

GTCGTTTTCCGCGATTCTAC 20

 

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CSⅤ-18.5-F664分子标记的上游引物

<400>5

CACACCATTTACGGTTATGGG 21

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据已知序列而设计，由上海英骏生物技术公司合成，用作CSⅤ-18.5-F664分子标记的下游引物

<400>6

CATTTGGTTCAGAAAGGGGA 20

Claims (2)

1.  黄瓜种子纯度的快速检测方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）‘浙秀1号’DNA的提取：取1粒‘浙秀1号’黄瓜种子，去除种皮后，利用CTAB法提取基因组DNA；

（2）PCR扩增的体系、成分及程序：PCR扩增反应总体系为20μl，体系成分为：‘浙秀1号’黄瓜种子基因组DNA 20ng，10pmol/μl上游引物、下游引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺ 2μl，2mM dNTP 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×buffer 2μl，无菌重蒸水补齐至20μl；扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（3）对699对SSR引物进行筛选，其中有3对引物分别在‘浙秀1号’杂交种和其双亲之间存在扩增多态性，带型为双亲的互补带型，故可分别用于‘浙秀1号’种子纯度的鉴定；

所述黄瓜品种‘浙秀1号’快速检测种子纯度的引物序列为：

（4）扩增产物的检测与‘浙秀1号’品种标准图谱的制备：在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却，取6μl上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在胶片观察灯上照相、观察并记录结果后，三对引物即可制备成‘浙秀1号’品种的三种标准图谱；其中，CSⅥ-37.2-F770扩增出的片段长度约为250bp，CSⅥ-24.9-F757扩增出的片段长度约为210bp，CSⅤ-18.5-F664扩增出的片段长度约为230bp；

（5）待测样品种子纯度的鉴定：利用上述三对引物，将待测样品种子按上述步骤（1）、（2）及（3）的同样工艺分别制备出指纹图谱后，再分别与相应引物扩增获得的‘浙秀1号’品种标准图谱进行比对，若其中任意一对引物的指纹图谱与相应引物‘浙秀1号’标准图谱凝胶条带的相对位置相同，则可基本确定该样品种子即为‘浙秀1号’，并根据其符合的百分率确定该种子的纯度；若三对引物的指纹图谱与相应引物‘浙秀1号’标准图谱凝胶条带的相对位置均相同，即三对引物结果得到互为验证，使待测样品种子的真伪及其种子纯度的鉴定更为精确、可靠。

2.一种用于检测黄瓜品种‘浙秀1号’种子纯度的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括盒体和11支PCR管及利用权利要求1所述三对引物分别制备‘浙秀1号’黄瓜种子所得的三张标准图谱照片；其中，在5支PCR管中分别装有MgCl₂，dNTP，10×buffer，Taq DNA 聚合酶和Loading Buffer，在另外6支PCR管中分别装有鉴定‘浙秀1号’黄瓜种子纯度的3对引物，序列分别为：

CSⅥ-37.2-F770上游引物序列为5’-GGATAATCCTGATTCCTGTGG-3’，下游引物序列为5’-  TGTGCAACTGAAAACGAAGC-3’；

CSⅥ-24.9-F757上游引物序列为5’-GATTCTCCGGAAACGGATTT-3’，下游引物序列为5’-GTCGTTTTCCGCGATTCTAC-3’；

CSⅤ-18.5-F664上游引物序列为5’-CACACCATTTACGGTTATGGG-3’，下游引物序列为5’-CATTTGGTTCAGAAAGGGGA-3’。

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