CN103993081A - 一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法 - Google Patents

一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法，提供一种具有多态性高、遗传稳定、检测成功率高、便于广泛使用等优点的分子标记方法，能够快速准确地鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼。根据遗传纯合度的差异，从14个SSR标记中筛选出了5个在雌核发育群体与野生群体中扩增稳定、条带清晰、多态性和遗传纯合度差异较大SSR。由于雌核发育群体中遗传纯合度大大提高，SSR在其体内扩增的等位基因数目也会减少。统计分析发现，这5个SSR在普通草鱼体内扩增的实际等位基因数目为8-10个，而在雌核发育草鱼体内扩增的等位基因数目为5-7个，通过比较等位基因数即可鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼，其准确率的理论值可达99.92％。

Description

一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法
【技术领域】
本发明属于分子标记技术领域，涉及一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的分子标记方法。
【背景技术】
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属于鲤形目、鲤科、草鱼属，又名鲩鱼，是我国重要的淡水经济养殖鱼类之一。草鱼在我国分布广泛，年产量约占我国淡水鱼总产量的20％。近年来，草鱼种质资源退化严重，病害频繁，给草鱼养殖业带来巨大的损失。但草鱼由于繁殖所需周期长(一般4-5年性成熟)，传统方法进行草鱼的种质改良与优良品种的选育工作进展缓慢。人工诱导雌核发育技术是快速建立纯系、固定优良性状的有效手段。该方法不仅可以对研究草鱼性别决定机制、染色体定位、草鱼遗传图谱构建等具有重要意义；而且，在生产应用方面对实现草鱼单性养殖及快速选育生长速度快、抗病能力强的优良草鱼新品系具有重要意义。但是雌核发育草鱼在形态和生理上同普通草鱼无法区分，在实际养殖和保种过程中极易混淆，运用微卫星分子标记建立一种能区分雌核发育草鱼与普通草鱼的分子生物学方法无疑是解决这一问题的有效途径。
目前，在鉴别雌核发育草鱼方面，已有学者采用同工酶、RAPD标记技术对雌核发育草鱼的遗传多样性、纯合度及多态位点丢失情况进行了研究，然而，同工酶是基因表达产物，其检测位点有限，对亲缘关系较近或遗传基础复杂的品种不容易区分；RAPD标记稳定性和重复性均较差，很难满足实际需要。相比较而言，微卫星(SSR)标记技术，由于其共显性遗传，具有检测位点数量多、多态性高、稳定遗传和不受环境条件影响等优点，已被广泛用于动植物品种鉴定等研究，采用微卫星分子标记鉴别长江水系雌核发育群体与普通群体的研究还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的在于针对现有雌核发育草鱼与普通草鱼的鉴别方法所存在的不足，提供一种具有多态性高、遗传稳定、检测成功率高、便于广泛使用等优点的分子标记方法，能够快速准确地鉴别出雌核发育草鱼与普通草鱼。
本发明采取的技术方案：
本发明利用POPGEN32软件对雌核发育草鱼群体和普通草鱼群体的微卫星位点遗传多样性参数进行统计分析，包括等位基因数(numbers of allele,Ne)，观测纯合度(observedhomozygosty,Obs_Ho),观测杂合度(observed heterozygosity,Obs_He)，期望杂合度(expected heterozygosity,Exp_He)等，根据这两个群体之间遗传纯合度的差异，从14个SSR标记中筛选出了5个在雌核发育草鱼群体与普通草鱼群体中扩增稳定、条带清晰、多态性和遗传纯合度差异较大SSR。草鱼为二倍体生物，这5个微卫星标记可在草鱼个体中扩增的等位基因数目从5—10个不等，由于雌核发育群体中遗传纯合度大大提高，在这个5个SSR上扩增的等位基因数目也相应减少。实验统计结果表明，这5个SSR在每一尾普通草鱼同体内扩增的实际等位基因数目从8-10个不等，而在每一尾雌核发育草鱼体内扩增的实际等位基因数目从5-7个不等。因此，通过比较这5个SSR在草鱼体内扩增的等位基因数即可鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼。根据本发明中的实验统计结果和相关文献报道(Jamieson A，Taylor S C.Comparisons of three peobability formulae for parentage exclusion[J].AnimalGenetics，1997，28(6)：397～400)，计算得到本发明的鉴别理论概率为99.92％，准确率较高。
