CN105154526A

CN105154526A - 日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法

Info

Publication number: CN105154526A
Application number: CN201510427226.4A
Authority: CN
Inventors: 胡则辉; 柴学军; 王跃斌; 朱云海
Original assignee: Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Current assignee: Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-07-21
Also published as: CN105154526B

Abstract

本发明公开了一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法，通过20对特异性引物对日本黄姑鱼基因组进行PCR扩增获得日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为日本黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

Description

日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法。

背景技术

日本黄姑鱼（Nibeajaponic）俗称黑毛鲿，鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)，黄姑鱼属(Nibea)（朱元鼎，1963；成庆泰1987），为一种大型优质食用鱼类，主要分布于中国东海、南海及日本南部沿海。

日本黄姑鱼为大型食用鱼类，最大的个体可以达到1.5米以上，能适应不良环境和抵御疾病能力强，易于养殖，饵料系数低，生长迅速，是重要的海水养殖品种，也是增殖放流的主要对象之一。由于其较高的经济价值，日本黄姑鱼承受的捕捞压力一直有增无减。近年来，由于东海区资源量下降，对日本黄姑鱼的资源增殖工作引起人们的重视。线粒体基因组是生物重要的遗传物质，其中后生动物线粒体DNA为典型的环状双链分子结构,长度大多在14-18kb之间,编码37个基因，包括13个蛋白质基因、22个tRNA以及12SrRNA和16SrRNA（WolstenholmeDR，1992，）。线粒体DNA是核外遗传物质,具有分子量小、结构简单、母系遗传等特点,成为生物多样性、群体遗传学与系统进化研究中的重要分子标记（MiyaMandTakeshimaH，2003；LavouSandMiyaM，2007）。目前，线粒体基因已作为种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，并且线粒体ND2、16SrRNA与Cytb基因、D-loop序列已被应用于水产动物中贝类(苏天凤2007；汪桂玲2009)、甲壳类(王成辉，2008)、鱼类(李林，2011；蒋宗良，2011)物种遗传多样性及系统发育关系分析。迄今为止还没有对日本黄姑鱼的线粒体基因组序列、遗传和种质资源鉴定与保护相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，通过20对特异性引物对日本黄姑鱼基因组进行PCR扩增获得日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为日本黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，包括20对引物对，具体序列信息如下所示：

（1）第1对上游引物为：SEQIDNO.1所示的核苷酸序列（5'-CTTCAAGGCTGTTATACGCACACC-3'），下游引物为：SEQIDNO.2所示的核苷酸序列（5'-GCCAGGTCTTGTTTGGAGAGTTC-3'）；

（2）第2对上游引物为：SEQIDNO.3所示的核苷酸序列（5'-CATTTTTCCTCCCAAGTACG-3'），下游引物为：SEQIDNO.4所示的核苷酸序列（5'-TGGAGGCTGCAGTTGCTTGT-3'）；

（3）第3对上游引物为：SEQIDNO.5所示的核苷酸序列（5'-GCGCTAGCCTACTTCTTCAG-3'），下游引物为：SEQIDNO.6所示的核苷酸序列（5'-TCTATGGCTTGGAGGAAAGT-3'）；

（4）第4对上游引物为：SEQIDNO.7所示的核苷酸序列（5'-CCTGACTAGTTCCTGCTAAG-3'），下游引物为：SEQIDNO.8所示的核苷酸序列（5'-TTAGGAAGCGTGCGGTGAAT-3'）；

（5）第5对上游引物为：SEQIDNO.9所示的核苷酸序列（5'-TCTGCCTTTATCTTCACATC-3'），下游引物为：SEQIDNO.10所示的核苷酸序列(5'-CCGGCCCTCTTAGCTTTAAC-3')；

（6）第6对上游引物为：SEQIDNO.11所示的核苷酸序列（5'-TCGCCCTCCTTATCCAAATTTACC-3'），下游引物为：SEQIDNO.12所示的核苷酸序列（5'-AGGGGATCAAAACCGCATTCATAA-3'）；

（7）第7对上游引物为：SEQIDNO.13所示的核苷酸序列（5'-GCCTCTCTCCTTGCACAAGT-3'），下游引物为：SEQIDNO.14所示的核苷酸序列（5'-AAAAAGAGGGTGGCGGAAAG-3'）；

（8）第8对上游引物为：SEQIDNO.15所示的核苷酸序列（5'-GCCATCTCCCAATACCAAAC-3'），下游引物为：SEQIDNO.16所示的核苷酸序列（5'-TTGTTGTGAGGATCGCTACT-3'）；

（9）第9对上游引物为：SEQIDNO.17所示的核苷酸序列（5'-TAATTCTTGCTGCCGTCCTC-3'），下游引物为：SEQIDNO.18所示的核苷酸序列（5'-AGGCTGGTTAAGTCCGATAG-3'）；

（10）第10对上游引物为：SEQIDNO.19所示的核苷酸序列（5'-TCAAAACAACGAGGCCTGAC-3'），下游引物为：SEQIDNO.20所示的核苷酸序列（5'-GGGTGCTCCCGGTTATGTAT-3'）；

（11）第11对上游引物为：SEQIDNO.21所示的核苷酸序列（5'-CTCCACATTCCTAGCCGTCTG-3'），下游引物为：SEQIDNO.22所示的核苷酸序列（5'-TTCAAGCCGTTAGTCCTGGTTAA-3'）；

（12）第12对上游引物为：SEQIDNO.23所示的核苷酸序列（5'-GATCAACGAACCGAGTTACC-3'），下游引物为：SEQIDNO.24所示的核苷酸序列（5'-TAAGGAAGGCAACGGCTAGG-3'）；

