CN105154526B - 日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法，通过20对特异性引物对日本黄姑鱼基因组进行PCR扩增获得日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为日本黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

Description

日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法。

背景技术

日本黄姑鱼（Nibea japonic）俗称黑毛鲿，鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)，黄姑鱼属(Nibea) （朱元鼎，1963；成庆泰1987），为一种大型优质食用鱼类，主要分布于中国东海、南海及日本南部沿海。

日本黄姑鱼为大型食用鱼类，最大的个体可以达到1.5米以上，能适应不良环境和抵御疾病能力强，易于养殖，饵料系数低，生长迅速，是重要的海水养殖品种，也是增殖放流的主要对象之一。由于其较高的经济价值，日本黄姑鱼承受的捕捞压力一直有增无减。近年来，由于东海区资源量下降，对日本黄姑鱼的资源增殖工作引起人们的重视。线粒体基因组是生物重要的遗传物质，其中后生动物线粒体DNA为典型的环状双链分子结构,长度大多在14-18kb之间,编码37个基因，包括13个蛋白质基因、22个tRNA以及12S rRNA和16S rRNA（Wolstenholme DR，1992，）。线粒体DNA是核外遗传物质,具有分子量小、结构简单、母系遗传等特点,成为生物多样性、群体遗传学与系统进化研究中的重要分子标记（Miya M andTakeshima H，2003；Lavou S and Miya M，2007）。目前，线粒体基因已作为种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，并且线粒体ND2、16SrRNA与Cyt b基因、D-loop序列已被应用于水产动物中贝类(苏天凤2007；汪桂玲2009)、甲壳类(王成辉，2008)、鱼类(李林，2011；蒋宗良，2011)物种遗传多样性及系统发育关系分析。迄今为止还没有对日本黄姑鱼的线粒体基因组序列、遗传和种质资源鉴定与保护相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，通过20对特异性引物对日本黄姑鱼基因组进行PCR扩增获得日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为日本黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，包括20对引物对，具体序列信息如下所示：

（1）第1对上游引物为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列（5'-CTTCAAGGCTGTTATACGCACACC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列（5'- GCCAGGTCTTGTTTGGAGAGTTC-3'）；

（2）第2对上游引物为：SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列（5'-CATTTTTCCTCCCAAGTACG-3'），下游引物为：SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列（5'-TGGAGGCTGCAGTTGCTTGT-3'）；

（3）第3对上游引物为：SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列（5'-GCGCTAGCCTACTTCTTCAG-3'），下游引物为：SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列（5'-TCTATGGCTTGGAGGAAAGT-3'）；

（4）第4对上游引物为：SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列（5'-CCTGACTAGTTCCTGCTAAG-3'），下游引物为：SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列（5'-TTAGGAAGCGTGCGGTGAAT-3'）；

（5）第5对上游引物为：SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列（5'-TCTGCCTTTATCTTCACATC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列(5'-CCGGCCCTCTTAGCTTTAAC-3')；

（6）第6对上游引物为：SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列（5'-TCGCCCTCCTTATCCAAATTTACC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列（5'- AGGGGATCAAAACCGCATTCATAA -3'）；

（7）第7对上游引物为：SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列（5'-GCCTCTCTCCTTGCACAAGT-3'），下游引物为：SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列（5'-AAAAAGAGGGTGGCGGAAAG-3'）；

（8）第8对上游引物为：SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列（5'-GCCATCTCCCAATACCAAAC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列（5'-TTGTTGTGAGGATCGCTACT-3'）；

（9）第9对上游引物为：SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列（5'-TAATTCTTGCTGCCGTCCTC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列（5'-AGGCTGGTTAAGTCCGATAG-3'）；

（10）第10对上游引物为：SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列（5'-TCAAAACAACGAGGCCTGAC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列（5'-GGGTGCTCCCGGTTATGTAT-3'）；

（11）第11对上游引物为：SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列（5'-CTCCACATTCCTAGCCGTCTG-3'），下游引物为：SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列（5'- TTCAAGCCGTTAGTCCTGGTTAA-3'）；

（12）第12对上游引物为：SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列（5'-GATCAACGAACCGAGTTACC-3'），下游引物为： SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列（5'-TAAGGAAGGCAACGGCTAGG-3'）；

（13）第13对上游引物为：SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列（5'-CACCCTTCACAGTACTTGAG-3'），下游引物为：SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列（5'-GTCAATCATGAGAAGACTAT-3'）；

（14）第14对上游引物为：SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列（5'-TGAGGTTGAGCCGCCTGTAG-3'），下游引物为： SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列（5'-AGGGCAATGGGGGTGAAAAT-3'）；

（15）第15对上游引物为：SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列（5'-GGCACACGGTTATTGAAGGT-3'），下游引物为： SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列（5'-CAATCTGGCCAATAATAATG-3'）；

（16）第16对上游引物为：SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列（5'-CCCAAGAAGTTTCATATCACCCC-3'），下游引物为：SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列（5'- TCTATTTCCCGCTTACTGCTAAA -3'）；

（17）第17对上游引物为：SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列（5'-CCCATGCTAGCCCTTACATT-3'），下游引物为： SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列（5'-ACGTGGTCTGTCTTGGTGTC-3'）；

（18）第18对上游引物为：SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列（5'-AAATTATCTGGACTGTACTC-3'），下游引物为： SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列（5'-TGGGAATCAAGAATAAGTTT-3'）；

（19）第19对上游引物为：SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列（5'-CTGATGATACGGCCGAGCAG-3'），下游引物为： SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列（5'-GAGTAGCCGGCGGTGATAAG-3'）；

（20）第20对上游引物为：SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列（5'-GGAACAAGGAGCTGGTATCA-3'），下游引物为： SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列（5'-CCTACGAAGGCAGTCATCAT-3'）。

