CN113846189A - 基于gisaid分型的新型冠状病毒基因型参照序列、设计引物、试剂盒及应用 - Google Patents

基于gisaid分型的新型冠状病毒基因型参照序列、设计引物、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种基于GISAID分型的新型冠状病毒基因型参照序列和特异性引物位点。以上述特异性引物位点为引物3’端，本发明还设计出了一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物。同时，本发明还提供了一种用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒及其使用方法与应用，该试剂盒包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH2O以及上述各基因型特异性引物。本发明的优点在于：采用本发明试剂盒，能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测SARS‑CoV‑2病毒并对其进行基因型分型，为新冠的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究新型冠状病毒基因突变引起的功能改变提供依据。

Description

基于GISAID分型的新型冠状病毒基因型参照序列、设计引物、 试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型参照序列、特异性突变位点、设计引物、突变扩增试剂盒及应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引起2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体。有效预防和控制SARS-CoV-2需要更深入地了解病毒的不同方面，包括序列变异和进化。迄今为止，已发表了超过80万条SARS-CoV-2序列，其中，病毒基因组的突变率从2020年1月1日的0.1338‰不断上升到2021年2月28日的1.2373‰。事实上，到目前为止，已经确定了超过27,000个突变。SARS-CoV-2基因组内的突变会影响感染的生物学后果，可能导致病毒更易传播、更易逃逸免疫，并且，造成疫苗效率下降。
随着SARS-CoV-2的基因组数据不断积累，目前出现了一些SARS-CoV-2基因分型方法，包括：中国分型法，Pangolin分型法、GISAID分型法和Nextstrian分型。其中，GISAID分型法为目前国际上较为通用的方法之一，它是由系统发育簇中基因组距离的统计分布提供信息，根据共享的标记毒株将较小的进化分支合并成主要的进化簇。按照GISAID分型法，新型冠状病毒分为L,S,V,G,GH,GR,GV,GRY八个基因型。
然而，在SARS-CoV-2的临床诊断中，无论是采用中国分型法、Pangolin分型法、GISAID分型法还是Nextstrian分型法，当需要进行具体基因型确定时，都只能通过测序方式进行，这不仅操作麻烦，实验周期还很长，为新冠的临床早期诊断和干预带来不便。
因此，目前急需研究出一种能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测SARS-CoV-2病毒并对其进行基因型分型的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于GISAID分型的新型冠状病毒基因型参照序列、设计引物、试剂盒及应用，采用本发明试剂盒能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测SARS-CoV-2病毒并对其进行基因型分型。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于GISAID分型的新型冠状病毒基因型参照序列，包括L型参照序列、S型参照序列、V型参照序列、G型参照序列、GH型参照序列、GR型参照序列、GV型参照序列和GRY型参照序列；其中，所述L型参照序列的碱基如SEQ ID NO.1所示；以L型参照序列为参照，其他型参照序列如表1所示：
表1各基因型参照序列
Figure BDA0003335736360000021
表1中，空白表示与L型的碱基一致。
一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物位点，根据上述基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型参照序列，从中选出并确定各基因型特异性引物位点，如表2所示：
表2各基因型中特异性引物位点
Figure BDA0003335736360000031
表2中，空白表示与L型的碱基一致。
作为本发明的优选方式之一，最终选择并确定的特异性引物位点具体为：S型，8782C→T；V型，26146G→T；G及其衍生型GH、GR、GV、GRY，14408C→T；GH型，25563G→T；GR和其衍生型GRY，28881-28883GGG→AAC；GV型，28932C→T；GRY型，14676C→T。
作为本发明的优选方式之一，所述各基因型特异性引物位点用于设计相应特异性引物，从而通过PCR来区分不同基因型；具体设计时，以所述各基因型特异性引物位点为引物3’端。
一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物，分别为P-U、P-S、P-V、P-G、P-GH、P-GR、P-GV、P-GRY；所述P-U为新型冠状病毒通用引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；所述P-S为S型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述P-V为V型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；所述P-G为G、GH、GR、GV、GRY型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；所述P-GH为GH型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11所示；所述P-GR为GR、GRY型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQID NO.12、SEQ ID NO.13所示；所述P-GV为GV型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；所述P-GRY为GRY型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示。
一种用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH2O以及如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.17所示的各特异性引物。
作为本发明的优选方式之一，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶PrimeStar，PCR缓冲溶液为5×PrimeStar buffer。
作为本发明的优选方式之一，所述PCR扩增试剂盒的扩增程序为：预变形94℃3min；94℃30s，54℃，60℃或62℃15s，72℃25s，40个循环；72℃延伸10min。
一种上述PCR扩增试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取SARS-CoV-2基因组RNA；
(2)利用反转录试剂将RNA反转录成cDNA；
(3)将步骤(2)制备的cDNA模板加入到PCR反应体系中，扩增相对应的片段；
(4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
一种上述PCR扩增试剂盒的应用，将所述试剂盒用于SARS-CoV-2的突变研究与SARS-CoV-2基因型快速诊断。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明建立了GISAID分型法各SARS-CoV-2基因型的参照序列，并根据建立的基因型参照序列找出各突变株的特异性突变位点，以此设计出了相应特异性引物，进而研发出了一种用于不同基因型SARS-CoV-2检测与区分的PCR扩增试剂盒；采用本发明试剂盒，能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测SARS-CoV-2病毒并对其进行基因型分型，为新冠的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究新型冠状病毒基因突变引起的功能改变提供依据。
