CN102690829B - 一种台湾蠛蠓dna条形码标准基因序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种台湾蠛蠓DNA条形码标准基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为CO Ⅰ基因，具有基因序列SEQ ID NO.1。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。台湾蠛蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，从而保证了结果的可靠性。本发明提供的台湾蠛蠓DNA条形码标准基因序列有利于实现台湾蠛蠓的快速鉴定，缩短鉴定时间。
Description
技术领域
本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种台湾蠛蠓DNA条形码标准基因序列。
背景技术
台湾蠛蠓（Lasiohelea taiwana Shiraki, 1913）俗称小黑蚊，是我国南方常见的一类微小型吸血蠓类，属双翅目（Diptera）蠓科（Ceratopogonidae）蠛蠓属（Lasiohelea）。该蠓于日间叮咬人体小腿及脚踝等裸露之处，造成人体痒痛甚至产生过敏反应。我国学者已先后从台湾蠛蠓体内分离出乙脑病毒，并提出该蠓可能是乙脑病毒新的传播媒介。
对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是疾病预防与控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。
DNA条形码技术（DNA Barcoding）是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。近几年来，DNA 条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。
作为DNA条形码的标准目的基因，一方面必须足够保守，便于利用通用引物进行大范围的扩增；另一方面要有足够的变异来区分不同物种。因此，鉴定不同的物种类群需要选择有效的目的基因。目前，在系统发育研究中广泛应用的标志基因是核糖体12S和16S基因，但因其存在大量的插入和缺失现象，不宜用做条形编码基因。线粒体基因组中存在的13个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（Cytochrome Oxidase Subunit Ⅰ, COⅠ）、线粒体细胞色素b（Cytb）、ND4、ND5这4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900 bp左右这两个条件，但ND4和ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA鉴定系统的目标基因。故人们最终选定COⅠ基因中的一个片段作为DNA条形编码基因。迄今为止，已有诸多研究证明COⅠ基因在鸟类、鱼类、鳞翅目昆虫、蚊类、蚁类和弹尾目等类群的分类鉴定中行之有效。因此，可采用基于COⅠ基因的DNA条形码技术对吸血蠓进行分子鉴定。该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等问题，而且有利于实现吸血蠓的快速鉴定。目前，该方法在吸血蠓分子鉴定中的应用仅局限于库蠓，Genbank中也已有部分库蠓的COⅠ基因序列，但至今尚无台湾蠛蠓的相关基因序列。本发明提供的台湾蠛蠓DNA条形码标准基因序列有利于实现台湾蠛蠓的快速鉴定，缩短鉴定时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种台湾蠛蠓DNA条形码标准基因序列。该基因序列的获得，大大有利于实现台湾蠛蠓的快速鉴定。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：一种台湾蠛蠓DNA条形码标准检测基因，其特征在于所述条形码标准检测基因为COⅠ基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：
tttaatatta ggagctcctg atatagcttt cccacgaata aataatataa gattttgaat 60
attaccccct tctctttcat tattattaat tagaagttta gtagaaaatg gagctggtac 120
cggatgaaca gtttatcccc ctttagcggc caatatattt cacgcaggcg cttctgttga 180
tttagcaatt ttttctcttc atttagccgg aatttcatca attctaggag ctattaattt 240
tattactact attattaata tacgagctaa tggaatttca tttgatcgta tgcctttatt 300
tgtatgatca gttttaatta ctgcagtatt attattatta tctttacctg ttcttgccgg 360
agctattact atattattaa cagatcgtaa tttaaataca tctttttttg atcctgcagg 420
agggggtgat cccatcctat accagcatct attttgattt tttggacatc ct 472 。
所述的台湾蠛蠓DNA条形码标准检测基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。
本发明的台湾蠛蠓的分子鉴定方法，包括：
1）从待测的台湾蠛蠓组织中分离提取DNA；
2）以该DNA为模板用一对引物，正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’，反向引物 5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’，通过聚合酶链式反应扩增出台湾蠛蠓COⅠ基因；
3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的COⅠ基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出480bp的条带，送生物公司测序；
4）根据测序结果，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为台湾蠛蠓。
根据DNA条形码技术原理，采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增台湾蠛蠓的COⅠ基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。台湾蠛蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，从而保证了结果的可靠性。
所述引物根据文献合成，正向引物为5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’，反向引物为5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。
本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。
本发明填补了Genbank中台湾蠛蠓COⅠ基因序列的空白。
与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现台湾蠛蠓的分子鉴定，能有效缩短台湾蠛蠓的鉴定时间。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为本发明的台湾蠛蠓自然种群COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-6均为台湾蠛蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小为480bp的条带。M为2000plus的DNA marker。