（13）第13对上游引物为：SEQIDNO.25所示的核苷酸序列（5'-CACCCTTCACAGTACTTGAG-3'），下游引物为：SEQIDNO.26所示的核苷酸序列（5'-GTCAATCATGAGAAGACTAT-3'）；

（14）第14对上游引物为：SEQIDNO.27所示的核苷酸序列（5'-TGAGGTTGAGCCGCCTGTAG-3'），下游引物为：SEQIDNO.28所示的核苷酸序列（5'-AGGGCAATGGGGGTGAAAAT-3'）；

（15）第15对上游引物为：SEQIDNO.29所示的核苷酸序列（5'-GGCACACGGTTATTGAAGGT-3'），下游引物为：SEQIDNO.30所示的核苷酸序列（5'-CAATCTGGCCAATAATAATG-3'）；

（16）第16对上游引物为：SEQIDNO.31所示的核苷酸序列（5'-CCCAAGAAGTTTCATATCACCCC-3'），下游引物为：SEQIDNO.32所示的核苷酸序列（5'-TCTATTTCCCGCTTACTGCTAAA-3'）；

（17）第17对上游引物为：SEQIDNO.33所示的核苷酸序列（5'-CCCATGCTAGCCCTTACATT-3'），下游引物为：SEQIDNO.34所示的核苷酸序列（5'-ACGTGGTCTGTCTTGGTGTC-3'）；

（18）第18对上游引物为：SEQIDNO.35所示的核苷酸序列（5'-AAATTATCTGGACTGTACTC-3'），下游引物为：SEQIDNO.36所示的核苷酸序列（5'-TGGGAATCAAGAATAAGTTT-3'）；

（19）第19对上游引物为：SEQIDNO.37所示的核苷酸序列（5'-CTGATGATACGGCCGAGCAG-3'），下游引物为：SEQIDNO.38所示的核苷酸序列（5'-GAGTAGCCGGCGGTGATAAG-3'）；

（20）第20对上游引物为：SEQIDNO.39所示的核苷酸序列（5'-GGAACAAGGAGCTGGTATCA-3'），下游引物为：SEQIDNO.40所示的核苷酸序列（5'-CCTACGAAGGCAGTCATCAT-3'）。

日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法，以提取的日本黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用4对扩增引物进行4个大片段产物扩增，然后通过基因组步移的方法，使用剩余的16对扩增引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测后送生物公司测序。

作为优选，4对扩增引物为第1对，第6对，第11对和第16对。

日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物扩增获得的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，日本黄姑鱼线粒体全基因组序列见SEQIDNO.41所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果是：

1、本发明针对鲈形目石首鱼科的日本黄姑鱼设计了20对特异性引物可以对日本黄姑鱼

线粒体DNA进行PCR扩增，并获得线粒体全长基因。

2、本发明首次获得日本黄姑鱼线粒体基因组全长序列，经分析得出：序列全长16496bp，包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因。

3、本发明的20对特异性引物可以对不同群体的日本黄姑鱼基因组DNA进行PCR扩增。

4、获得的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为日本黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

以提取的日本黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用4对特异引物（第1，6，11和16对）进行4个大片段产物扩增，然后基因组步移的方法，使用本发明中的（2-5，7-10，12-15，17-20）引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测后送生物公司测序，对测序结果使用生物软件对测序结果进行拼接，具体步骤如下：

1、5×TBEBuffer配制

称量氨基丁三醇54g，Na₂EDTA·2H₂O3.72g，硼酸27.5g于1L烧杯中；加入约800ml去离子水，搅拌均匀；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存备用。

2、DNA提取

采用高盐法提取日本黄姑鱼DNA，步骤如下：

（1）取日本黄姑鱼（由浙江省海洋水产研究所试验场提供）背部肌肉组织50mg放入装有360μL高盐抽提缓冲液（0.4MNaCl，10mMTris-HClpH8.0，2mMEDTApH8.0.AljanabiSM,MartinezI(1997)Universalandrapidsalt-extractionofhighqualitygenomicDNAforPCR-basedtechniques.NucleicAcidsRes25:4692–4693）的离心管中，用灭菌的眼科剪刀快速剪碎，然后分别加入40μL20%SDS，10μlProteinaseK(20mg/ml)溶液，温和颠倒混匀，在56℃放置1h或过夜，直至组织完全溶解。

（2）加入300μL6MNaCl涡旋30s，在12000rpm4℃高速离心30min，将上清移入新的离心管中。

（3）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），温和颠倒混匀5min，常温下12000rpm离心10min，将上清移入新的离心管中。

（4）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），温和颠倒混匀5min，常温下12000rpm离心10min，将上清移入新的离心管中。

（5）加入2/3体积预冷的异丙醇，温和颠倒混匀，待出现白色线状沉淀，在12000rpm，4℃离心15min，弃上清。

（6）向管中加入800μL预冷的75%乙醇，上下颠倒5min，在12000rpm，4℃离心15min，弃上清。

（7）重复操作步骤6。

（8）将提取的DNA白色沉淀置于通风柜中干燥20min，加入50~100μL灭菌水或者Tris-EDTAbuffer(TE，10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

3、琼脂糖凝胶电泳检测

称量取5g琼脂糖粉加入含50mL1×TBE缓冲液的锥形瓶，微波炉内反复加热3次至琼脂粉溶解并无气泡，冷至70℃左右加3μL溴化乙锭（EB）核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。30min后，琼脂糖凝胶成形，轻轻拔掉梳子。电泳槽内加1×TBE缓冲液，在点样孔内依次加入日本黄姑鱼DNA提取样品5μL和DNA/HindIII标准分子量标记（或者DL2000marker）5μl，电泳电压设为5V/cm，电泳30min后在凝胶成像仪中检测。