附图说明
图1是实施例5的琼脂糖凝胶电泳图(图1中，左右两端泳道为marker，中间泳道由左至右依次为GRY-T、GRY、GV-T、GV、GR-T、GR、GH-T、GH、G-T、G、V-T、V、S-T、S、U)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型参照序列的建立：
从GISAID网站上将每个基因型随机下载100条序列，通过比对选择每个位置中出现次数最多的核苷酸来建立参考序列。
最终选择的L型参照序列碱基如SEQ ID NO.1所示；以L型参照序列为参照，其他型参照序列如表1所示。
表1各基因型参照序列
Figure BDA0003335736360000051
Figure BDA0003335736360000061
注：空白表示与L型的碱基一致。
实施例2
基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物位点的建立：
表1实际上是以L型参照序列作为参照，呈现出了其他突变基因型参照序列的相应突变位点。因此，在表1各突变位点中，可选择一些合适的位点作为后续的特异性引物位点。
首先，通过对各突变位点的特异性和敏感性的考察，初步确定表2所列的突变位点作为后续的特异性引物位点选择范围。
表2各基因型中特异性引物位点
Figure BDA0003335736360000062
注：空白表示与L型的碱基一致。
分析表2可知，S型设计特异性引物位点：第8782位点由L型的C突变为T(8782C→T)，第28144位点由L型的T突变为C(28144T→C)；V型设计特异性引物位点：第26144位点由L型的G突变为T(26144G→T)；G及其衍生型(GH,GR,GV,GRY)设计特异性引物位点：第3037位点由L型的C突变为T(3037C→T)，第14408位点由L型的C突变为T(14408C→T)，第23403位点A突变为G(14408A→G)；GH型设计特异性引物位点：第25563位点由L型的G突变为T(25563G→T)；GR和其衍生型GRY设计特异性引物位点：第28881-28883位点由L型的GGG突变为AAC(28881-28883GGG→AAC)；GV型设计特异性引物位点：第445位点由L型的T突变为C(445T→C)，第22227位点由L型的C突变为T(22227C→T)，第26801位点由L型的C突变为G(26801C→G)，第28932位点由L型的C突变为T(28932C→T)，第29645位点由L型的G突变为T(29645G→T)；GRY型设计特异性引物位点：第3267位点由L型的C突变为T(3267C→T)，第14676位点由L型的C突变为T(14676C→T)。如表2所示。
接着，对初步确定的特异性引物位点进一步优化，最终获得最优的特异性引物位点，即，S型(8782C→T)，V型(26146G→T)，G及其衍生型GH、GR、GV、GRY(14408C→T)，GH型(25563G→T)，GR和其衍生型GRY(28881-28883GGG→AAC)，GV型(28932C→T)，GRY型14676C→T)。
实施例3
基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物的建立：
以实施例2中获得的各基因型特异性引物位点为引物3’端，设计相应的特异性引物，具体如表3所示。
表3各基因型引物序列
Figure BDA0003335736360000071
Figure BDA0003335736360000081
注：小写字母为基因型特异性位点。
实施例4
PCR扩增试剂盒的构建及使用方法：
一、所述PCR扩增试剂盒用于新型冠状病毒检测与基因型分型，主要包括PCR缓冲液(5×PrimeStar buffer)、DNA聚合酶(PrimeStar)、dNTP、ddH2O以及P-U、P-S、P-V、P-G、P-GH、P-GR、P-GV、P-GRY对应的上、下游引物(如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.17所示)。为了方便后续使用，本实施例PCR扩增试剂盒还可以包括RNA提取试剂和反转录试剂。
本实施例试剂盒的PCR体系如表4所示。
表4 PCR反应体系
cDNA模板 5μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
dNTP(四种dNTP浓度分别为2.5mM) 4μL
5×Prime Star buffer(Mg+Plus) 10μL
Prime Star 0.5μL
注：加ddH2O定容至总体积50μL。
PCR扩增程序为：预变形94℃3min；94℃30s，54℃，60℃或62℃15s，72℃25s，40个循环；72℃延伸10min。
二、本实施例试剂盒的使用方法：
(1)RNA的提取：提取样本中SARS-CoV-2基因组RNA；
(2)cDNA模板的制备：利用反转录试剂将RNA反转录成cDNA；
(3)PCR扩增：将步骤(2)制备的cDNA模板加入到PCR反应体系中，扩增相对应的片段；
(4)结果分析：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，各基因型相对应结果如下：
表5理论上各基因型PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Figure BDA0003335736360000082
Figure BDA0003335736360000091
注：“+”PCR结果阳性，有对应的条带；“-”PCR结果阴性，无对应的条带。
实施例5
本实施例用于验证本发明设计的特异性引物的可行性：
我们将各基因型特异性位点相应的片段合成并插入到质粒中来验证我们设计的特异性引物的可行性。
一、携带扩增片段质粒的制备：
U(通用引物P-U对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.18所示；
S(引物P-S对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.19所示；
S-T(S型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQ IDNO.20所示；
V(引物P-V对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.21所示；
V-T(V型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQ IDNO.22所示；
G(引物P-G对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.23所示；
G-T(G型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQ IDNO.24所示；
GH(引物P-GH对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.25所示；
GH-T(GH型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQ IDNO.26所示；
GR(引物P-GR对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.27所示；
GR-T(GR型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQ IDNO.28所示；
GV(引物P-GV对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.29所示；
GV-T(GV型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQ IDNO.30所示；
GRY(引物P-GRY对应的片段)：其碱基序列如SEQ ID NO.31所示；
GRY-T(GRY型阴性对照，突变前的特异性突变位点对应片段)：其碱基序列如SEQID NO.32所示。
合成上述DNA片段分别连接到质粒PMV上作为PCR扩增模板。
二、利用型特异性引物扩增：
