CN103409516B - 一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，包括以下步骤：提取斑点叉尾鮰肌肉组织中的基因组DNA；在线粒体DNA D-loop控制区设计PCR引物；将基因组DNA在PCR引物的作用下进行PCR扩增，得到线粒体DNA D-loop序列；利用限制性内切酶EcoR Ⅰ对线粒体DNA D-loop序列在37℃的温度下酶切2～3小时；将酶切后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果，鉴定出斑点叉尾鮰物种。本发明在对D-loop测序的基础上，寻找其酶切位点，并进行酶切鉴定，不需测序即可简单地鉴定出斑点叉尾鮰物种。本发明从分子水平鉴定斑点叉尾鮰物种，操作简单易行，所耗时间短暂，极其适合对出入境的斑点叉尾鮰物种进行鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，尤其涉及一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行斑点叉尾鮰物种遗传信息鉴定的方法，属于分子生物学PCR遗传鉴定领域。
背景技术
斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦称沟鲶（Channel Catfish），属鲶形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae）、叉尾鮰属（Ictalurus）。它原产于北美，其自然分布区在美国中部、加拿大南部和墨西哥北部。斑点叉尾鮰属名贵淡水经济鱼类，深受美国、加拿大及其它许多国家消费者的喜爱。加工好的成品或半成品在美国、日本、欧洲和加拿大等地市场均很畅销，市场需求量极大。自1984年，我国湖北省水产研究所首次引进斑点叉尾鮰，随着繁育、养殖以及加工技术的日趋成熟，再加上高额的投资回报效益，使得斑点叉尾鮰的养殖业和加工业在我国迅速蓬勃发展，出口创汇效益也逐年攀升。
据报道，近年来曾被美国政府视为“反倾销”而遭封杀的越南巴沙鱼贴着“中国斑点叉尾鮰”的标签进入美国市场，这不但严重损害我国斑点叉尾鮰的品牌，影响了我国斑点叉尾鮰产品的正常出口，而且扰乱了国际斑点叉尾鮰市场，因被美国多次退货给企业造成经济损失。作为主要依托科技手段保障经贸发展的出入境检验检疫部门也已经面临一项全新的任务和挑战。
对于已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，由于形态已发生完全改变，主要依据骨骼结构和外部形态特征的传统物种鉴定方法在斑点叉尾鮰的物种鉴定上已完全不适用。此外，在成品和半成品中，由于细胞结构的破坏和蛋白质的严重变性，依据染色体特征的细胞分类学方法以及依据同功酶数据的酶学鉴定方法等也同样不适合斑点叉尾鮰的物种鉴定。
随着PCR技术和DNA测序技术的日趋成熟，通过DNA序列信息了解物种之间的遗传分化变得越来越普遍。线粒体DNA以其进化速率快，遵循母系遗传等特点，成为种群遗传学研究的有效标记之一。有关科技查新结果表明，国外已有线粒体DNA的PCR-RFLP的数据进行鳕鱼、比目鱼等制品中物种鉴定的报道，但均没有线粒体DNA的D-loop区的分子数据来进行斑点叉尾鮰物种鉴定方面的报道。而且PCR-RFLP方法操作过程繁琐，多用于对同一物种的不同群体进行遗传多态性分析，不适于快速、经济的鉴定斑点叉尾鮰物种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，解决现有技术的不足，利用已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，快捷方便的鉴别出斑点叉尾鮰物种。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，包括以下步骤：
1）采用酚－氯仿法提取斑点叉尾鮰肌肉组织中的基因组DNA；
2）在斑点叉尾鮰线粒体DNA D-loop控制区设计PCR引物，其核苷酸序列为：
正向：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，
反向：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；
3）将步骤1）所得的基因组DNA在步骤2）设计的PCR引物的作用下进行PCR扩增，得到线粒体DNA D-loop序列；再将线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果初步鉴定斑点叉尾鮰物种；
4）利用限制性内切酶EcoR I对所述步骤3）所得的线粒体DNA D-loop序列在37℃的温度下酶切2～3小时；
5）将经过步骤4）酶切后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果，鉴定出斑点叉尾鮰物种。
本发明的有益效果是：线粒体DNA控制区具有个体和种群特异性，因此已被国际上广泛地用来作为物种鉴定的标准，尤其是D-loop控制区，不同物种差异较大，可以准确鉴定物种。本发明在对D-loop测序的基础上，寻找其酶切位点，并进行酶切鉴定，不需测序即可简单地鉴定出斑点叉尾鮰物种。本发明从分子水平鉴定斑点叉尾鮰物种，操作简单易行、快速实用，所耗时间短暂，极其适合对出入境的斑点叉尾鮰物种进行鉴定。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
基因组DNA的提取采用常规的酚-氯仿抽提法，具体参考萨姆布鲁克（2002）的方法稍作改动：
(1)取用酒精固定的尾鳍约0.1g于2ml离心管中，剪碎，置于37℃烘干；
(2)向离心管中加入500ul抽提缓冲液，并加入RNaseA，至终浓度为20μg/ml，37℃水浴1h。然后向抽提缓冲液中加入蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，55℃水浴过夜；
(3)将消化好的样品冷却至室温后，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），轻轻地上下颠倒10min，使充分混匀，12000rpm离心10min；