日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法，以提取的日本黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用4对扩增引物进行4个大片段产物扩增，然后通过基因组步移的方法，使用剩余的16对扩增引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测后送生物公司测序。

作为优选，4对扩增引物为第1对，第6对，第11对和第16对。

日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物扩增获得的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，日本黄姑鱼线粒体全基因组序列见SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果是：

1、本发明针对鲈形目石首鱼科的日本黄姑鱼设计了20对特异性引物可以对日本黄姑鱼

线粒体DNA进行PCR扩增，并获得线粒体全长基因。

2、本发明首次获得日本黄姑鱼线粒体基因组全长序列，经分析得出：序列全长16496 bp，包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因。

3、本发明的20对特异性引物可以对不同群体的日本黄姑鱼基因组DNA进行PCR扩增。

4、获得的日本黄姑鱼线粒体全基因组序列，可为日本黄姑鱼的保护遗传学、进化遗传学及优良养殖品种的分子标记辅助选择提供物质基础。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

以提取的日本黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用4对特异引物（第1，6，11和16对）进行4个大片段产物扩增，然后基因组步移的方法，使用本发明中的（2-5，7-10，12-15，17-20）引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测后送生物公司测序，对测序结果使用生物软件对测序结果进行拼接，具体步骤如下：

1、5×TBE Buffer配制

称量氨基丁三醇54g，Na₂EDTA·2H₂O 3.72g，硼酸27.5g于1L烧杯中；加入约800ml去离子水，搅拌均匀；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存备用。

2、DNA提取

采用高盐法提取日本黄姑鱼DNA，步骤如下：

（1）取日本黄姑鱼（由浙江省海洋水产研究所试验场提供）背部肌肉组织50mg放入装有360μL 高盐抽提缓冲液（0.4M NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA pH 8.0.Aljanabi SM, Martinez I (1997) Universal and rapid salt-extraction of highquality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Res 25:4692–4693）的离心管中，用灭菌的眼科剪刀快速剪碎，然后分别加入40μL 20% SDS，10μl ProteinaseK(20mg/ml)溶液，温和颠倒混匀，在56℃放置1h或过夜，直至组织完全溶解。

（2）加入300μL 6M NaCl涡旋30s，在12000rpm 4℃ 高速离心30min，将上清移入新的离心管中。

（3）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），温和颠倒混匀5 min，常温下12000rpm离心10 min，将上清移入新的离心管中。

（4）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），温和颠倒混匀5 min，常温下12000rpm离心10 min，将上清移入新的离心管中。

（5）加入2/3体积预冷的异丙醇，温和颠倒混匀，待出现白色线状沉淀，在12000rpm，4℃离心 15 min，弃上清。

（6）向管中加入800 μL预冷的75%乙醇，上下颠倒5 min，在12000rpm，4℃离心 15min，弃上清。

（7）重复操作步骤6。

（8）将提取的DNA白色沉淀置于通风柜中干燥20 min，加入50~100μL 灭菌水或者Tris-EDTA buffer(TE，10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

3、琼脂糖凝胶电泳检测

称量取5g琼脂糖粉加入含50 mL 1×TBE缓冲液的锥形瓶，微波炉内反复加热3次至琼脂粉溶解并无气泡，冷至70℃左右加3μL溴化乙锭（EB）核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。30 min后，琼脂糖凝胶成形，轻轻拔掉梳子。电泳槽内加1×TBE缓冲液，在点样孔内依次加入日本黄姑鱼DNA提取样品5μL和DNA/Hind III标准分子量标记（或者DL2000 marker） 5μl，电泳电压设为5V/cm，电泳30min后在凝胶成像仪中检测。

4、引物设计

参考黄姑鱼（Nibea albiflora，GenBank: HQ890947.1）、美国红鱼（Sciaenops ocellatus，GenBank: JQ286004.1）、鮸鱼（Miichthys miiuy，GenBank: HM447240.1）线粒体基因组全序列排列顺序，用生物软件DNAMAN分析上述参考鱼类线粒体基因保守区，用生物软件Oligo 6在基因保守区内设计4对引物，引物由上海生工生物公司合成，其余16对引物为基因组步移扩增所用。

5、PCR扩增

采用大连宝生物工程有限公司Prime STAR HS DNA Polymerase（R010Q）扩增目的基因，反应体系：2μL日本黄姑鱼DNA模板，2.5μL10×Buffer（含Mg²⁺）,4μL dNTP (2.5 mmol/L)，1μL正向引物（即上游引物，10μmol/L）、1μL反向引物（即下游引物10μmol/L）、0.2μL HSTaq DNA聚合酶(5 U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐。PCR扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，55~58℃退火30s，72℃延伸5min(根据扩增产物的长度)，共35个循环；最72℃延伸10min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测（同第3步）目的条带。4对引物分别获得4.5kb，5.3kb，4.9kb和3.4kb的目的片段。

第1对引物，第6对引物，第11对引物和第16对引物分别采用上述扩增反应体系进行PCR扩增，获得4个扩增片段。第1对引物扩增获得4.5kb的目的片段，第6对引物扩增获得5.3kb的目的片段，第11对引物扩增获得4.9kb的目的片段，第16对引物扩增获得3.4kb的目的片段。

6、基因组步移

采用大连宝生物工程有限公司TaKaRa Ex Taq（RR53A）扩增目的基因（即步骤5扩增获得的4.5kb，5.3kb，4.9kb和3.4kb的目的片段），分别以扩增的4个大片段作为模板，其中4.5kb产物使用第2~5对引物进行扩增；5.3kb产物使用第7~10对引物，4.9kb产物使用第12~15对引物，3.4kb产物使用第17~20对引物。反应体系：2μL DNA模板，5.0 μL10×Buffer（含Mg²⁺），8μL dNTP (2.5 mmol/L)，2μL正向引物（10μmol/L）、2μL反向引物（10μmol/L）、0.25μL Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，其余用灭菌双蒸水补齐50μL。PCR扩增条件为：95℃预变性3 min；94℃变性30s，50~54℃退火30s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；最72℃延伸10min。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳检测（同第3步）目的条带。