本发明的具体步骤如下：
(1)取待测草鱼尾鳍，利用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA；
(2)选取5对SSR引物，以步骤(1)中所提取的DNA为模板进行PCR扩增反应，得扩增产物，其中这5对微卫星引物如下：
AAGGAACAGCATAAACCGAAAT GGAACCAAGCATCTGAAACTG
TGTATCAGTAGTAGGCGGTTTA GTGTCGCTACCTCGCTAT
AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG ATTGAAACAGATGCCTGCTTG
CAGACGGATGGATGGATG CTTTCAAAATGTGGAGTCTTGC
AAAATCCCAGTGAGACAATC ATCCCATAATGCCTTGC；
(3)将步骤(2)的PCR产物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，10V/cm电泳2h，用0.1％硝酸银染色，氢氧化钠显色液显色，拍照记录电泳结果；
(4)分析步骤(3)的电泳图谱，若待测草鱼在所述的5个SSR标记位点上扩增的等位基因数为5-7个，则待测草鱼为雌核发育草鱼，若测草鱼在所述的5个SSR标记位点上扩增的等位基因数为8-10个，则待测草鱼为普通草鱼。
所述步骤(2)中，进行PCR扩增时，PCR反应总体积为20μL，含有10×反应缓冲液10μL,上下游引物各0.5μL,基因组DNA40ng,用灭菌双蒸水补足体积至20μL。
所述步骤(2)中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，50-60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃再延伸7min。
其中，每1L步骤(3)中所述氢氧化钠显色液中含10g NaOH,1g无水NaCO3，5ml37％的甲醛。
本实发明的优点及有益效果：
本发明从14个鲤鱼和草鱼的微卫星中筛选出的5个SSR在雌核发育群体与野生群体中扩增稳定、条带清晰、多态性和遗传纯合度差异较大，根据草鱼在这5个SSR位点上扩增的等位基因数快速、准确地鉴定其为雌核发育草鱼或普通草鱼，其准确鉴别理论概论达99.92％，具有准确性高、结果稳定、操作统计简便等优点。
【附图说明】
图1为5个SSR在实施例1中的各个样本中扩增的等位基因数；
图2为5个SSR在实施例2中的各个样本中扩增的等位基因数。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所包含范围不限于此。
实施例1
(1)基因组DNA提取
自2010年5月—7月从湖北省和湖南省的3个四大家鱼原种场采集一批长江水系草鱼共102尾组成长江群体，采样地点和数量见表1。以5尾兴国红鲤雄鱼与30尾来自长江水系的草鱼雌鱼为父母本，冷休克抑制第二极体排出的方法建立草鱼的异精雌核发育群体(平游鱼苗约10万尾)。以雌核发育的草鱼子代F1群体为检测组(群体G)，来自长江水系的野生草鱼群体为对照组(群体W)，2个群体随机各选取48尾样本，取尾鳍保存于95％的乙醇中备用。
表1长江水系草鱼群体的采样情况表
群体名称 采集地点 数量(尾)
监利 湖北省老河子四大家鱼原种场 26
石首 湖北省石首四大家鱼原种场 40
长沙 湖南省四大家鱼原种场 36
将长江水系的普通草鱼与雌核发育的草鱼各48尾样本，取尾鳍保存于95％的乙醇中备用。基因组DNA抽提采用酚-氯仿抽提法，提取方法参考《分子克隆实验指南》。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和纯度并用紫外分光光度计估计其浓度，用无菌双蒸水稀释至浓度为50ng/μL，-20℃保存备用。
(2)PCR扩增反应
以(1)中制得的基因组DNA溶液为模板，以7对鲤鱼的SSR、2对草鱼磁珠富集法获得的SSR和5对EST-SSR为检测标记，分别进行PCR扩增，制得PCR扩增产物。SSR-PCR反应体系和程序如下：20μL反应体系含有10×buffer(反应缓冲液)10μL,上下游引物各0.5μL,基因组DNA40ng,灭菌双蒸水补足体积至20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃30s，50-60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃再延伸7min。微卫星引物序列、目的产物大小等信息见表2，由生工生物工程(上海)(Sangon Biotech)股份有限公司合成。