(4)用扩口枪头小心地吸取上层水相至另一新的离心管中，重复步骤3）；
(5)吸取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），操作同上，重复抽提一次；
(6)最后吸上清，向上清夜中加入1/10体积的NaAc，轻摇混匀，再加2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，待有絮状沉淀析出后，置于-20℃沉淀1～2h。然后12000r/min离心10min；
(7)小心地倒出上清液，不要把沉淀倒出；
(8)用保存于4℃的70％乙醇洗涤2次，并于4℃10000rpm离心5min，弃去液体，让沉淀自然风干，待白色沉淀变为无色透明时加入300μl TE贮存液溶解DNA，沉淀完全溶解后，保存于-20℃备用；
(9)DNA浓度测定。待DNA完全溶解于TE后，采用蛋白质-核酸检测仪直接测出DNA的浓度和A260/A280比值；
DNA的电泳检测。用0.8%的琼脂糖凝胶（含10mg/ml EB）对DNA样品进行电泳，并与Marker比较。电泳结束后，在凝胶成像系统中观察、拍照，从电泳图判断提取DNA的质量。
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0,若DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
采用常规的酚－氯仿法提取用酒精固定的斑点叉尾鮰肌肉组织DNA，分子量为9.5～10.5kb。提取的DNA样品取2～4μl在0.8％琼脂糖上检测，抽检结果如图1所示：纯度和亮度都比较高，几乎无拖尾现象。用核酸蛋白仪进一步检测显示，DNA浓度在400～1500ng/μl，A260/A280比值在1.65～1.82之间变化。因此所提基因组DNA完全可以满足线粒体D-loop扩增的要求。
上述方法中，步骤3）所述PCR反应体系如下：
PCR反应体系为25.0μl，内含10×Reaction Buffer for Taq DNA聚合酶2.5μl、MgCl2（25mM）2.0μl、dNTPs（2.5mM）2.0μl、Primers（10pmol/μl）1μl、模板DNA（template DNA，100ng/μl）0.5μl、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase1U/μl）1.0μl、超纯水16.0μl。
PCR的条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃。为扩增出特异性的目的条带，在其他反应参数不变的条件下，调节退火温度，最终得到条带清晰的目的产物。其中，D-loop对应的最佳退火温度为54.8℃。
将线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果初步鉴定斑点叉尾鮰物种（能利用所设计的特异性引物扩增出清晰的D-loop序列的为斑点叉尾鮰或其亲缘性较近的物种）。
将步骤3）得到斑点叉尾鮰的线粒体DNA D-loop序列进行测序，对测序得到的D-loop序列，用软件DNA club查找酶切位点。经查找，在线粒体DNAD-loop序列的200bp处有一特异的酶切位点EcoR Ⅰ。利用此限制性内切酶EcoR Ⅰ分别对斑点叉尾鮰的线粒体DNA D-loop序列进行酶切鉴定。酶切体系如下：10×buffer1μL、EcoR Ⅰ0.5μL、D-loop8.5μL。酶切条件为：37℃的温度下酶切2～3小时。
EcoR Ⅰ是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：
正向：5'G↓AATTC3'，
反向：3'CTTAA↑G5'。
将酶切之后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，斑点叉尾鮰的线粒体DNAD-loop序列被限制性内切酶酶EcoR Ⅰ切成两个片段，大的分子量为850～950bp，小的分子量为150～250bp。由此，可以不需要进行DNA测序，简单的鉴定出斑点叉尾鮰物种。
附图说明
图1为本发明提取的DNA基因组的凝胶电泳图；
图2为本发明D-loop PCR扩增的凝胶电泳图；其中，M为MarkerDL2000,1～5分别为斑点叉尾鮰、大口鲇、革胡子鲶、鲤和鲫的D-loop扩增图谱；
图3为本发明D-loop酶切的凝胶电泳图；其中，M为Marker DL2000，分子量大小依次为2000，1000，750，500，250bp；1为斑点叉尾鮰D-loop酶切结果，2为革胡子鲶D-loop酶切结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一、基因组DNA的提取
采用常规的酚-氯仿抽提法，具体参考萨姆布鲁克（2002）的方法稍作改动：
（1）取用酒精固定的尾鳍约0.1g于2ml离心管中，剪碎，置于37℃烘干；
（2）向离心管中加入500ul抽提缓冲液，并加入RNaseA，至终浓度为20μg/ml，37℃水浴1h。然后向抽提缓冲液中加入蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，55℃水浴过夜；
（3）将消化好的样品冷却至室温后，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），轻轻地上下颠倒10min，使充分混匀，12000rpm离心10min；
（4）用扩口枪头小心地吸取上层水相至另一新的离心管中，重复步骤3）；
（5）吸取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），操作同上，重复抽提一次；
（6）最后吸上清，向上清夜中加入1/10体积的NaAc，轻摇混匀，再加2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，待有絮状沉淀析出后，置于-20℃沉淀1-2h。然后12000r/min离心10min；
（7）小心地倒出上清液，不要把沉淀倒出；
（8）用保存于4℃的70％乙醇洗涤2次，并于4℃10000rpm离心5min，弃去液体，让沉淀自然风干，待白色沉淀变为无色透明时加入300μl TE贮存液溶解DNA，沉淀完全溶解后，保存于-20℃备用；