7、PCR扩增产物测序及序列拼接和序列信息分析

将有目的条带的PCR产物直接送上海杰李生物公司测序。将送检测序结果用生物软件ContigExpress进行拼接，结果和序列碱基质量通过ContigExpress软件检查，手工去除错误拼接。序列拼接结果用软件DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/)、tRNAscan-SE1.21和在线BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对识别蛋白质编码基因、rRNA基因和tRNA基因。日本黄姑鱼线粒体全基因组序列见SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列。该序列已登录GenBank，GenBankaccession: KT184692。

8、日本黄姑鱼线粒体基因同源性分析

在Genebank数据库中下载日本黄姑鱼近缘物种生物（日本银身[鱼或] JQ728563，厦门银身[鱼或] KM257863）线粒体基因序列，经比对，与日本银身[鱼或]和厦门银身[鱼或]有较高的同源性，但是分别存在208个和41个变异位点。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110> 浙江省海洋水产研究所

<120> 日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其扩增方法

<130> 2015.07

<160> 41

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttcaaggct gttatacgca cacc 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccaggtctt gtttggagag ttc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catttttcct cccaagtacg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggaggctgc agttgcttgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgctagcct acttcttcag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctatggctt ggaggaaagt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgactagt tcctgctaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaggaagcg tgcggtgaat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctgccttta tcttcacatc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccggccctct tagctttaac 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcgccctcct tatccaaatt tacc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aggggatcaa aaccgcattc ataa 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcctctctcc ttgcacaagt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaaaagaggg tggcggaaag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccatctccc aataccaaac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttgttgtgag gatcgctact 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

taattcttgc tgccgtcctc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aggctggtta agtccgatag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcaaaacaac gaggcctgac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggtgctccc ggttatgtat 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctccacattc ctagccgtct g 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttcaagccgt tagtcctggt taa 23

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gatcaacgaa ccgagttacc 20

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

taaggaaggc aacggctagg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cacccttcac agtacttgag 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtcaatcatg agaagactat 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgaggttgag ccgcctgtag 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agggcaatgg gggtgaaaat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ggcacacggt tattgaaggt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

caatctggcc aataataatg 20

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cccaagaagt ttcatatcac ccc 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tctatttccc gcttactgct aaa 23

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cccatgctag cccttacatt 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

acgtggtctg tcttggtgtc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaattatctg gactgtactc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tgggaatcaa gaataagttt 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ctgatgatac ggccgagcag 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gagtagccgg cggtgataag 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggaacaagga gctggtatca 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cctacgaagg cagtcatcat 20