以上述质粒作为模板，加入相应的引物进行PCR，具体步骤：PCR反应总体积50μL，其中模板(质粒20pg/μL)1μL，对应的上游和下游引物(10μM)个1μL，dNTP(四种dNTP各2.5mM)4μL，5×Prime Star buffer(Mg2+Plus)10μL，Prime Star(5U/ul)0.5μL，ddH2O定容至总体积50μL。循环参数：预变性94℃3min，然后94℃30s，(引物P-U退火温度54℃；引物P-S,P-V,P-G退火温度60℃；引物P-GH,P-GR,P-GV,P-GRY退火温度62℃)15s,72℃25s 40个循环，72℃10min延伸。
三、结果分析
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1和下表6所示，据此，本发明基因型特异性引物能够有效准确的扩增出目标条。
表6 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
Figure BDA0003335736360000101
注：“+”扩增结果阳性，“-”扩增结果阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽医科大学第二附属医院
<120> 基于GISAID分型的新型冠状病毒基因型参照序列、设计引物、试剂盒及应用
<130> 2021
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29870
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒SARS-CoV-2()
<400> 1
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
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ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1560
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1620
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1680
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1740
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1800
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1860
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1920
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 1980
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2040
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2100
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2160
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2220
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2280
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2340
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2400
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2460
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2520
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2580
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2640
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cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2760
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2820
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ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 2940
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tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3060
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agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3180
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3240
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3300
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3360
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aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3540
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gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 3960
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gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4260
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ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4440
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agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4860
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ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 4980
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tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5760
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tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6000
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6060
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6120
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tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6360
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6420
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ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7380
