CN106591299A - 一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法 - Google Patents

一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，通过6对大片段扩增用特异性引物对、9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物以双棘黄姑鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增获得线粒体全基因组序列，可为双棘黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

Description

一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法。
背景技术
双棘黄姑鱼(Protonibea diacanthus)隶属鲈形目,石首鱼科，原黄姑鱼属,俗称黑鮸、赤鮸,是近海暖温性底层鱼类。主要分布于朝鲜、日本、东南亚及中国沿海,为近海中下层鱼类。双棘黄姑鱼具有生长快速、病害少、适应性强、易于养殖和鳔大等优点，是深水网箱或池塘养殖的理想品种之一，发展前景广阔。
双棘黄姑鱼体型较大，养殖1年可达到商品规格，2年可达2～2.5Kg。早在2004年，双棘黄姑鱼的人工育苗获得成功，目前已在我国浙江、福建和广东沿海网箱广泛普及。人工养殖的双棘黄姑鱼存在着种质退化、病害频发和养殖效益下降等问题。因此，为保护这一优良海水养殖品种，系统的研究与合理的开发利用显得极为重要。关于双棘黄姑鱼的系统发育，朱元鼎等(1963)和成庆泰(1987)依据鳔和耳石的特征将双棘黄姑鱼归于黄姑鱼属。但是有学者提出异议，认为双棘黄姑鱼应为双棘原黄姑鱼，归入原黄姑鱼属。由于石首鱼科分类所采用的形态、计数和解剖特征不一致，双棘黄姑鱼的分类归属问题仍然存在一定争议。
线粒体基因组是生物重要的遗传物质，其中后生动物线粒体DNA为典型的环状双链分子结构，长度大多在14-18kb之间，编码37个基因，包括13个蛋白质基因、22个tRNA以及12S rRNA和16S rRNA(Wolstenholme DR，1992，)。线粒体DNA是核外遗传物质,具有分子量小、结构简单、母系遗传等特点,成为生物多样性、群体遗传学与系统进化研究中的重要分子标记(Lavou and Miya，2007)。目前，线粒体基因已作为种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，并且线粒体ND2、16SrRNA与Cyt b基因、D-loop序列已被应用于水产动物中贝类(苏天凤，2007；汪桂玲，2009)、甲壳类(王成辉，2008)、鱼类(李林，2011；蒋宗良，2011)物种遗传多样性及系统发育关系分析。迄今为止还没有对双棘黄姑鱼的线粒体基因组序列与遗传保护相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，通过6对大片段扩增用特异性引物对、9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物以双棘黄姑鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增获得线粒体全基因组序列，可为双棘黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。
本发明还提供了双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，包括6对大片段扩增用特异性引物对，6对大片段扩增用特异性引物对具体如下：
第1对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(5'-AGTTGATAGTCCACGGCGTAAAG-3')，下游引物为：SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(5'-GGGTAAGGTAAAGGTATTGGTGC-3')；
第2对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(5'-TTTCTATCTATGCCTTGCTCTTTC-3')，下游引物为：SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列(5'-CCCCTGAGGAAGTTAGGAGTAAA-3')；
第3对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列(5'-TCCACCAATCACAAAGACATCG-3')，下游引物为：SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列(5'-GGTAGAGGCTTAGAAGTAGCACAA-3')；
第4对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列(5'-ACCGCTGCCCTAGGACACCT-3')，下游引物为：SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列(5'-GAATAGGGCAGAGGAGGTGAGA-3')；
第5对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列(5'-CTGATGAGCAGGTTGCCTAT-3')，下游引物为：SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列(5'-TTCTGTTTGGTCTGGTAGTGGG-3')；
第6对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列(5'-GGTAAGCTGACGACGGCGGTAT-3')，下游引物为：SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列(5'-CCAAGTAGCAGCTATGCATCAG-3')。
作为优选，还包括9对基因组步移用特异性引物对，具体如下：
第7对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列(5'-CTTACACCGAGCAGCCATTC-3')，下游引物为：SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列(5'-GGCGTTGCCGGATCTGTATT-3')；
第8对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列(5'-ATCTTCACAGGAGGCTTTAC-3')，下游引物为：SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列(5'-GGTTAGTGTCCTGCAAGTCT-3')；
第9对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列(5'-TTCTGATTCTTCGGCCATCC-3')，下游引物为：SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列(5'-GTTAGTAGGCGGTTGTTGAG-3')；
第10对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列(5'-CCTCGTAGCAGTAGTTCTTC-3')，下游引物为：SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列(5'-ACTGACCGTGGCTGTAAGTT-3')；
第11对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列(5'-CTACTCAACACTGCCGTTCT-3')，下游引物为：SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列(5'-GTACCGGCATTAAGTCGTTC-3')；
第12对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列(5'-GGCGTTATCTACTGAGAAGC-3')，下游引物为：SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列(5'-TGAAACTTTGGGTCCCTACT-3')；
第13对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列(5'-CCGATTCAGGTGAGGATGAG-3')，下游引物为：SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列(5'-TCCCCCAGCATACATTAGTG-3')；
第14对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列(5'-TTTAAGTTGACGGGATGTTG-3')，下游引物为：SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列(5'-CAATAGGCTACCCTCGATTC-3')；