<210> 41

<211> 16496

<212> DNA

<213> 日本黄姑鱼线粒体

<400> 41

gctagcgtag cttaattaaa gcataacact gaagatgtta agatgagccc tagaaagctc 60

cgcaggcaca aaagcttggt cctgacttta ctatcaactt tagctatact tacacatgca 120

agtatccgca cccctgtgag aatgccctaa tagctccctg cccgggaaca aggagctggt 180

atcaggcaca actaattgta gcccacgaca ccttgctttg ccacaccctc aagggaactc 240

agcagtgata gacattaagc cataagtgaa aacttgactt agttaaagct aagagggccg 300

gttaaactcg tgccagccac cgcggttata cgagaggccc aagtcgatag tcagcggcgt 360

aaagagtggt tagaaggaac ccgttactaa agccgaacac cctcaaagct gttatacgca 420

cccgaaggtg agaagcccat ccacgaaagt ggctttacaa ccttgaatcc acgaaagcta 480

tgatacaaac tgggattaga taccccacta tgcttagccc taaacatcga caacaacata 540

cacctgttgt ccgcctggga actacgagca tcagcttgaa acccaaagga cttggcggtg 600

ctttagatcc acctagagga gcctgttcta gaaccgataa cccccgttca acctcaccct 660

tctttgtttc cccccgccta tataccgccg tcgtcagctt accctgtgaa ggacttatag 720

taagcaaaat tggtacaacc ctaaacgcca ggtcgaggtg tagcgtatgg aaggggaaga 780

aatgggctac attctctgac acagagaaaa cgaatgatgt actgaaatac acgtctgaag 840

gaggatttag cagtaagcag gaagtagagt gtcccgctga aattggccct gaagcgcgca 900

cacaccgccc gtcactctcc ccaaactaat tgaattcaat taaataaaac cccatcacag 960

taaaggggag gcaagtcgta acatggtaag tgtaccggaa ggtgcacttg gaaaaatcag 1020

ggcatagcta agacagaaaa gcatctccct tacactgagc agtcatccgt gcaaatcgga 1080

ttgccctgac gcccattagc tagccgcctc cactaaaaac aacaaatccc catcaataac 1140

ccctaagaca ctcaaaaaca ccaaacaaac catttttcct cccaagtacg ggcgacagaa 1200

aaggacccgc cgcgccatag agaaagtacc gcaagggaac gctgaaagag aaatgaaaca 1260

acccagtaaa gcctaaaaaa gcagagattt taactcgtac cttttgcatc atgatttagc 1320

tagaaaacct caagcaaaga gcactttagt ttgattcccc gaaactacgt gagctactcc 1380

aagacagcct aacaataggg caaacccgtc tctgtggcaa aagagtggga agagctttga 1440

gtagaggtga cagacctacc gaacctagtt atagctggtt gcctgagaaa tgaatagaag 1500

ttcagcctct cggattcttc cctcaccctt gtcttcctcc cccctgacag ccaaaagaag 1560

ccgaaagagt tagtcaaagg gggtacagcc cctttgacac aagatacaac ttttccagga 1620

gggtaaagat cacattcaaa tattaaggta aaatgttttg gtgggcctaa aagcagccac 1680

ccccatagaa tgcgttaaag ctcagacata cctatcaccc ccgatcctga caatttcatc 1740

ttaaccccct aaccctacca ggccgtccca tgcaagcatg ggagcgacca tgctaatatg 1800

agtaataaga gagcattagc ctctctcctt gcacaagtgt aactcggaac ggacccccca 1860

ccgaacctta acgaccccaa acaaagaggg ccctgaataa cagacccgcc aactagaaaa 1920

atactcagca atcaaatcgt tagacccaca ctggtgtgcc ttcaaggaaa gactaaaaga 1980

aaaagaagga actcggcaaa cacataaagc ctcgcctgtt taccaaaaac atcgcctctt 2040

gcaaaattaa cgaataagag gtcctgcctg ccctgtgacc atgagttcaa cggccgcggt 2100

attttgaccg tgcaaaggta gcgcaatcac ttgtctttta aatgaagacc cgtatgaatg 2160

gcaagacgag ggcttagctg tctccttttt caagtcaatg aaattgatct tcccgtgcag 2220

aagcgggaat tcttccataa gacgagaaga ccctatggag cttcagacac caagacagac 2280

cacgtcaaac ctccctgaca aaggactgaa ctaagtggac tctgtcctaa tgtctttggt 2340

tggggcgacc acggggaaac acaaaacccc cgcgtggaat gggagcacct ttgctcctac 2400

aactgagagc ttccgctcta ataaacagaa tttctgacca acaagatccg gcaacgccga 2460

tcaacgaacc gagttaccct agggataaca gcgcaatcct cttttagagc ccatatcgac 2520

aagagggttt acgacctcga tgttggatca ggacatccta atggtgcagc cgctattaag 2580

ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag 2640

gtcagtttct atctatgcca tgatctttcc tagtacgaaa ggaccgaaaa gaaggggccc 2700

atgctttaag tacgccccac cctcacctaa tgcaatcaac taaaatagac aagagggcat 2760

atccccatgc ctgagaaaac ggcatgttaa ggtggcagag cccggcaatt gcaaaagatc 2820

taagcccttt ccacagaggt tcaagtcctc tccttaacta tgattcacac tcttataaca 2880

catattatta accccttagc tttcatcgtc cccgttctcc tagccgttgc cttccttacc 2940

cttcttgaac gaaaagtgct tggctatata caattacgaa aaggccctaa tattgtgggc 3000

ccctacggcc ttctacagcc catcgccgac ggtatcaaac tctttattaa agagcccgtt 3060

cgcccctcca cctcctcccc agtcctattt atcttaaccc ccatgctagc ccttacatta 3120

gctctcacgc tttgagcacc cataccccta ccttaccccg tcatcgacct caaccttggt 3180

attttgttta tcttggccct ttccagcctc gctgtttact cgatcctcgg gtcaggctga 3240

gcatccaact caaagtacgc cctcattggg gccctccgag ccgttgccca aaccatctca 3300

tatgaagtta gcctaggact aatcctgcta agtgctatca tcttcacagg aggcttcacc 3360

cttcaaacct tcaatgttgc ccaagaaagc atctgactca ttttcccagc ctgacctctg 3420

gccgctatat gatatatctc aaccctagca gaaaccaacc gagccccctt cgacctcacc 3480

gagggtgagt ctgagttagt ctcaggcttt aacgtagaat atgcaggagg tccgttcgcc 3540

ctatttttcc tagcagaata tgccaacatc ctacttataa atacgctttc cgccaccctc 3600