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tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7800
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ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8340
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8400
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tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa 8520
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tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat 8700
tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc 8760
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tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc 9240
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cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca 9720
tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt 9780
tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa 9840
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taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg 9960
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cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga 10740
ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat 10800
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tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt 10980
gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt 11040
agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt 11100
accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa 11160
gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat 11220
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tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact 11340
aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat 11400
gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc 11460
catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat 11520
gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac 11580
tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg 11640
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tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt 11880
actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt 11940
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tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg 14400
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gcagcataca caagtaattc ct 22
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gcgttgcact tcttgctgtt tttcat 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gttacaaaca acaacagcaa gttgc 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
caactccagg cagcagtaaa c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
agtgacagtt tggccttgtt g 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gcggtgatgc tgctcttgt 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
tgttctggac cacgtctgc 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
gcttttcaaa ctgtcaaacc t 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
attaccatcc tgagcaaaga ag 22
<210> 18
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca 60
tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc 120
ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct 180
tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc 240
gcaacagttc aagaaattca actccaggca gca 273
<210> 19
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
ataggataca aggctattga tggtggtgtc actcgtgaca tagcatctac agatacttgt 60
tttgctaaca aacatgctga ttttgacaca tggtttagtc agcgtggtgg tagttatact 120
aatgacaaag cttgcccatt gattgctgca gtcataacaa gagaagtggg ttttgtcgtg 180
cctggtttgc ctggcacgat attacgcaca actaatggtg actttttgca tttcttacct 240
agagttttta gtgcagttgg taacatctgt tacacaccat caaaacttat agagtacact 300
gactttgcaa catca 315
<210> 20
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
ataggataca aggctattga tggtggtgtc actcgtgaca tagcatctac agatacttgt 60