4、引物设计

参考黄姑鱼（Nibeaalbiflora，GenBank:HQ890947.1）、美国红鱼（Sciaenopsocellatus，GenBank:JQ286004.1）、鮸鱼（Miichthysmiiuy，GenBank:HM447240.1）线粒体基因组全序列排列顺序，用生物软件DNAMAN分析上述参考鱼类线粒体基因保守区，用生物软件Oligo6在基因保守区内设计4对引物，引物由上海生工生物公司合成，其余16对引物为基因组步移扩增所用。

5、PCR扩增

采用大连宝生物工程有限公司PrimeSTARHSDNAPolymerase（R010Q）扩增目的基因，反应体系：2μL日本黄姑鱼DNA模板，2.5μL10×Buffer（含Mg²⁺）,4μLdNTP(2.5mmol/L)，1μL正向引物（即上游引物，10μmol/L）、1μL反向引物（即下游引物10μmol/L）、0.2μLHSTaqDNA聚合酶(5U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐。PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55~58℃退火30s，72℃延伸5min(根据扩增产物的长度)，共35个循环；最72℃延伸10min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测（同第3步）目的条带。4对引物分别获得4.5kb，5.3kb，4.9kb和3.4kb的目的片段。

第1对引物，第6对引物，第11对引物和第16对引物分别采用上述扩增反应体系进行PCR扩增，获得4个扩增片段。第1对引物扩增获得4.5kb的目的片段，第6对引物扩增获得5.3kb的目的片段，第11对引物扩增获得4.9kb的目的片段，第16对引物扩增获得3.4kb的目的片段。

6、基因组步移

采用大连宝生物工程有限公司TaKaRaExTaq（RR53A）扩增目的基因（即步骤5扩增获得的4.5kb，5.3kb，4.9kb和3.4kb的目的片段），分别以扩增的4个大片段作为模板，其中4.5kb产物使用第2~5对引物进行扩增；5.3kb产物使用第7~10对引物，4.9kb产物使用第12~15对引物，3.4kb产物使用第17~20对引物。反应体系：2μLDNA模板，5.0μL10×Buffer（含Mg²⁺），8μLdNTP(2.5mmol/L)，2μL正向引物（10μmol/L）、2μL反向引物（10μmol/L）、0.25μLExTaqDNA聚合酶(5U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，50~54℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35个循环；最72℃延伸10min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测（同第3步）目的条带。

7、PCR扩增产物测序及序列拼接和序列信息分析

将有目的条带的PCR产物直接送上海杰李生物公司测序。将送检测序结果用生物软件ContigExpress进行拼接，结果和序列碱基质量通过ContigExpress软件检查，手工去除错误拼接。序列拼接结果用软件DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/)、tRNAscan-SE1.21和在线BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对识别蛋白质编码基因、rRNA基因和tRNA基因。日本黄姑鱼线粒体全基因组序列见SEQIDNO.41所示的核苷酸序列。该序列已登录GenBank，GenBankaccession:KT184692。

8、日本黄姑鱼线粒体基因同源性分析

在Genebank数据库中下载日本黄姑鱼近缘物种生物（日本银身[鱼或]JQ728563，厦门银身[鱼或]KM257863）线粒体基因序列，经比对，与日本银身[鱼或]和厦门银身[鱼或]有较高的同源性，但是分别存在208个和41个变异位点。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110>浙江省海洋水产研究所

<120>日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法

<130>2015.07

<160>41

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cttcaaggctgttatacgcacacc24

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccaggtcttgtttggagagttc23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

catttttcctcccaagtacg20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tggaggctgcagttgcttgt20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcgctagcctacttcttcag20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tctatggcttggaggaaagt20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cctgactagttcctgctaag20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttaggaagcgtgcggtgaat20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tctgcctttatcttcacatc20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccggccctcttagctttaac20

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tcgccctccttatccaaatttacc24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aggggatcaaaaccgcattcataa24

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gcctctctccttgcacaagt20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aaaaagagggtggcggaaag20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gccatctcccaataccaaac20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ttgttgtgaggatcgctact20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

taattcttgctgccgtcctc20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

aggctggttaagtccgatag20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

tcaaaacaacgaggcctgac20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gggtgctcccggttatgtat20

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ctccacattcctagccgtctg21

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ttcaagccgttagtcctggttaa23

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gatcaacgaaccgagttacc20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