tttttaggcg cctcccacac cccaacaatt cctgaactaa ccgccataaa tctaataacc 3660

aaggcagccc tcctctccgt tctcttccta tgggttcgag cctcctaccc tcgattccga 3720

tacgaccaac ttatgcacct aatctgaaaa aatttcctcc cattaacact tgccctagtc 3780

atctgacact tggcacttcc cattgcattt gcaggcctgc cccctcagct atagccccgg 3840

agttgtgcct gaaataaagg gccactttga tagagtgaat tatgagggtt aaattccctc 3900

caactcctta gaaagaaggg gttcgaaccc tacctggaga gatcaaaact ctcagtgctt 3960

ccactacacc actttctagt aaagtcagct aattaagctt ttgggcccat accccaaaaa 4020

tgttggttaa accccttcct ttactaatga acccgtacat cttagccact ttattactcg 4080

gtctaggttt aggaactaca atcacattcg caagctccca ctgatttctc gcctgaatgg 4140

gacttgagat caataccctc gctattatac cactaatagc ccaatatcac cacccccggg 4200

cagtcgaggc aaccctaaaa tatttcctca cacaagcaac tgcagcctcc accctactct 4260

ttgcaaccac aacaaatgct tgactatgcg gacaatgaga tattcaacat ataacacatc 4320

ccctccccat caccttgttt accctcgccc tcgccctaaa aattggccta gccccccttc 4380

acatctgact tcctgaagta cttcaaggcc tagatcttgg cacaggacta atcttatcca 4440

catggcaaaa acttgccccc ttcgccctcc tccttcaaat ttatcccgcc aactcaaccc 4500

tccttattat cttgggctta atatcaacac tcatcggagg ctgaggtgga ctcaaccaaa 4560

cccaactacg aaaaatcctc gcttactctt caattgccca ccttggctga ataattctag 4620

tactacaatt ttctcccacc cttacgctcc tcacccttct catgtacctc accataacct 4680

tctcaacatt ccttgtattc aaactaaaca atgcaaccaa cattaatgca ttagccactt 4740

cctgaaccaa agcccccgca ctcactgctc tcacaccact cctcctcctc tccctgggag 4800

gcctcccccc actttccggc ttcatgccaa aatgattaat tcttcaagaa ttaactaaac 4860

aagacctagc tttaaccgcc actttggccg cactcactgc actccttagc ctatactttt 4920

acctgcgcct atcgtacgcc atggccctga caatgttccc caataacctc acaggcacaa 4980

caccctggcg tctccaatca gcccaaatta cgttcccact cgccttttca attttggcca 5040

cccttacact tctcccactc acccctacca ttgtggcact attaacctct taagagactt 5100

aggatagtac aagaccaaga gccttcaaag ccctcagcgg gagtgaaaat ctcccagtcc 5160

ctgttaagac ttgcaggaca ttaacccaca tcacctgtat gcaaaacaga cactttaatt 5220

aagctaaagc cttacctaga caggcaggcc tcgatcctac aaactcttag ttaacagcta 5280

agcgctcaaa ccagcgagca tccgtctacc tttcccccgc ctagcagcga ctaaaggcgg 5340

gggaaagccc cggcaggcgc tagcctactt cttcagattt gcaatctgat atgttgaaca 5400

cctcggggct tggtaagaag aggaattcaa cctctgtcta tggggctaca atccaccgct 5460

taaaactcag ccatcttacc tatggcaatc acacgttgat ttttctccac taaccacaaa 5520

gacatcggca ccctttacct agtttttggt gcatgagccg gaatagtagg cacagccttg 5580

agcctcctaa tccgagcaga actaagtcag cccggctcac tcctcggaga tgaccaggtt 5640

tataacgtaa ttgttacggc gcatgccttc gttataattt tctttatagt aatacccgtc 5700

atgattggag ggttcgggaa ctggcttatc cccctaatga ttggagcccc cgacatggcc 5760

ttccctcgaa tgaacaatat gagcttctgg cttctccccc cttctttcct cttactcctg 5820

acttcttcag gggtagaggc gggagccgga acagggtgaa cagtttatcc gcccctcgct 5880

ggaaacctcg cacacgcagg tgcctccgtc gacttggcca tcttttccct tcacctcgca 5940

ggtgtctcgt caattctggg ggccatcaac tttattacaa caattattaa tataaaaccc 6000

cccgccatct cccaatacca aacaccttta ttcgtatggg ctgtcttaat tacagcggtc 6060

ctcctactac tctcactccc tgtgttagct gccggcatta caatgcttct aacagaccgg 6120

aaccttaata caactttctt cgaccccgca ggcggaggag acccaattct ttaccaacac 6180

ttattctgat ttttcggcca cccagaggtc tacattctaa ttctcccagg atttggcatg 6240

gtctcacata ttgttgctta ctacgctggc aaaaaagagc cttttggcta catgggcatg 6300

gtctgagcta tgatggccat tggcctcctg ggttttattg tctgagccca ccacatgttc 6360

acagttggaa tggacgtgga cacacgggct tactttacat ccgctacaat aattattgcc 6420

atcccaaccg gtgtaaaagt ctttagctga ctcgcaaccc ttcacggagg cgccctcaaa 6480

tgagaggccc ctcttctatg agcccttggt tttattttcc tctttacagt cggaggacta 6540

acagggatcg tgttagccaa ctcctccctg gatattgtcc ttcatgacac atactacgta 6600

gtcgcccact tccactatgt cctctcaatg ggagcagtat tcgccattat gggcggcttt 6660

gtacactgat tccccctatt cacagggtac acccttcaca gtacttgagc aaaaactcac 6720

tttgtaatca tgttcacggg ggtaaacctc accttcttcc cccaacactt cctcggactc 6780

gccggaatgc ctcgccggta ctcagactac ccagatgcat acgccctgtg aaacaccgtt 6840

tcttccctag gctccctaat ttccctcgta gcagtagtcc tgctcttatt cattatctga 6900

gaggctttcg ctgctaaacg tgaagtgtta gacgtacgcc ttacaaccac taacgtggaa 6960

tgacttcatg gctgccctcc cccttaccac actttcgaag aacccccctt tgtacaagtt 7020

caatatagcc gtacgagaaa gggaggagtt gaacccccat aagttggttt caagccaacc 7080

acataaccgc tctgccactt tcttcataag acactagtaa agtaattaca ctgccttgtc 7140

aaggcagaat cgtgggttaa acccccgcgt gtcttgcacc attaatggca catcccgccc 7200

aactaggttt tcaagatgca acttcccctc ttatggaaga acttcttcat tttcatgacc 7260