tttgctaaca aacatgctga ttttgacaca tggtttagcc agcgtggtgg tagttatact 120
aatgacaaag cttgcccatt gattgctgca gtcataacaa gagaagtggg ttttgtcgtg 180
cctggtttgc ctggcacgat attacgcaca actaatggtg actttttgca tttcttacct 240
agagttttta gtgcagttgg taacatctgt tacacaccat caaaacttat agagtacact 300
gactttgcaa catca 315
<210> 21
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ctgtactcaa ctcaattgag tacagacact ggtgttgaac atgttacctt cttcatctac 60
aataaaattg ttgatgagcc tgaagaacat gtccaaattc acacaatcga cgtttcatcc 120
ggagttgtta atccagtaat ggaaccaatt tatgatgaac cgacgacgac tactagcgtg 180
cctttgtaag cacaagctga tgagtacgaa cttatgtact cattcgtttc ggaagagaca 240
ggtacgttaa tagttaatag cgtacttctt tttcttgctt tcgtggtatt cttgctagtt 300
acactagcca tccttac 317
<210> 22
<211> 317
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
ctgtactcaa ctcaattgag tacagacact ggtgttgaac atgttacctt cttcatctac 60
aataaaattg ttgatgagcc tgaagaacat gtccaaattc acacaatcga cggttcatcc 120
ggagttgtta atccagtaat ggaaccaatt tatgatgaac cgacgacgac tactagcgtg 180
cctttgtaag cacaagctga tgagtacgaa cttatgtact cattcgtttc ggaagagaca 240
ggtacgttaa tagttaatag cgtacttctt tttcttgctt tcgtggtatt cttgctagtt 300
acactagcca tccttac 317
<210> 23
<211> 305
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac tgtttggatg acagatgcat 60
tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg ttcccactta caagttttgg 120
accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt gtagtttcaa ctggatacca 180
cttcagagag ctaggtgttg tacataatca ggatgtaaac ttacatagct ctagacttag 240
ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg cacgctgctt ctggtaatct 300
attac 305
<210> 24
<211> 305
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac tgtttggatg acagatgcat 60
tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg ttcccaccta caagttttgg 120
accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt gtagtttcaa ctggatacca 180
cttcagagag ctaggtgttg tacataatca ggatgtaaac ttacatagct ctagacttag 240
ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg cacgctgctt ctggtaatct 300
attac 305
<210> 25
<211> 310
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
tcagattttg ttcgcgctac tgcaacgata ccgatacaag cctcactccc tttcggatgg 60
cttattgttg gcgttgcact tcttgctgtt tttcatagcg cttccaaaat cataaccctc 120
aaaaagagat ggcaactagc actctccaag ggtgttcact ttgtttgcaa cttgctgttg 180
ttgtttgtaa cagtttactc acaccttttg ctcgttgctg ctggccttga agcccctttt 240
ctctatcttt atgctttagt ctacttcttg cagagtataa actttgtaag aataataatg 300
aggctttggc 310
<210> 26
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
tcagattttg ttcgcgctac tgcaacgata ccgatacaag cctcactccc tttcggatgg 60
cttattgttg gcgttgcact tcttgctgtt tttcagagcg cttccaaaat cataaccctc 120
aaaaagagat ggcaactagc actctccaag ggtgttcact ttgtttgcaa cttgctgttg 180
ttgtttgtaa cagtttactc acaccttttg ctcgttgctg ctggccttga agcccctttt 240
ctctatcttt atgctttagt ctacttcttg cagagtataa actttgtaag aataataatg 300
aggctttggc t 311
<210> 27
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc 60
aactccaggc agcagtaaac gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc 120
tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa 180
aggccaacaa caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa 240
gcctcggcaa aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg 300
tgg 303
<210> 28
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc 60
aactccaggc agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc 120
tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa 180
aggccaacaa caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa 240
gcctcggcaa aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg 300
tgg 303
<210> 29
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ctccaggcag cagtagggga acttctcctg ctagaatggc tggcaatggc ggtgatgctg 60
ctcttgtttt gctgctgctt gacagattga accagcttga gagcaaaatg tctggtaaag 120