第15对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列(5'-TGCTTACGGAGCTTTCTAGG-3')，下游引物为：SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列(5'-CTTATTCTCGCCGCAGCTGG-3')。
作为优选，还包括5条基因组步移用特异性引物，具体如下：
第1条引物为：SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列(5'-CGAACCCAACCCGGAGAGAT-3')；
第2条引物为：SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列(5'-CCCTCTATATGTTCTTAATGAC-3')；
第3条引物为：SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列(5'-CACCAGTCCTGGTTAGAGTC-3')；
第4条引物为：SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列(5'-GGTTAAACTCCTCCCTACTG-3')；
第5条引物为：SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列(5'-CATTACTTAAGAACCACATA-3')。
一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法，以提取的双棘黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用6对大片段扩增用特异性引物对进行6个大片段产物扩增，然后分别以扩增的6个大片段作为模板使用9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖电泳检测后送生物公司测序。
本发明的有益效果是：
1、本发明针对鲈形目石首鱼科的双棘黄姑鱼设计了6对大片段扩增用特异性引物对、9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物可以对双棘黄姑鱼线粒体DNA进行PCR扩增，并获得线粒体全长基因。
2、本发明首次获得双棘黄姑鱼线粒体基因组全长序列，经分析得出：序列全长16533bp，包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因。
3、本发明的6对大片段扩增用特异性引物对、9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物可以对不同群体的双棘黄姑鱼基因组DNA进行PCR扩增。
4、获得的双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为双棘黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
以提取的双棘黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用6对大片段扩增用特异性引物对进行6个大片段产物扩增，然后分别以扩增的6个大片段作为模板使用9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物进行PCR组合扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖电泳检测后送生物公司测序，对测序结果使用生物软件对测序结果进行拼接，具体步骤如下：
1、5×TBE Buffer配制
称量氨基丁三醇54g，Na2EDTA·2H2O 3.72g，硼酸27.5g于1L烧杯中；加入约800ml去离子水，搅拌均匀；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存备用。
2、DNA提取
采用高盐法提取双棘黄姑鱼DNA，步骤如下：
(1)取双棘黄姑鱼(样本由温州南麂岛采集)背部肌肉组织50mg放入装有360μL高盐抽提缓冲液(0.4M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA pH 8.0.Aljanabi SM,Martinez I(1997)Universal and rapid salt-extraction of high quality genomicDNAfor PCR-based techniques.Nucleic Acids Res 25:4692–4693)的离心管中，用灭菌的眼科剪刀快速剪碎，然后分别加入40μL 20％SDS，10μl Proteinase K(20mg/ml)溶液，温和颠倒混匀，在56℃放置1h或过夜，直至组织完全溶解。
(2)加入300μL 6M NaCl涡旋30s，在12000rpm 4℃高速离心30min，将上清移入新的离心管中。
(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，温和颠倒混匀5min，常温下12000rpm离心10min，将上清移入新的离心管中。
(4)加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，温和颠倒混匀5min，常温下12000rpm离心10min，将上清移入新的离心管中。
(5)加入2/3体积预冷的异丙醇，温和颠倒混匀，待出现白色线状沉淀，在12000rpm，4℃离心15min，弃上清。
(6)向管中加入800μL预冷的75％乙醇，上下颠倒5min，在12000rpm，4℃离心15min，弃上清。
(7)重复操作步骤6。
(8)将提取的DNA白色沉淀置于通风柜中干燥20min，加入50～100μL灭菌水或者Tris-EDTA buffer(TE，10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)溶解，-20℃保存备用。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
称量取5g琼脂糖粉加入含50mL 1×TBE缓冲液的锥形瓶，微波炉内反复加热3次至琼脂粉溶解并无气泡，冷至70℃左右加3μL溴化乙锭(EB)核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。30min后，琼脂糖凝胶成形，轻轻拔掉梳子。电泳槽内加1×TBE缓冲液，在点样孔内依次加入双棘黄姑鱼DNA提取样品5μL和DNA/Hind III标准分子量标记(或者DL2000marker)5μl，电泳电压设为5V/cm，电泳30min后在凝胶成像仪中检测。
4、引物设计
参考日本黄姑鱼(Nibea japonica，GenBank:KT184692)和银彭纳石首鱼(Pennahia argentata，GenBank：KC545800)线粒体基因组全序列排列顺序，用生物软件DNAMAN分析上述参考鱼类线粒体基因保守区，用生物软件Oligo 7在基因保守区内设计特异性引物，引物由上海生工生物公司合成。
5、PCR扩增
采用大连宝生物工程有限公司PrimeHS DNA Polymerase(R010Q)扩增目的基因，反应体系：2μL双棘黄姑鱼DNA模板，2.5μL10×Buffer(含Mg2+)，4μL dNTP(2.5mmol/L)，1μL上游引物(10μmol/L)、1μL下游引物(10μmol/L)、0.2μL HS Taq DNA聚合酶(5U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐。PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55～58℃退火30s，72℃延伸5min(根据扩增产物的长度)，共35个循环；最72℃延伸10min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测(同第3步)目的条带，6对大片段扩增用特异性引物对扩增后分别获得2.8Kb，3.0Kb，3.3Kb，2.8Kb，3.1Kb和5.2Kb的扩增片段。
6、基因组步移
采用大连宝生物工程有限公司TaKaRa Ex(RR53A)扩增目的基因，分别以扩增的6个大片段作为模板，其中2.8Kb产物使用第7对引物进行扩增；3.0Kb产物使用第8对引物和第1条单引物；3.3Kb产物使用第9～10对引物；2.8Kb产物使用第11对引物；3.1Kb产物使用第2条单引物；5.2Kb产物使用第12～15对引物及第3～5条单引物。
反应体系(只有引物对时)：2μL DNA模板，5.0μL10×Buffer(含Mg2+)，8μL dNTP(2.5mmol/L)，2μL正向引物(10μmol/L)、2μL反向引物(10μmol/L)、0.25μL Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐。
反应体系(只有单引物时)：2μL DNA模板，5.0μL10×Buffer(含Mg2+)，8μL dNTP(2.5mmol/L)，4μL单引物(10μmol/L)、0.25μL Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐。