acgctttaat aattgttctt cttattagcg tgctagtact ttacattatt gtgtgcatga 7320

ttaccactaa actatcagat aaacttattc ttgattccca agaaattgaa attatctgga 7380

ctgtactccc tgcaattacc ctaatcctga ttgccctccc atctcttcga attctctacc 7440

ttatagatga gattaacgac ccccacctaa caattaaagc catgggccat caatgatact 7500

ggtcctacga gtatactgac tacgaagacc ttggcttcga ctcgtacatg ctacctacac 7560

aagacctcac ccccggccaa tttcgcctct tagaagcaga ccatcgaatg gtgatcccag 7620

ttgaatcccc tatccgagta cttatctctg ctgaagacgt acttcactca tgagcagtcc 7680

caactctcgg tatcaaaata gacgcagtcc ctggccgact caatcaaaca gcctttatta 7740

cagctcgccc tggagtttac tatgggcaat gctccgaaat ctgcggggcc aaccatagct 7800

tcatacccat cgtagtcgaa gcagtccccc taaaccactt tgaggcctga accgccctaa 7860

tgcttgaaga aacctcgcta agaagctaaa tagggactag cgttagcctt ttaagctaaa 7920

gactggtggc tcccaaccac cctcagcgac atgcctcagc taaacccatc cccttggctt 7980

gccatcatag tcttctcatg attgacattt ttaattatca ttccacccaa aattatagcc 8040

cacatcttcc caaatgagcc caccccccaa agcacagaaa aatccaagac agaaacctga 8100

aactgaccat gactgtaagc ctcttcgacc aatttatatc ccccacctac ctgggaatcc 8160

ccctgttagc ccttgctctc accctacctt gagttcttta cccctcccct tccgcccgat 8220

gacttaacaa ccgtctacta accctccaag gctgattcat caaccgtttt acccaacaga 8280

ttctaacacc tctaagtcta ggcgggcaca aatgggccct aattttaacc tctcttatga 8340

tcttccttat tacccttaat attctgggcc tcctccccta taccttcacc cccactacac 8400

agctgtccct caacctaggc cttgcagtcc cactttgact agccacagtc ctcattggga 8460

tgcggaacca accaaccgct gccctaggac atctcctgcc agaaggaaca cccacacccc 8520

tcatccccgt cctaattatt atcgagacaa ttagcctgtt catccgccct ctggccctgg 8580

gtgttcgact aaccgccaac ctcacagccg gtcacctcct aatacagctc acatctacag 8640

ccgccttcgt tcttttatcg atgatgccca cagtagcgat cctcacaaca attctcctat 8700

tcttgctaac ccttttagaa gttgccgtag ctataatcca agcctatgta tttgtattac 8760

ttttaagcct ttacctacaa gaaaacgtct aatggcccac caagcacacg catatcacat 8820

agtagacccc agcccctggc ccctaacagg agccgtcgcc gccctgctct taacatcagg 8880

tctcgcaatc tgatttcact tccactccac aattcttctg tctttaggtc ttatccttct 8940

actcttaaca atgtaccaat gatgacgaga catcattcga gaaggcacat ttcaaggaca 9000

ccacacaccc cccgtccaaa aaggccttcg atttggtata attctgttca ttacatcaga 9060

agtcttcttt ttcctagggt tcttctgagc tttttatcac tcaagccttg cccccacacc 9120

cgagctaggc ggctgctgac cccccactgg catcaccacc ttagatccat tcgaagtccc 9180

cctactcaat actgccgttc tcctagcctc cggtgtcaca gttacctgag cccaccacag 9240

tatcatagaa ggcgagcgta aacaagccat tcactccctg acacttacta ttctccttgg 9300

gttttatttt actttcctcc aagccataga atactatgaa gcccccttca ccatcgcgga 9360

cggagtatat ggctccacat tctttgtagc cacaggcttt cacggacttc atgttattat 9420

tggctctaca ttcctagcca tctgcctact ccgccaaatt caatatcact ttacatcaga 9480

acaccacttc ggattcgaag cagccgcctg atactgacac ttcgtagacg tcgtttgatt 9540

attcctttat atctccatct actgatgagg ctcataatct ttctagtact aagttagtat 9600

cagtgacttc caatcaccag gtcttggtta aagtccaagg aaagataatg aatttagtca 9660

cagtcatctt tattattgct accttactct caaccatcct agccaccgtg tcattctggc 9720

tccctcaaat gaccccggac cacgaaaagc tctcccccta tgaatgtggc ttcgaccccc 9780

tcggcaccgc tcgattgcct ttttccctcc gattttttct tgtcgccatc ctgtttctgc 9840

tatttgacct agaaattgcc cttctcctgc ccctgccctg aggagaccag ctagcctccc 9900

cccttttgac cttcctctgg gccacagccg tcctagccct cctcacccta ggcctaattt 9960

atgaatgact tcaaggaggc ctagagtgag ccgaataggt aattagttta agaaaaacac 10020

ttgatttcgg ctcaagagct tgtggttaaa gtccacactc acctaatgac ccccgttcac 10080

tttgccttct cctcagcctt cattctagga ctaaccggcc tagcattcca ccgaacccac 10140

cttctctccg ccctattatg tctagaagga ataatactct ccctatttat tgccctctct 10200

ctatggaccc tccaactaga ctccactaac ttctcagcct cccccatgct ccttctagca 10260

ttctcagcct gtgaagcgag tgcaggcctc gccctactag tcgccacctc ccgaacccac 10320

ggcactgacc gcctacaaag cctgaacctc ctacaatgct aaaaatcctc atccccacgt 10380

taatgcttgt cccgacaacc tgactagttc ctgctaagtg actctgacct acaacactca 10440

cgcacagcct gctaattgca ctagccagcc tcacctgact aaaaaaccta tcagagacag 10500

gctgaacttt tctgaatccc tacatagcaa cagaccccct ctcaacgccc cttctagttc 10560

ttacttgctg acttcttccc ctcataatcc tcgcaagtca aaaccacaca gccctcgagc 10620

ccattaaccg ccaacgaata tacgtcaccc ttctaacatc cctgcaaatc ttccttatct 10680

tggcctttag tgccaccgaa gtaatcatgt tttacgtaat attcgaagct actttaattc 10740

caaccctatt cctaattacc cgctgaggta accaagcaga acgactcaac gcaggcactt 10800

attttttatt ctacaccctg gccggctcac tcccactgct tgtcgccctt cttctcctcc 10860