表214个微卫星分子标记的引物信息
(3)微卫星分子标记的筛选与遗传多样性分析
将(2)制得的PCR产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，10V/cm电泳2h，用0.1％硝酸银染色，氢氧化钠显色液显色(临用时配制，每1L所述氢氧化钠显色液中含10gNaOH,1g无水NaCO3，5ml37％的甲醛)，用美国Bio-rad的GelDoc XR凝胶成像系统成像。从合成的14对SSR引物中共筛选出11对扩增稳定、条带清晰而特异好的引物，其中MFW4、MFW17、MFW24为单态。用POPGEN32软件统计微卫星位点的遗传多样性参数，8个多态SSR在群体G和群体W的PCR扩增多态信息见表3、表4。
表3草鱼中8个微卫星位点的遗传多样性参数
位点 等位基因 等位基因数 观测纯和度 观测杂合度 期望杂合度
MFW5 184-190 4 0.2708 0.7292 0.6309
MFW15 140-148 3 0.2708 0.7292 0.5176
HLJC148 176-240 8 0.1875 0.8125 0.7971
4703 222-276 5 0.1250 0.8750 0.6957
30977 214-234 4 0.1250 0.8750 0.6784
23426 253-284 2 0.0208 0.9792 0.4998
17329 149-168 3 0.4583 0.5417 0.3950
25085 154-189 3 0.1667 0.8333 0.5694
均值Mean --- 4.13 0.2031 0.7969 0.5980
表4雌核发育草鱼中8个微卫星位点的遗传多样性参数
位点 等位基因 等位基因数 观测纯和度 观测杂合度 期望杂合度
MFW5 184-190 3 0.2083 0.7917 0.5651
MFW15 140-148 3 0.5833 0.4167 0.3776
HLJC148 176-240 4 0.8333 0.1667 0.6589
4703 222-276 5 0.8333 0.1667 0.6267
30977 214-234 4 0.6667 0.3333 0.4954
23426 253-284 2 0.9167 0.0833 0.0799
17329 149-168 3 0.7292 0.2708 0.2433
25085 154-189 2 0.9583 0.0417 0.0408
均值Mean --- 3.25 0.7161 0.2839 0.386
根据这8对多态引物在雌核发育草鱼和野生草鱼中扩增的情况，发现在雌核发育群体中纯合度明显提高，在23426位点普通草鱼的纯合度仅为2.08％，而雌核发育草鱼的纯合度为91.67％；在25085位点则分别为16.67％和95.83％；在4703位点则分别为12.50％和83.33％，具体见表3和表4。根据遗传纯合度的差异，挑选出5个SSR，进行2个群体的鉴别分析。这5对微卫星引物的位点和序列如下：
23426：AAGGAACAGCATAAACCGAAAT GGAACCAAGCATCTGAAACTG
25085：TGTATCAGTAGTAGGCGGTTTA GTGTCGCTACCTCGCTAT
4703：AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG ATTGAAACAGATGCCTGCTTG
HLJC148：CAGACGGATGGATGGATG CTTTCAAAATGTGGAGTCTTGC
30977：AAAATCCCAGTGAGACAATC ATCCCATAATGCCTTGC
根据概率理论和相关文献报道(Jamieson A，Taylor S C.Comparisons of three peobabilityformulae for parentage exclusion[J].Animal Genetics，1997，28(6)：397～400)，利用SSR位点的纯合度差异来评估该样本是属于群体G(检测组)还是群体W(对照组)时，某位点的理论鉴别概率P＝Ho_g×(1-Ho_w)×100％，其中Ho_g为该位点群体G的纯合度，Ho_w为该位点群体W的纯合度。n个位点联合使用时的理论概率P’＝[1-(1-P1)(1-P2)…(1-Pn)]×100％，其中P1为第1个位点的理论鉴别概率，P2为第2个位点的理论鉴别概率，Pn为第n个位点的理论鉴别概率。通过统计计算表明，将本发明中筛选出的5个位点联合使用时，鉴别的理论概率可达99.92％。