taaggaaggcaacggctagg20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

cacccttcacagtacttgag20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

gtcaatcatgagaagactat20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

tgaggttgagccgcctgtag20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

agggcaatgggggtgaaaat20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

ggcacacggttattgaaggt20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

caatctggccaataataatg20

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

cccaagaagtttcatatcacccc23

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

tctatttcccgcttactgctaaa23

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

cccatgctagcccttacatt20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

acgtggtctgtcttggtgtc20

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

aaattatctggactgtactc20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

tgggaatcaagaataagttt20

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

ctgatgatacggccgagcag20

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

gagtagccggcggtgataag20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

ggaacaaggagctggtatca20

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

cctacgaaggcagtcatcat20

<210>41

<211>16496

<212>DNA

<213>日本黄姑鱼线粒体

<400>41

gctagcgtagcttaattaaagcataacactgaagatgttaagatgagccctagaaagctc60

cgcaggcacaaaagcttggtcctgactttactatcaactttagctatacttacacatgca120

agtatccgcacccctgtgagaatgccctaatagctccctgcccgggaacaaggagctggt180

atcaggcacaactaattgtagcccacgacaccttgctttgccacaccctcaagggaactc240

agcagtgatagacattaagccataagtgaaaacttgacttagttaaagctaagagggccg300

gttaaactcgtgccagccaccgcggttatacgagaggcccaagtcgatagtcagcggcgt360

aaagagtggttagaaggaacccgttactaaagccgaacaccctcaaagctgttatacgca420

cccgaaggtgagaagcccatccacgaaagtggctttacaaccttgaatccacgaaagcta480

tgatacaaactgggattagataccccactatgcttagccctaaacatcgacaacaacata540

cacctgttgtccgcctgggaactacgagcatcagcttgaaacccaaaggacttggcggtg600

ctttagatccacctagaggagcctgttctagaaccgataacccccgttcaacctcaccct660

tctttgtttccccccgcctatataccgccgtcgtcagcttaccctgtgaaggacttatag720

taagcaaaattggtacaaccctaaacgccaggtcgaggtgtagcgtatggaaggggaaga780

aatgggctacattctctgacacagagaaaacgaatgatgtactgaaatacacgtctgaag840

gaggatttagcagtaagcaggaagtagagtgtcccgctgaaattggccctgaagcgcgca900

cacaccgcccgtcactctccccaaactaattgaattcaattaaataaaaccccatcacag960

taaaggggaggcaagtcgtaacatggtaagtgtaccggaaggtgcacttggaaaaatcag1020

ggcatagctaagacagaaaagcatctcccttacactgagcagtcatccgtgcaaatcgga1080

ttgccctgacgcccattagctagccgcctccactaaaaacaacaaatccccatcaataac1140

ccctaagacactcaaaaacaccaaacaaaccatttttcctcccaagtacgggcgacagaa1200

aaggacccgccgcgccatagagaaagtaccgcaagggaacgctgaaagagaaatgaaaca1260

acccagtaaagcctaaaaaagcagagattttaactcgtaccttttgcatcatgatttagc1320

tagaaaacctcaagcaaagagcactttagtttgattccccgaaactacgtgagctactcc1380

aagacagcctaacaatagggcaaacccgtctctgtggcaaaagagtgggaagagctttga1440

gtagaggtgacagacctaccgaacctagttatagctggttgcctgagaaatgaatagaag1500

ttcagcctctcggattcttccctcacccttgtcttcctcccccctgacagccaaaagaag1560

ccgaaagagttagtcaaagggggtacagcccctttgacacaagatacaacttttccagga1620

gggtaaagatcacattcaaatattaaggtaaaatgttttggtgggcctaaaagcagccac1680

ccccatagaatgcgttaaagctcagacatacctatcacccccgatcctgacaatttcatc1740

ttaaccccctaaccctaccaggccgtcccatgcaagcatgggagcgaccatgctaatatg1800

agtaataagagagcattagcctctctccttgcacaagtgtaactcggaacggacccccca1860

ccgaaccttaacgaccccaaacaaagagggccctgaataacagacccgccaactagaaaa1920

atactcagcaatcaaatcgttagacccacactggtgtgccttcaaggaaagactaaaaga1980

aaaagaaggaactcggcaaacacataaagcctcgcctgtttaccaaaaacatcgcctctt2040

gcaaaattaacgaataagaggtcctgcctgccctgtgaccatgagttcaacggccgcggt2100

attttgaccgtgcaaaggtagcgcaatcacttgtcttttaaatgaagacccgtatgaatg2160

gcaagacgagggcttagctgtctcctttttcaagtcaatgaaattgatcttcccgtgcag2220

aagcgggaattcttccataagacgagaagaccctatggagcttcagacaccaagacagac2280

cacgtcaaacctccctgacaaaggactgaactaagtggactctgtcctaatgtctttggt2340

tggggcgaccacggggaaacacaaaacccccgcgtggaatgggagcacctttgctcctac2400

aactgagagcttccgctctaataaacagaatttctgaccaacaagatccggcaacgccga2460

tcaacgaaccgagttaccctagggataacagcgcaatcctcttttagagcccatatcgac2520

aagagggtttacgacctcgatgttggatcaggacatcctaatggtgcagccgctattaag2580

ggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagtaatccag2640

gtcagtttctatctatgccatgatctttcctagtacgaaaggaccgaaaagaaggggccc2700

atgctttaagtacgccccaccctcacctaatgcaatcaactaaaatagacaagagggcat2760