agaacaatgc cgggaccctc tcccttctaa ccctgcaatt ttcaaacccc gcccaactca 10920

ccaccttcgc agacaagctc tgatgagcag gctgcctatt agcatttcta gtaaaaatac 10980

cactctatgg cgtccacctc tgactgccca aagcccacgt tgaagcccca atcgcaggct 11040

caataattct tgctgccgtc ctcctaaaac tcgggggcta cggcataatg cgaatccttc 11100

ccatactaga gcccctaacc aaagaactaa gttacccctt tatcatcttc gcactctgag 11160

gggtaatcat aaccggctca atttgtttac gccaaacaga tctaaaatcc ctcattgcct 11220

actcatctgt cggccacatg ggtctcgtag tgggtgggat cctcatccaa accccttgag 11280

gttttacagg tgctctcatt ctcataattg cacatggcct cacctcttct gccctattct 11340

gccttgccaa cacaaactat gagcggaccc acagccgaac aatggtcctt gcccgaggcc 11400

tccaaatagc actcccccta atagcaacct gatgatttat cgccagcctc gccaacctag 11460

ccctccctcc actccccaac ctcatggggg aactaataat tattacctca ctattcaact 11520

gatcctgatg aaccctcgcc ctaacaggcg ccggaaccct tatcaccgcc ggctactctc 11580

tctatatgtt cttaataacc caacgaggcc cgcttccaat acacatcatt gccctcgaac 11640

cctcccactc tcgagaacac ctcctggtaa ccctccactt actccccctg attttactaa 11700

tcctcaagcc cgagctaatt tgaggttgag ccgcctgtag atatagttta acaaaaacat 11760

tagattgtga ttctaaaaac aggggttaaa gtccccttgt ccaccgagag aggctcgcta 11820

gcaacgaaga ctgctaatct tcgccacctt ggttgaaccc ctgggctcac tcgagccgct 11880

tctaaaggat aacagctcat ccgttggtct taggaaccaa aaactcttgg tgcaaatcca 11940

agtagcagct atgcacacta cttcactaat aataacctca agcctaacta ttatcttctt 12000

tctcctagcc taccctgtct ttacaaccct caaccctcgc cctcaaaacc ccgattgagc 12060

cctctcccaa gttaaaacag cagtgaaact agcctttttc gtgagccttc tccccctctt 12120

cctgttcctt aacgaaggcg cagagacaat cgtcactaac tgaacctgaa taaatacatt 12180

aacctttgat attaatatca gctttaagtt cgaccactat tcaattattt tcacccccat 12240

tgccctctac gtcacctgat caattctcga atttgcatcc tggtatatac actcagaccc 12300

cttcataaac cgattcttta aataccttct catcttccta attgctataa ttgtccttgt 12360

tacagcgaac aacatattcc aacttttcat cggatgagag ggcgtaggaa tcatatcatt 12420

cctcttaatc ggctgatgat acggccgagc agacgcaaat accgcagccc tccaagccgt 12480

tctctacaac cgagtggggg atatcggcct aatcttcgcc atggcatgaa tagcaaccaa 12540

tcttaactca tgagaaatac aacaaatatt tgcagcagct aaaaaccagg acctcacctt 12600

ccccctccta gggctcattc ttgccgcaac tggtaagtca gcccaatttg gactccaccc 12660

ttgacttccc tctgccatag agggccccac accggtctcc gccctactac actccagcac 12720

tatagtcgtc gccggtattt tccttctcgt tcgaataagc cctctcttag aaaacaacca 12780

aacagccctc accctctgcc tgtgcctagg cgccctaacc accctattta ctgccacctg 12840

cgccctcacc caaaatgaca tcaaaaaaat cgttgctttc tccacatcaa gccaactagg 12900

cctgataata gtaactatcg gacttaacca gcctcaactc gccttcctcc acatttgcac 12960

ccacgctttc tttaaagcaa tactcttcct ctgctcgggc tcaatcatcc acagtcttaa 13020

tgatgaacag gacatccgaa aaatgggggg catgcaccac ctcacaccct ttacctcctc 13080

ctgccttact attggaagcc ttgccctcac aggcaccccc ttcttagcgg gcttcttctc 13140

aaaagacgct attattgaag cactaaacac atcccatctc aacgcctgag ccctcgccct 13200

cacactcctt gccacctcct ttacagccat ctacagcctc cgagtcattt tctttgtatc 13260

catgggccac ccccgattta atacactttc ccctattaat gaaaacaact cagcagtcat 13320

taaccccatc aaacgcctag cctgaggaag cattctcgcc ggccttttaa ttacctccaa 13380

catgaccccc ctaaaaacac caatcataac catgccccca ctcctaaaac tagccgccct 13440

caccgtcacc atcctgggcc ttcttttagc actagaactt gcctccctga caaataagca 13500

atttaaaccc accccaaaac taacccctca ccacttctcc aacatgcttg gcttttttcc 13560

agccattatt caccgcacgc ttcctaaact taacctgacc ctcggccaaa caattgccag 13620

ccagatggtc gacttaacat gactagaaaa aacaggcccc aaagccctag cctccctcaa 13680

catacccctg atcacaacaa caagcaactc ccaacaaggc ataatcaaaa cgtaccttac 13740

cttctttcta ctaacactag ccctcgccac cctagtattt atcctttaaa ccgcccgaag 13800

ggccccccga cttaaacccc gggttagctc gagcaccaca aataaagtca aaagcagcac 13860

ccaagcacta attactaaca ttcccccacc ccccgcatac attaatgcaa caccccccga 13920

atccccccgt aatgtagata actccccaaa ctcatccaca ggtacccaag aagtctcata 13980

tcacccccct caaaaaagac ctgaaaccat ggctacccct acaacataag caagaatata 14040

caccacaaca ggacgactcc ctcaactctc cggataaggc tccgcagcaa gagctgccga 14100

gtacgcaaac actaccaaca ttccccccaa gtaaatcaaa aacaagatca aagataaaaa 14160

atgacccccg tgccccacca aaacaccaca ccccaggccc gccaccacaa ccaagcccaa 14220

agcagcaaaa taaggcgagg ggtttgaagc aaccgcaacc agccctaaaa ctaacccaaa 14280

taaaaataaa gacataatat aagtcataat ttctgccagg actctaacca ggactaatgg 14340

cttgaaaaac caccgttgtt attcaactac aaaaacctta atggcaagcc tacgcaaaac 14400

ccaccccctc ctaaaaatcg caaacgacgc actagtggac ctccccgccc catccaacat 14460