草鱼为二倍体生物，5个微卫星标记可在草鱼个体中扩增的等位基因数目从5—10个不等，将实验所得结果转化为等位基因数据，发现这5个SSR在随机抽取的48尾普通草鱼体内扩增的等位基因数目从8-10个不等，而在随机抽取的48尾雌核发育草鱼体内扩增的等位基因数目从5-7个不等，具体见图1。可见，联合应用这5个SSR标记可以有效区分雌核发育草鱼与普通草鱼，在随机取的48尾普通草鱼和48尾雌核发育草鱼中实际鉴别的概率为100％。
实施例2
(1)基因组DNA提取
与实施例1中的(1)相似，所不同之处在于利用热休克抑制第一次卵裂的方法建立草鱼的雌核发育群体。
(2)PCR扩增
以步骤(1)中制得的基因组DNA溶液为模板，用5对微卫星引物对分别进行PCR扩增，制得PCR扩增产物。SSR-PCR反应体系和程序如下：20μL反应体系含有10×buffer(反应缓冲液)10μL,上下游引物各0.5μL,基因组DNA40ng,灭菌双蒸水补足体积至20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃30s，50-60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃再延伸7min。其中5对微卫星引物序列如下：
AAGGAACAGCATAAACCGAAAT GGAACCAAGCATCTGAAACTG
TGTATCAGTAGTAGGCGGTTTA GTGTCGCTACCTCGCTAT
AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG ATTGAAACAGATGCCTGCTTG
CAGACGGATGGATGGATG CTTTCAAAATGTGGAGTCTTGC
AAAATCCCAGTGAGACAATC ATCCCATAATGCCTTGC
(3)反应结束后，将步骤(2)制得的PCR产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，10V/cm电泳2h，用0.1％硝酸银染色，氢氧化钠显色液显色(临用时配制，每1L所述氢氧化钠显色液中含10g NaOH,1g无水NaCO3，5ml37％的甲醛)，用美国Bio-rad的GelDoc XR凝胶成像系统成像。对电泳结果进行分析统计，得到上述5个SSR在各样本中扩增的等位基因数如图2所示，其鉴定结果进一步证明了本发明方法的准确性和可靠性。

Claims (4)

1.一种鉴别雌核发育草鱼与普通草鱼的方法，其特征在于其具体步骤如下：
(1)取待测草鱼尾鳍，利用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA；
(2)以步骤(1)中制得的基因组DNA溶液为模板，用5对微卫星引物对分别进行PCR扩增，制得PCR扩增产物，其中的5对微卫星引物序列如下：
AAGGAACAGCATAAACCGAAAT GGAACCAAGCATCTGAAACTG
TGTATCAGTAGTAGGCGGTTTA GTGTCGCTACCTCGCTAT
AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG ATTGAAACAGATGCCTGCTTG
CAGACGGATGGATGGATG CTTTCAAAATGTGGAGTCTTGC
AAAATCCCAGTGAGACAATC ATCCCATAATGCCTTGC；
(3)将步骤(2)的PCR产物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，10V/cm电泳2h，用硝酸银溶液染色，氢氧化钠显色液显色，拍照记录电泳结果；
(4)根据步骤(3)的电泳图谱得到所述5个SSR标记在待测体内扩增的等位基因数，在5-7个之间则为雌核发育草鱼，在8-10个之间则为普通草鱼。
2.根据权利要求1所述的鉴别所述雌核发育草鱼与普通草鱼的方法，其特征在于所述步骤(2)中，进行PCR扩增时反应时，PCR反应体系为：总体积为20μL，其中含有10×反应缓冲液10μL,上下游引物各0.5μL,基因组DNA40ng,用灭菌双蒸水补足体积至20μL。
3.根据权利要求1所述的鉴别所述雌核发育草鱼与普通草鱼的方法，其特征在于所述步骤(2)中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，50-60℃30s，72℃30s，30个循环，72℃再延伸7min。
4.根据权利要求1或2或3所述的鉴别所述雌核发育草鱼与普通草鱼的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述硝酸银溶液的浓度为0.1％，每1升所述氢氧化钠显色液中含10gNaOH,1g无水NaCO3，5ml37％的甲醛。
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