atccccatgcctgagaaaacggcatgttaaggtggcagagcccggcaattgcaaaagatc2820

taagccctttccacagaggttcaagtcctctccttaactatgattcacactcttataaca2880

catattattaaccccttagctttcatcgtccccgttctcctagccgttgccttccttacc2940

cttcttgaacgaaaagtgcttggctatatacaattacgaaaaggccctaatattgtgggc3000

ccctacggccttctacagcccatcgccgacggtatcaaactctttattaaagagcccgtt3060

cgcccctccacctcctccccagtcctatttatcttaacccccatgctagcccttacatta3120

gctctcacgctttgagcacccatacccctaccttaccccgtcatcgacctcaaccttggt3180

attttgtttatcttggccctttccagcctcgctgtttactcgatcctcgggtcaggctga3240

gcatccaactcaaagtacgccctcattggggccctccgagccgttgcccaaaccatctca3300

tatgaagttagcctaggactaatcctgctaagtgctatcatcttcacaggaggcttcacc3360

cttcaaaccttcaatgttgcccaagaaagcatctgactcattttcccagcctgacctctg3420

gccgctatatgatatatctcaaccctagcagaaaccaaccgagcccccttcgacctcacc3480

gagggtgagtctgagttagtctcaggctttaacgtagaatatgcaggaggtccgttcgcc3540

ctatttttcctagcagaatatgccaacatcctacttataaatacgctttccgccaccctc3600

tttttaggcgcctcccacaccccaacaattcctgaactaaccgccataaatctaataacc3660

aaggcagccctcctctccgttctcttcctatgggttcgagcctcctaccctcgattccga3720

tacgaccaacttatgcacctaatctgaaaaaatttcctcccattaacacttgccctagtc3780

atctgacacttggcacttcccattgcatttgcaggcctgccccctcagctatagccccgg3840

agttgtgcctgaaataaagggccactttgatagagtgaattatgagggttaaattccctc3900

caactccttagaaagaaggggttcgaaccctacctggagagatcaaaactctcagtgctt3960

ccactacaccactttctagtaaagtcagctaattaagcttttgggcccataccccaaaaa4020

tgttggttaaaccccttcctttactaatgaacccgtacatcttagccactttattactcg4080

gtctaggtttaggaactacaatcacattcgcaagctcccactgatttctcgcctgaatgg4140

gacttgagatcaataccctcgctattataccactaatagcccaatatcaccacccccggg4200

cagtcgaggcaaccctaaaatatttcctcacacaagcaactgcagcctccaccctactct4260

ttgcaaccacaacaaatgcttgactatgcggacaatgagatattcaacatataacacatc4320

ccctccccatcaccttgtttaccctcgccctcgccctaaaaattggcctagccccccttc4380

acatctgacttcctgaagtacttcaaggcctagatcttggcacaggactaatcttatcca4440

catggcaaaaacttgcccccttcgccctcctccttcaaatttatcccgccaactcaaccc4500

tccttattatcttgggcttaatatcaacactcatcggaggctgaggtggactcaaccaaa4560

cccaactacgaaaaatcctcgcttactcttcaattgcccaccttggctgaataattctag4620

tactacaattttctcccacccttacgctcctcacccttctcatgtacctcaccataacct4680

tctcaacattccttgtattcaaactaaacaatgcaaccaacattaatgcattagccactt4740

cctgaaccaaagcccccgcactcactgctctcacaccactcctcctcctctccctgggag4800

gcctccccccactttccggcttcatgccaaaatgattaattcttcaagaattaactaaac4860

aagacctagctttaaccgccactttggccgcactcactgcactccttagcctatactttt4920

acctgcgcctatcgtacgccatggccctgacaatgttccccaataacctcacaggcacaa4980

caccctggcgtctccaatcagcccaaattacgttcccactcgccttttcaattttggcca5040

cccttacacttctcccactcacccctaccattgtggcactattaacctcttaagagactt5100

aggatagtacaagaccaagagccttcaaagccctcagcgggagtgaaaatctcccagtcc5160

ctgttaagacttgcaggacattaacccacatcacctgtatgcaaaacagacactttaatt5220

aagctaaagccttacctagacaggcaggcctcgatcctacaaactcttagttaacagcta5280

agcgctcaaaccagcgagcatccgtctacctttcccccgcctagcagcgactaaaggcgg5340

gggaaagccccggcaggcgctagcctacttcttcagatttgcaatctgatatgttgaaca5400

cctcggggcttggtaagaagaggaattcaacctctgtctatggggctacaatccaccgct5460

taaaactcagccatcttacctatggcaatcacacgttgatttttctccactaaccacaaa5520

gacatcggcaccctttacctagtttttggtgcatgagccggaatagtaggcacagccttg5580

agcctcctaatccgagcagaactaagtcagcccggctcactcctcggagatgaccaggtt5640

tataacgtaattgttacggcgcatgccttcgttataattttctttatagtaatacccgtc5700

atgattggagggttcgggaactggcttatccccctaatgattggagcccccgacatggcc5760

ttccctcgaatgaacaatatgagcttctggcttctccccccttctttcctcttactcctg5820

acttcttcaggggtagaggcgggagccggaacagggtgaacagtttatccgcccctcgct5880

ggaaacctcgcacacgcaggtgcctccgtcgacttggccatcttttcccttcacctcgca5940

ggtgtctcgtcaattctgggggccatcaactttattacaacaattattaatataaaaccc6000

cccgccatctcccaataccaaacacctttattcgtatgggctgtcttaattacagcggtc6060

ctcctactactctcactccctgtgttagctgccggcattacaatgcttctaacagaccgg6120

aaccttaatacaactttcttcgaccccgcaggcggaggagacccaattctttaccaacac6180

ttattctgatttttcggccacccagaggtctacattctaattctcccaggatttggcatg6240

gtctcacatattgttgcttactacgctggcaaaaaagagccttttggctacatgggcatg6300

gtctgagctatgatggccattggcctcctgggttttattgtctgagcccaccacatgttc6360

acagttggaatggacgtggacacacgggcttactttacatccgctacaataattattgcc6420

atcccaaccggtgtaaaagtctttagctgactcgcaacccttcacggaggcgccctcaaa6480

tgagaggcccctcttctatgagcccttggttttattttcctctttacagtcggaggacta6540

acagggatcgtgttagccaactcctccctggatattgtccttcatgacacatactacgta6600

gtcgcccacttccactatgtcctctcaatgggagcagtattcgccattatgggcggcttt6660

gtacactgattccccctattcacagggtacacccttcacagtacttgagcaaaaactcac6720

tttgtaatcatgttcacgggggtaaacctcaccttcttcccccaacacttcctcggactc6780