（9）DNA浓度测定。待DNA完全溶解于TE后，采用蛋白质-核酸检测仪直接测出DNA的浓度和A260/A280比值；
DNA的电泳检测。用0.8%的琼脂糖凝胶（含10mg/ml EB）对DNA样品进行电泳，并与Marker比较。电泳结束后，在凝胶成像系统中观察、拍照，从电泳图判断提取DNA的质量。
采用常规的酚－氯仿法提取用酒精固定的斑点叉尾鮰肌肉组织DNA，分子量为9.5～10.5kb。提取的DNA样品取2～4μl在0.8％琼脂糖上检测，抽检结果如图1所示：纯度和亮度都比较高，几乎无拖尾现象。用核酸蛋白仪进一步检测显示，DNA浓度在400～1500ng/μl，A260/A280比值在1.65～1.82之间变化。因此所提基因组DNA完全可以满足线粒体D-loop扩增的要求。
二、引物设计
D-loop引物是根据NCBI数据库斑点叉尾鮰已知序列自行设计，引物序列为：
正向：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，
反向：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’。
三、在引物的作用下进行PCR扩增
PCR反应体系为25.0μl，内含10×Reaction Buffer for Taq DNA聚合酶2.5μl、MgCl2（25mM）2.0μl、dNTPs（2.5mM）2.0μl、Primers（10pmol/μl）1μl、模板DNA（template DNA，100ng/μl）0.5μl、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase1U/μl）1.0μl、超纯水16.0μl。
PCR的条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃。为扩增出特异性的目的条带，在其他反应参数不变的条件下，调节退火温度，最终得到条带清晰的目的产物。其中，D-loop对应的最佳退火温度为54.8℃。
采用以上PCR反应体系对斑点叉尾鮰、革胡子鲶、大口鲇、鲤等几种鱼进行PCR扩增，在进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果如图2所示，其中，M为Marker DL2000,1-5分别为斑点叉尾鮰、大口鲇、革胡子鲶、鲤和鲫的D-loop扩增图谱。由图2可见，只有斑点叉尾鮰和革胡子鲶可以利用所设计的特异性引物扩增出清晰的D-loop序列，说明这两者的亲缘关系较近。这可以作为斑点叉尾鮰区分于其他亲缘关系较远物种的方法。
四、将斑点叉尾鮰的线粒体DNA D-loop序列进行测序，对测序得到的D-loop序列，用软件DNA club查找酶切位点。经查找，在线粒体DNA D-loop序列的200bp处有一特异的酶切位点EcoR Ⅰ。利用此限制性内切酶EcoR Ⅰ分别对斑点叉尾鮰的线粒体DNA D-loop序列进行酶切鉴定。酶切体系如下：10×buffer1μL、EcoR Ⅰ0.5μL、D-loop8.5μL。酶切条件为：37℃的温度下酶切2～3小时。
将酶切之后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果如图3所示，其中，M为Marker DL2000，分子量大小依次为2000，1000，750，500，250bp；1为斑点叉尾鮰D-loop酶切结果，2为革胡子鲶D-loop酶切结果。由图3可以看出，斑点叉尾鮰的D-loop序列被酶切成两个片段，大的分子量为850～950bp，小的分子量为150～250bp，而革胡子鲶的D-loop序列没有被切开。由此，可以不需要进行NDA测序，简单的鉴定出斑点叉尾鮰物种。
为了验证斑点叉尾鮰PCR扩增和限制性内切酶酶切的特异性，又从检验检疫局取了多份样品，并对多份样品同时进行了PCR扩增和限制性内切酶酶切，检测结果表明重复性和稳定性符合要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用酚－氯仿法提取斑点叉尾鮰肌肉组织中的基因组DNA；
2)在斑点叉尾鮰线粒体DNA D-loop控制区设计PCR引物，其核苷酸序列为：
正向：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，
反向：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；
3)将步骤1)所得的基因组DNA在步骤2)设计的PCR引物的作用下进行PCR扩增，得到线粒体DNA D-loop序列；再将线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果初步鉴定斑点叉尾鮰物种；
4)利用限制性内切酶EcoRⅠ对所述步骤3)所得的线粒体DNA D-loop序列在37℃的温度下酶切2～3小时；
5)将经过步骤4)酶切后的线粒体DNA D-loop序列进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳的结果最终鉴定，斑点叉尾鮰的线粒体DNAD-loop序列被限制性内切酶EcoRⅠ酶切成两个片段，大的分子量为850～950bp，小的分子量为150～250bp，符合上述结果的即为斑点叉尾鮰物种。
2.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)所得的基因组DNA分子量为9.5～10.5kb，浓度为400～1500ng/μl，A260/A280比值在1.65～1.82之间。
3.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，54.8℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃。
4.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)中限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点位于线粒体DNA D-loop序列的200bp处。
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