gccaacaaca acaaggccaa actgtcacta agaaatctgc tgctgaggct tctaagaagc 180
ctcggcaaaa acgtactgcc actaaagcat acaatgtaac acaagctttc ggcagacgtg 240
gtccagaaca aacccaagga aattttgggg accaggaact aatcagacaa ggaactgatt 300
acaaacattg g 311
<210> 30
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
ctccaggcag cagtagggga acttctcctg ctagaatggc tggcaatggc ggtgatgctg 60
ctcttgcttt gctgctgctt gacagattga accagcttga gagcaaaatg tctggtaaag 120
gccaacaaca acaaggccaa actgtcacta agaaatctgc tgctgaggct tctaagaagc 180
ctcggcaaaa acgtactgcc actaaagcat acaatgtaac acaagctttc ggcagacgtg 240
gtccagaaca aacccaagga aattttgggg accaggaact aatcagacaa ggaactgatt 300
acaaacattg g 311
<210> 31
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
attactagat aaacgcacta cgtgcttttc agtagctgca cttactaaca atgttgcttt 60
tcaaactgtc aaacctggta attttaacaa agacttctat gactttgctg tgtctaaggg 120
tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc ttctttgctc aggatggtaa 180
tgctgctatc agcgattatg actactatcg ttataatcta ccaacaatgt gtgatatcag 240
acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt gattgttacg atggtggctg 300
tat 303
<210> 32
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
attactagat aaacgcacta cgtgcttttc agtagctgca cttactaaca atgttgcttt 60
tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat gactttgctg tgtctaaggg 120
tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc ttctttgctc aggatggtaa 180
tgctgctatc agcgattatg actactatcg ttataatcta ccaacaatgt gtgatatcag 240
acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt gattgttacg atggtggctg 300
tat 303

Claims (10)

1.一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型参照序列，其特征在于，包括L型参照序列、S型参照序列、V型参照序列、G型参照序列、GH型参照序列、GR型参照序列、GV型参照序列和GRY型参照序列；其中，所述L型参照序列的碱基如SEQ ID NO.1所示；以L型参照序列为参照，其他型参照序列如表1所示：
表1各基因型参照序列
Figure FDA0003335736350000011
Figure FDA0003335736350000021
表1中，空白表示与L型的碱基一致。
2.一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物位点，其特征在于，根据权利要求1所述的基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型参照序列，从中选出并确定各基因型特异性引物位点，如表2所示：
表2各基因型中特异性引物位点
Figure FDA0003335736350000022
表2中，空白表示与L型的碱基一致。
3.根据权利要求2所述的基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物位点，其特征在于，最终选择并确定的特异性引物位点具体为：S型，8782C→T；V型，26146G→T；G及其衍生型GH、GR、GV、GRY，14408C→T；GH型，25563G→T；GR和其衍生型GRY，28881-28883GGG→AAC；GV型，28932C→T；GRY型，14676C→T。
4.根据权利要求2或3所述的基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物位点，其特征在于，所述各基因型特异性引物位点用于设计相应特异性引物，从而通过PCR来区分不同基因型；具体设计时，以所述各基因型特异性引物位点为引物3’端。
5.一种基于GISAID分型的新型冠状病毒各基因型特异性引物，其特征在于，分别为P-U、P-S、P-V、P-G、P-GH、P-GR、P-GV、P-GRY；所述P-U为新型冠状病毒通用引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；所述P-S为S型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述P-V为V型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；所述P-G为G、GH、GR、GV、GRY型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；所述P-GH为GH型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示；所述P-GR为GR、GRY型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；所述P-GV为GV型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；所述P-GRY为GRY型新型冠状病毒反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示。
6.一种用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH2O以及如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.17所示的各特异性引物。
7.根据权利要求6所述的用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶PrimeStar，PCR缓冲溶液为5×PrimeStarbuffer。
8.根据权利要求6所述的用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒的扩增程序为：预变形94℃ 3min；94℃ 30s，54℃，60℃或62℃15s，72℃ 25s，40个循环；72℃延伸10min。
9.一种如权利要求6-8任一所述的用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取SARS-CoV-2基因组RNA；
(2)利用反转录试剂将RNA反转录成cDNA；
(3)将步骤(2)制备的cDNA模板加入到PCR反应体系中，扩增相对应的片段；
(4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
10.一种如权利要求6-8任一所述的用于新型冠状病毒检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒的应用，其特征在于，将所述试剂盒用于SARS-CoV-2的突变研究与SARS-CoV-2基因型快速诊断。
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