gccggaatgcctcgccggtactcagactacccagatgcatacgccctgtgaaacaccgtt6840

tcttccctaggctccctaatttccctcgtagcagtagtcctgctcttattcattatctga6900

gaggctttcgctgctaaacgtgaagtgttagacgtacgccttacaaccactaacgtggaa6960

tgacttcatggctgccctcccccttaccacactttcgaagaacccccctttgtacaagtt7020

caatatagccgtacgagaaagggaggagttgaacccccataagttggtttcaagccaacc7080

acataaccgctctgccactttcttcataagacactagtaaagtaattacactgccttgtc7140

aaggcagaatcgtgggttaaacccccgcgtgtcttgcaccattaatggcacatcccgccc7200

aactaggttttcaagatgcaacttcccctcttatggaagaacttcttcattttcatgacc7260

acgctttaataattgttcttcttattagcgtgctagtactttacattattgtgtgcatga7320

ttaccactaaactatcagataaacttattcttgattcccaagaaattgaaattatctgga7380

ctgtactccctgcaattaccctaatcctgattgccctcccatctcttcgaattctctacc7440

ttatagatgagattaacgacccccacctaacaattaaagccatgggccatcaatgatact7500

ggtcctacgagtatactgactacgaagaccttggcttcgactcgtacatgctacctacac7560

aagacctcacccccggccaatttcgcctcttagaagcagaccatcgaatggtgatcccag7620

ttgaatcccctatccgagtacttatctctgctgaagacgtacttcactcatgagcagtcc7680

caactctcggtatcaaaatagacgcagtccctggccgactcaatcaaacagcctttatta7740

cagctcgccctggagtttactatgggcaatgctccgaaatctgcggggccaaccatagct7800

tcatacccatcgtagtcgaagcagtccccctaaaccactttgaggcctgaaccgccctaa7860

tgcttgaagaaacctcgctaagaagctaaatagggactagcgttagccttttaagctaaa7920

gactggtggctcccaaccaccctcagcgacatgcctcagctaaacccatccccttggctt7980

gccatcatagtcttctcatgattgacatttttaattatcattccacccaaaattatagcc8040

cacatcttcccaaatgagcccaccccccaaagcacagaaaaatccaagacagaaacctga8100

aactgaccatgactgtaagcctcttcgaccaatttatatcccccacctacctgggaatcc8160

ccctgttagcccttgctctcaccctaccttgagttctttacccctccccttccgcccgat8220

gacttaacaaccgtctactaaccctccaaggctgattcatcaaccgttttacccaacaga8280

ttctaacacctctaagtctaggcgggcacaaatgggccctaattttaacctctcttatga8340

tcttccttattacccttaatattctgggcctcctcccctataccttcacccccactacac8400

agctgtccctcaacctaggccttgcagtcccactttgactagccacagtcctcattggga8460

tgcggaaccaaccaaccgctgccctaggacatctcctgccagaaggaacacccacacccc8520

tcatccccgtcctaattattatcgagacaattagcctgttcatccgccctctggccctgg8580

gtgttcgactaaccgccaacctcacagccggtcacctcctaatacagctcacatctacag8640

ccgccttcgttcttttatcgatgatgcccacagtagcgatcctcacaacaattctcctat8700

tcttgctaacccttttagaagttgccgtagctataatccaagcctatgtatttgtattac8760

ttttaagcctttacctacaagaaaacgtctaatggcccaccaagcacacgcatatcacat8820

agtagaccccagcccctggcccctaacaggagccgtcgccgccctgctcttaacatcagg8880

tctcgcaatctgatttcacttccactccacaattcttctgtctttaggtcttatccttct8940

actcttaacaatgtaccaatgatgacgagacatcattcgagaaggcacatttcaaggaca9000

ccacacaccccccgtccaaaaaggccttcgatttggtataattctgttcattacatcaga9060

agtcttctttttcctagggttcttctgagctttttatcactcaagccttgcccccacacc9120

cgagctaggcggctgctgaccccccactggcatcaccaccttagatccattcgaagtccc9180

cctactcaatactgccgttctcctagcctccggtgtcacagttacctgagcccaccacag9240

tatcatagaaggcgagcgtaaacaagccattcactccctgacacttactattctccttgg9300

gttttattttactttcctccaagccatagaatactatgaagcccccttcaccatcgcgga9360

cggagtatatggctccacattctttgtagccacaggctttcacggacttcatgttattat9420

tggctctacattcctagccatctgcctactccgccaaattcaatatcactttacatcaga9480

acaccacttcggattcgaagcagccgcctgatactgacacttcgtagacgtcgtttgatt9540

attcctttatatctccatctactgatgaggctcataatctttctagtactaagttagtat9600

cagtgacttccaatcaccaggtcttggttaaagtccaaggaaagataatgaatttagtca9660

cagtcatctttattattgctaccttactctcaaccatcctagccaccgtgtcattctggc9720

tccctcaaatgaccccggaccacgaaaagctctccccctatgaatgtggcttcgaccccc9780

tcggcaccgctcgattgcctttttccctccgattttttcttgtcgccatcctgtttctgc9840

tatttgacctagaaattgcccttctcctgcccctgccctgaggagaccagctagcctccc9900

cccttttgaccttcctctgggccacagccgtcctagccctcctcaccctaggcctaattt9960

atgaatgacttcaaggaggcctagagtgagccgaataggtaattagtttaagaaaaacac10020

ttgatttcggctcaagagcttgtggttaaagtccacactcacctaatgacccccgttcac10080

tttgccttctcctcagccttcattctaggactaaccggcctagcattccaccgaacccac10140

cttctctccgccctattatgtctagaaggaataatactctccctatttattgccctctct10200

ctatggaccctccaactagactccactaacttctcagcctcccccatgctccttctagca10260

ttctcagcctgtgaagcgagtgcaggcctcgccctactagtcgccacctcccgaacccac10320

ggcactgaccgcctacaaagcctgaacctcctacaatgctaaaaatcctcatccccacgt10380

taatgcttgtcccgacaacctgactagttcctgctaagtgactctgacctacaacactca10440

cgcacagcctgctaattgcactagccagcctcacctgactaaaaaacctatcagagacag10500

gctgaacttttctgaatccctacatagcaacagaccccctctcaacgccccttctagttc10560

ttacttgctgacttcttcccctcataatcctcgcaagtcaaaaccacacagccctcgagc10620

ccattaaccgccaacgaatatacgtcacccttctaacatccctgcaaatcttccttatct10680

tggcctttagtgccaccgaagtaatcatgttttacgtaatattcgaagctactttaattc10740