反应体系(引物对和单引物同时使用时)：2μL DNA模板，5.0μL10×Buffer(含Mg2 +)，8μL dNTP(2.5mmol/L)，2μL正向引物(10μmol/L)、2μL反向引物(10μmol/L)、4μL单引物(10μmol/L)、0.25μL Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55～58℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；最72℃延伸10min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测(同第3步)目的条带。
7、PCR扩增产物测序及序列拼接和序列信息分析
将有目的条带的PCR产物直接送上海杰李生物公司测序。将送检测序结果用生物软件ContigExpress进行拼接，结果和序列碱基质量通过ContigExpress软件检查，手工去除错误拼接。序列拼接结果用软件DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/)、tRNAscan-SE1.21和在线BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对识别蛋白质编码基因、rRNA基因和tRNA基因。
8、双棘黄姑鱼线粒体基因同源性分析
在Genebank数据库中下载双棘黄姑鱼近缘物种生物银彭纳石首鱼KC545800)线粒体基因序列，经比对，与银彭纳石首鱼有较一定的同源性，但是存在2723个变异位点。
9.不同群体双棘黄姑鱼遗传多样性分析
以不同群体双棘黄姑鱼个体(福建漳浦、温州南麂和广东饶平)作为样本，参照1～7步骤获得不同群体双棘黄姑鱼线粒体基因序列，用MEGA5.0软件进行序列比较和变异检测，确定变异位点和单倍型。用DnaSP5.0计算核苷酸多样性(Nucleotide diversity，π)、单倍型多样性(haplotype diversity，h)和核苷酸歧异度(Pairwise divergence)。
经分析，所采集的3个群体存在的变异位点分别为12个，8个和5个，单倍型数分别为10个，4个和3个。核苷酸多样性(π)分别为0.00312,0.00283和0.00227。单倍型多样性(h)分别为0.845，0.753和0.587。核苷酸歧异度分别为2.337，1.862和1.147。
双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的序列信息(GenBank accession:KY117237)。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省海洋水产研究所
<120> 一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法
<130> 2016.12
<160> 35
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctactcaaca ctgccgttct 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtaccggcat taagtcgttc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggcgttatct actgagaagc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgaaactttg ggtccctact 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccgattcagg tgaggatgag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tcccccagca tacattagtg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tttaagttga cgggatgttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
caataggcta ccctcgattc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcttacgga gctttctagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cttattctcg ccgcagctgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgaacccaac ccggagagat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccctctatat gttcttaatg ac 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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caccagtcct ggttagagtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ggttaaactc ctccctactg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cattacttaa gaaccacata 20

Claims (4)

1.一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，其特征在于，包括6对大片段扩增用特异性引物对，6对大片段扩增用特异性引物对具体如下：
第1对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列；
第2对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列；
第3对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列；
第4对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列；
第5对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列；
第6对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，其特征在于，还包括9对基因组步移用特异性引物对，具体如下：
第7对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.14所示的核苷酸序列；
第8对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.16所示的核苷酸序列；
第9对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.18所示的核苷酸序列；
第10对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.20所示的核苷酸序列；
第11对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列；
第12对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.24所示的核苷酸序列；
第13对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.26所示的核苷酸序列；
第14对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.28所示的核苷酸序列；
第15对引物对的上游引物为：SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQ IDNO.30所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，其特征在于，还包括5条基因组步移用特异性引物，具体如下：
第1条引物为：SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列；
第2条引物为：SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列；
第3条引物为：SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列；
第4条引物为：SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列；
第5条引物为：SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列。
4.一种双棘黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法，其特征在于，以提取的双棘黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用6对大片段扩增用特异性引物对进行6个大片段产物扩增，然后分别以扩增的6个大片段作为模板使用9对基因组步移用特异性引物对和5条基因组步移用特异性引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖电泳检测后送生物公司测序。
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