ctcagcctga tgaaactttg gctccctgct cggcctttgc ttagccgccc aaattctcac 14520

aggactcttc cttgctatac attatacatc cgacatctcc atggccttct catccgtcgc 14580

acacatttgc cgagatgtta actacggatg gctcatccga aacctccacg ccaacggcgc 14640

ctctttcttc tttatctgcc tttatcttca catcggccga ggcctctact atggctctta 14700

tctttataaa gagacatgaa acattggagt cgtactcttc cttttagtaa tgatgactgc 14760

cttcgtaggc tacgtcctcc cctgaggcca aatgtctttt tgaggggcca ctgtcatcac 14820

aaacctccta tccgccgtac cctatgtagg caacacatta gttcaatgaa tctggggcgg 14880

cttttcagta gacaatgcca ccctcacccg attcttcgcc ttccactttc tcctgccctt 14940

cattgtcgca gccgcaaccc ttctccacct actcttcctg cacgagacag gctcaaacaa 15000

tccgcttggc ctaaactctg acgcagacaa aatcccgttc cacccctatt tcacctacaa 15060

agacctcctg ggctttgcaa tcctaattat ctcccttacc gctctggccc tcttctcccc 15120

caatctcctg ggcgaccccg acaatttcac ccccgccaac ccgctcgtca ctcctcctca 15180

cattaaacca gagtggtatt tcctatttgc ctacgccatc ctccgctcaa tccccaacaa 15240

actgggaggg gtccttgctc ttcttgcctc catccttgtt ctaatagtag tccccatcct 15300

tcacacatca aaacaacgag gcctgacgtt ccggcccgtc acccaattcc ttttctgaac 15360

cctcattgca gacgtcctca tcctaacatg aattggcggt atacctgtag aacacccttt 15420

cattattatt ggccagattg catccctcct gtacttctcc ctattcctga ttttcctccc 15480

attagcaggt tgactagaga acaaagttct tgaatgacgc tgcactagta gctcagtttc 15540

agagcgtagc accggtcttg taaaccggat gtcgggggtt aaattccccc ctactgctat 15600

atcaaaaagg agggaattta acccccacca ctaattccca aaactagtat tctaaactaa 15660

actacttttt gtacatatat gtatatacac catacaatta tatcaaccag atcaatagta 15720

attcaataca tacatgtttt atcaacattc tctggtttat cacattcaca cggtactatt 15780

aacagttccc gtacataaac catttaatac taacattcaa cagtcatata tataatgact 15840

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acacggttat tgaaggtgag ggacaaatat cgtgggggtt tcacaatatg aattattcct 16020

ggcatttggt tcctacttca gggccatata attggtatca ctccccacac tttcatcgac 16080

gcttgcataa gttaatggtg gtaatacata accgggagca ccccccatgc cgagcgttct 16140

ttctagaggg tcactggtat tttttttctc ttttcctttt cactttgcat ttcagagtgc 16200

ccgcggaagt aaaataataa ggttgaacat ttcctctgaa tacaagtaaa atatgttaaa 16260

tgataaaagt cattacttaa gacttgcata taacaatatc aagtgcataa actgtgactt 16320

attacctgga agatatctaa gtgtgccccc tgggtttctg cgcgtaaacc cccctacccc 16380

ccagcactcc tgagatcatt aacattcctg taaacccccc cggaaacagg aaaatcccta 16440

gcagtgtatt ttttagccca aagtgtatct atttacatta ttaaaataat gcacac 16496

Claims (1)

1.一种日本黄姑鱼线粒体全基因组序列的扩增方法，其特征在于，以提取的日本黄姑鱼基因组DNA为模板，首先用4对扩增引物进行4个大片段产物扩增，然后通过基因组步移的方法，使用剩余的16对扩增引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖电泳检测后送生物公司测序；

上述的20对引物对，具体序列信息如下所示：

(1)第1对上游引物为：SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；

(2)第2对上游引物为：SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；

(3)第3对上游引物为：SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.6所示的核苷酸序列；

(4)第4对上游引物为：SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.8所示的核苷酸序列；

(5)第5对上游引物为：SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.10所示的核苷酸序列；

(6)第6对上游引物为：SEQIDNO.11所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.12所示的核苷酸序列；

(7)第7对上游引物为：SEQIDNO.13所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.14所示的核苷酸序列；

(8)第8对上游引物为：SEQIDNO.15所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.16所示的核苷酸序列；

(9)第9对上游引物为：SEQIDNO.17所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.18所示的核苷酸序列；

(10)第10对上游引物为：SEQIDNO.19所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.20所示的核苷酸序列；

(11)第11对上游引物为：SEQIDNO.21所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.22所示的核苷酸序列；

(12)第12对上游引物为：SEQIDNO.23所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.24所示的核苷酸序列；

(13)第13对上游引物为：SEQIDNO.25所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.26所示的核苷酸序列；

(14)第14对上游引物为：SEQIDNO.27所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.28所示的核苷酸序列；

(15)第15对上游引物为：SEQIDNO.29所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.30所示的核苷酸序列；

(16)第16对上游引物为：SEQIDNO.31所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.32所示的核苷酸序列；

(17)第17对上游引物为：SEQIDNO.33所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.34所示的核苷酸序列；

(18)第18对上游引物为：SEQIDNO.35所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.36所示的核苷酸序列；

(19)第19对上游引物为：SEQIDNO.37所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.38所示的核苷酸序列；

(20)第20对上游引物为：SEQIDNO.39所示的核苷酸序列，下游引物为：SEQIDNO.40所示的核苷酸序列；

其中，上述的4对扩增引物为第1对，第6对，第11对和第16对。