caaccctattcctaattacccgctgaggtaaccaagcagaacgactcaacgcaggcactt10800

attttttattctacaccctggccggctcactcccactgcttgtcgcccttcttctcctcc10860

agaacaatgccgggaccctctcccttctaaccctgcaattttcaaaccccgcccaactca10920

ccaccttcgcagacaagctctgatgagcaggctgcctattagcatttctagtaaaaatac10980

cactctatggcgtccacctctgactgcccaaagcccacgttgaagccccaatcgcaggct11040

caataattcttgctgccgtcctcctaaaactcgggggctacggcataatgcgaatccttc11100

ccatactagagcccctaaccaaagaactaagttacccctttatcatcttcgcactctgag11160

gggtaatcataaccggctcaatttgtttacgccaaacagatctaaaatccctcattgcct11220

actcatctgtcggccacatgggtctcgtagtgggtgggatcctcatccaaaccccttgag11280

gttttacaggtgctctcattctcataattgcacatggcctcacctcttctgccctattct11340

gccttgccaacacaaactatgagcggacccacagccgaacaatggtccttgcccgaggcc11400

tccaaatagcactccccctaatagcaacctgatgatttatcgccagcctcgccaacctag11460

ccctccctccactccccaacctcatgggggaactaataattattacctcactattcaact11520

gatcctgatgaaccctcgccctaacaggcgccggaacccttatcaccgccggctactctc11580

tctatatgttcttaataacccaacgaggcccgcttccaatacacatcattgccctcgaac11640

cctcccactctcgagaacacctcctggtaaccctccacttactccccctgattttactaa11700

tcctcaagcccgagctaatttgaggttgagccgcctgtagatatagtttaacaaaaacat11760

tagattgtgattctaaaaacaggggttaaagtccccttgtccaccgagagaggctcgcta11820

gcaacgaagactgctaatcttcgccaccttggttgaacccctgggctcactcgagccgct11880

tctaaaggataacagctcatccgttggtcttaggaaccaaaaactcttggtgcaaatcca11940

agtagcagctatgcacactacttcactaataataacctcaagcctaactattatcttctt12000

tctcctagcctaccctgtctttacaaccctcaaccctcgccctcaaaaccccgattgagc12060

cctctcccaagttaaaacagcagtgaaactagcctttttcgtgagccttctccccctctt12120

cctgttccttaacgaaggcgcagagacaatcgtcactaactgaacctgaataaatacatt12180

aacctttgatattaatatcagctttaagttcgaccactattcaattattttcacccccat12240

tgccctctacgtcacctgatcaattctcgaatttgcatcctggtatatacactcagaccc12300

cttcataaaccgattctttaaataccttctcatcttcctaattgctataattgtccttgt12360

tacagcgaacaacatattccaacttttcatcggatgagagggcgtaggaatcatatcatt12420

cctcttaatcggctgatgatacggccgagcagacgcaaataccgcagccctccaagccgt12480

tctctacaaccgagtgggggatatcggcctaatcttcgccatggcatgaatagcaaccaa12540

tcttaactcatgagaaatacaacaaatatttgcagcagctaaaaaccaggacctcacctt12600

ccccctcctagggctcattcttgccgcaactggtaagtcagcccaatttggactccaccc12660

ttgacttccctctgccatagagggccccacaccggtctccgccctactacactccagcac12720

tatagtcgtcgccggtattttccttctcgttcgaataagccctctcttagaaaacaacca12780

aacagccctcaccctctgcctgtgcctaggcgccctaaccaccctatttactgccacctg12840

cgccctcacccaaaatgacatcaaaaaaatcgttgctttctccacatcaagccaactagg12900

cctgataatagtaactatcggacttaaccagcctcaactcgccttcctccacatttgcac12960

ccacgctttctttaaagcaatactcttcctctgctcgggctcaatcatccacagtcttaa13020

tgatgaacaggacatccgaaaaatggggggcatgcaccacctcacaccctttacctcctc13080

ctgccttactattggaagccttgccctcacaggcacccccttcttagcgggcttcttctc13140

aaaagacgctattattgaagcactaaacacatcccatctcaacgcctgagccctcgccct13200

cacactccttgccacctcctttacagccatctacagcctccgagtcattttctttgtatc13260

catgggccacccccgatttaatacactttcccctattaatgaaaacaactcagcagtcat13320

taaccccatcaaacgcctagcctgaggaagcattctcgccggccttttaattacctccaa13380

catgacccccctaaaaacaccaatcataaccatgcccccactcctaaaactagccgccct13440

caccgtcaccatcctgggccttcttttagcactagaacttgcctccctgacaaataagca13500

atttaaacccaccccaaaactaacccctcaccacttctccaacatgcttggcttttttcc13560

agccattattcaccgcacgcttcctaaacttaacctgaccctcggccaaacaattgccag13620

ccagatggtcgacttaacatgactagaaaaaacaggccccaaagccctagcctccctcaa13680

catacccctgatcacaacaacaagcaactcccaacaaggcataatcaaaacgtaccttac13740

cttctttctactaacactagccctcgccaccctagtatttatcctttaaaccgcccgaag13800

ggccccccgacttaaaccccgggttagctcgagcaccacaaataaagtcaaaagcagcac13860

ccaagcactaattactaacattcccccaccccccgcatacattaatgcaacaccccccga13920

atccccccgtaatgtagataactccccaaactcatccacaggtacccaagaagtctcata13980

tcacccccctcaaaaaagacctgaaaccatggctacccctacaacataagcaagaatata14040

caccacaacaggacgactccctcaactctccggataaggctccgcagcaagagctgccga14100

gtacgcaaacactaccaacattccccccaagtaaatcaaaaacaagatcaaagataaaaa14160

atgacccccgtgccccaccaaaacaccacaccccaggcccgccaccacaaccaagcccaa14220

agcagcaaaataaggcgaggggtttgaagcaaccgcaaccagccctaaaactaacccaaa14280

taaaaataaagacataatataagtcataatttctgccaggactctaaccaggactaatgg14340

cttgaaaaaccaccgttgttattcaactacaaaaaccttaatggcaagcctacgcaaaac14400

ccaccccctcctaaaaatcgcaaacgacgcactagtggacctccccgccccatccaacat14460

ctcagcctgatgaaactttggctccctgctcggcctttgcttagccgcccaaattctcac14520

aggactcttccttgctatacattatacatccgacatctccatggccttctcatccgtcgc14580

acacatttgccgagatgttaactacggatggctcatccgaaacctccacgccaacggcgc14640