图3为本发明的台湾蠛蠓实验室种群COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-2为台湾蠛蠓雌虫头和腹部末端的COⅠ基因，检出大小为480bp的条带。M为2000plus的DNA marker。
具体实施方式
实施例1
1、台湾蠛蠓标本的采集与保存
采用人帐诱法或人诱法采集台湾蠛蠓，采获的标本经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。
2、试验样品的前处理
取出保存于75%酒精中的台湾蠛蠓标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便于制片进行种类鉴定。剩余部分移入PCR管中，75%酒精保存，每管一只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，则应将装有台湾蠛蠓剩余组织部位的PCR管置于-20℃冰箱冻存。
3、DNA模板制备
采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取台湾蠛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用。
4、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’
5、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表1所示。
表1为台湾蠛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
| 成分 | 体积（uL） |
| 模板 | 10 |
| 引物1 | 1 |
| 引物2 | 1 |
| 2×Mastermix | 25 |
| ddH2O | 13 |
本实施例的反应程序如表2所示。
表2为台湾蠛蠓COⅠ基因PCR反应程序
| 步骤 | 反应温度（℃） | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94 | 3 min | 5 |
| 变性 | 94 | 30 s | 5 |
| 退火 | 45 | 90 s | 5 |
| 延伸 | 68 | 60 s | 5 |
| 变性 | 94 | 30 s | 35 |
| 退火 | 51 | 90 s | 35 |
| 延伸 | 68 | 60 s | 35 |
| 延伸 | 68 | 10 min | 35 |
PCR产物于4℃保存备用。
6、PCR扩增产物检测
取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。
7、基因序列测定
选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为目的基因序列。
实施例2
1、试样的选取与保存
取实验室批量饲养的台湾蠛蠓，经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。台湾蠛蠓批量饲养前种类已经权威专家复核。
2、试样的前处理
取出保存于75%酒精中的台湾蠛蠓标本，用解剖针将头和腹部末端切下，分别移入PCR管中，75%酒精保存，并进行唯一性编号，用于DNA提取。
3、DNA模板制备
采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取台湾蠛蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用。
4、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’
5、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表3所示。
表3为台湾蠛蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）
| 成分 | 体积（uL） |
| 模板 | 10 |
| 引物1 | 1 |
| 引物2 | 1 |
| 2×Mastermix | 25 |
| ddH2O | 13 |
本实施例的反应程序如表4所示。
表4为台湾蠛蠓COⅠ基因PCR反应程序
| 步骤 | 反应温度（℃） | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94 | 3 min | 5 |
| 变性 | 94 | 30 s | 5 |
| 退火 | 45 | 90 s | 5 |
| 延伸 | 68 | 60 s | 5 |
| 变性 | 94 | 30 s | 35 |
| 退火 | 51 | 90 s | 35 |
| 延伸 | 68 | 60 s | 35 |
| 延伸 | 68 | 10 min | 35 |
PCR产物于4℃保存备用。
6、PCR扩增产物检测
取5μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35 min）。溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱参见附图3。由电泳图3看出实施例2的批量饲养的台湾蠛蠓也能特异性扩增出480bp 的产物，即可初步判断所述的批量饲养的台湾蠛蠓也为台湾蠛蠓。为了更明确地论证是台湾蠛蠓，将480bp 的产物送生物公司测序，测试结果显示与基因序列SEQ ID NO. 1的同源性在99%，因而可以确认待测组织即为台湾蠛蠓。
Claims (3)
1.一种台湾蠛蠓DNA条形码标准检测基因，其特征在于所述条形码标准检测基因为COⅠ基因，为如下所述的基因序列SEQ ID NO.1：
tttaatatta ggagctcctg atatagcttt cccacgaata aataatataa gattttgaat 60
attaccccct tctctttcat tattattaat tagaagttta gtagaaaatg gagctggtac 120
cggatgaaca gtttatcccc ctttagcggc caatatattt cacgcaggcg cttctgttga 180
tttagcaatt ttttctcttc atttagccgg aatttcatca attctaggag ctattaattt 240
tattactact attattaata tacgagctaa tggaatttca tttgatcgta tgcctttatt 300
tgtatgatca gttttaatta ctgcagtatt attattatta tctttacctg ttcttgccgg 360
agctattact atattattaa cagatcgtaa tttaaataca tctttttttg atcctgcagg 420
agggggtgat cccatcctat accagcatct attttgattt tttggacatc ct 472 。
2.权利要求1所述的台湾蠛蠓DNA条形码标准检测基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。
3.一种台湾蠛蠓的分子鉴定方法，包括：
1）从待测的台湾蠛蠓组织中分离提取DNA；
2）以该DNA为模板用一对引物，正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’，反向引物 5’CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’，通过聚合酶链式反应扩增出台湾蠛蠓COⅠ基因；
3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的COⅠ基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出480bp的条带，则送生物公司测序；
4）根据测序结果，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为台湾蠛蠓。
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