ctctttcttctttatctgcctttatcttcacatcggccgaggcctctactatggctctta14700

tctttataaagagacatgaaacattggagtcgtactcttccttttagtaatgatgactgc14760

cttcgtaggctacgtcctcccctgaggccaaatgtctttttgaggggccactgtcatcac14820

aaacctcctatccgccgtaccctatgtaggcaacacattagttcaatgaatctggggcgg14880

cttttcagtagacaatgccaccctcacccgattcttcgccttccactttctcctgccctt14940

cattgtcgcagccgcaacccttctccacctactcttcctgcacgagacaggctcaaacaa15000

tccgcttggcctaaactctgacgcagacaaaatcccgttccacccctatttcacctacaa15060

agacctcctgggctttgcaatcctaattatctcccttaccgctctggccctcttctcccc15120

caatctcctgggcgaccccgacaatttcacccccgccaacccgctcgtcactcctcctca15180

cattaaaccagagtggtatttcctatttgcctacgccatcctccgctcaatccccaacaa15240

actgggaggggtccttgctcttcttgcctccatccttgttctaatagtagtccccatcct15300

tcacacatcaaaacaacgaggcctgacgttccggcccgtcacccaattccttttctgaac15360

cctcattgcagacgtcctcatcctaacatgaattggcggtatacctgtagaacacccttt15420

cattattattggccagattgcatccctcctgtacttctccctattcctgattttcctccc15480

attagcaggttgactagagaacaaagttcttgaatgacgctgcactagtagctcagtttc15540

agagcgtagcaccggtcttgtaaaccggatgtcgggggttaaattcccccctactgctat15600

atcaaaaaggagggaatttaacccccaccactaattcccaaaactagtattctaaactaa15660

actactttttgtacatatatgtatatacaccatacaattatatcaaccagatcaatagta15720

attcaatacatacatgttttatcaacattctctggtttatcacattcacacggtactatt15780

aacagttcccgtacataaaccatttaatactaacattcaacagtcatatatataatgact15840

ggcgaaatttaagatctaacagaacaactcataagtttagatataccacgaactcaacat15900

tctattatcccccaaaagcttaatgtaataagaaccgaccatcagttgatttcttaaggc15960

acacggttattgaaggtgagggacaaatatcgtgggggtttcacaatatgaattattcct16020

ggcatttggttcctacttcagggccatataattggtatcactccccacactttcatcgac16080

gcttgcataagttaatggtggtaatacataaccgggagcaccccccatgccgagcgttct16140

ttctagagggtcactggtattttttttctcttttccttttcactttgcatttcagagtgc16200

ccgcggaagtaaaataataaggttgaacatttcctctgaatacaagtaaaatatgttaaa16260

tgataaaagtcattacttaagacttgcatataacaatatcaagtgcataaactgtgactt16320

attacctggaagatatctaagtgtgccccctgggtttctgcgcgtaaacccccctacccc16380

ccagcactcctgagatcattaacattcctgtaaacccccccggaaacaggaaaatcccta16440

gcagtgtattttttagcccaaagtgtatctatttacattattaaaataatgcacac16496

Claims

1.一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，其特征在于，包括20对引物对，具体序列信息如下所示：

（1）第1对上游引物为：SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；

（2）第2对上游引物为：SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；

（3）第3对上游引物为：SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.6所示的核苷酸序列；

（4）第4对上游引物为：SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；

（5）第5对上游引物为：SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.10所示的核苷酸序列；

（6）第6对上游引物为：SEQIDNO.11所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.12所示的核苷酸序列；

（7）第7对上游引物为：SEQIDNO.13所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.14所示的核苷酸序列；

（8）第8对上游引物为：SEQIDNO.15所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.16所示的核苷酸序列；

（9）第9对上游引物为：SEQIDNO.17所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.18所示的核苷酸序列；

（10）第10对上游引物为：SEQIDNO.19所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.20所示的核苷酸序列；

（11）第11对上游引物为：SEQIDNO.21所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.22所示的核苷酸序列；

（12）第12对上游引物为：SEQIDNO.23所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.24所示的核苷酸序列；

（13）第13对上游引物为：SEQIDNO.25所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.26所示的核苷酸序列；

（14）第14对上游引物为：SEQIDNO.27所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.28所示的核苷酸序列；

（15）第15对上游引物为：SEQIDNO.29所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.30所示的核苷酸序列；

（16）第16对上游引物为：SEQIDNO.31所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.32所示的核苷酸序列；

（17）第17对上游引物为：SEQIDNO.33所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.34所示的核苷酸序列；

（18）第18对上游引物为：SEQIDNO.35所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.36所示的核苷酸序列；

（19）第19对上游引物为：SEQIDNO.37所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.38所示的核苷酸序列；

（20）第20对上游引物为：SEQIDNO.39所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.40所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法，其特征在于：以提取的日本黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用4对扩增引物进行4个大片段产物扩增，然后通过基因组步移的方法，使用剩余的16对扩增引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测后送生物公司测序。

3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于：4对扩增引物为第1对，第6对，第11对和第16对。

4.如权利要求1所述的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物扩增获得的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，其特征在于：日本黄姑鱼线粒体全基因组序列见SEQIDNO.41所示的核苷酸序列。