CN116121276A - 一种dbv基因型参照序列、设计引物及区分不同基因型的试剂盒与应用 - Google Patents

一种dbv基因型参照序列、设计引物及区分不同基因型的试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种DBV基因型参照序列和特异性引物位点。以上述特异性引物位点为引物3’端，本发明还设计出了一组DBV各基因型特异性引物。同时，本发明还提供了一套用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒及其使用方法与应用，该试剂盒包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH2O以及上述各基因型特异性引物。本发明的优点在于：采用本发明试剂盒，能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测DBV并对其进行基因型分型，为DBV的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究DBV基因突变引起的功能改变提供依据。

Description

一种DBV基因型参照序列、设计引物及区分不同基因型的试剂 盒与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大别班达病毒的各基因型参照序列、引物设计及区分不同基因型的试剂盒与应用。
背景技术
大别班达病毒[Dabie bandavirus，DBV；曾称为发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)]是一种新型的布尼亚病毒,可引起发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopeniasyndrome，SFTS)。2009年3月下旬至7月中旬，在中国中部的湖北和河南两省农村地区报告了一种新出现的传染病，被确认为严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)。李德新教授团队对该病原体进行分离培养、电镜观察和基因组测序分析后最终确定其为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一个新成员，即大别班达病毒。SFTS主要症状包括发热、胃肠道症状、肌痛、头晕、关节痛、寒战和局部淋巴结肿大等；实验室检查最常见的异常结果是血小板、白细胞减少以及血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平提高等，少数出现多器官衰竭，死亡率为5％-31％。10年来，相继在中国、韩国和日本出现较多病例，在欧美国家也出现少数病例报道，由于该病已经波及中国、日本和韩国大部分地区，没有有效的疫苗和抗病毒药物，死亡率居高不下，严重危及人民的生命健康，需要积极开展相关研究，为广大群众的生命健康提供科学技术保障。
既往多个研究依据地域或者基因差异将DBV分为不同基因型，部分研究还发现不同的基因变异可能在病毒复制、致病性等方面存在差异，但是目前的DBV基因分型非常混乱，没有具体的分型标准，同一病毒株在不同文章中的基因型有较大区别，而且基因位点差异属于基因型特异性还是具有生物学意义的突变均不清楚，这给DBV的深入研究以及临床早期诊断、干预带来困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种DBV各基因型参照序列、设计引物及区分不同基因型的试剂盒与应用，采用本发明试剂盒能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测DBV病毒并对其进行基因型分型。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种DBV基因型参照序列，包括S1-S6型参照序列、M1-M6型参照序列以及L1-L6型参照序列；其中，所述S1-S6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示，M1-M6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示，L1-L6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18所示；以S1、M1和L1型参照序列为参照，各基因型特异性位点如表1所示：
表1各基因型参照序列特异性位点(表1A、1B、1C分别表示DBV的S、M、L片段)
Figure BDA0004065271830000021
Figure BDA0004065271830000031
Figure BDA0004065271830000041
Figure BDA0004065271830000051
Figure BDA0004065271830000061
表1A中，空白表示和S1型碱基相同；表1B中，空白表示和M1型碱基相同；表1C中，空白表示和L1型碱基相同；基因位点按照基因1型进行标记排序。
一种DBV基因型特异性引物位点，根据上述的DBV基因型参照序列，从中选出并确定各基因型特异性引物位点，如表2所示：
表2各基因型中选出并确定的用于引物设计的特异性引物位点
Figure BDA0004065271830000062
表2中，空白表示和S1型碱基相同。
作为本发明的优选方式之一，本发明最终选择并确定的特异性引物位点为：S1型(459A→G，586C→T)，S2型(1544A→G)，S3型(266C→T，466T→C)，S4型(167C→T，520G→A)，S5型(1445G→A)，S6型(646T→C)。
作为本发明的优选方式之一，各基因型特异性引物位点用于设计相应特异性引物，从而通过PCR来区分不同基因型；具体设计时，以所述各基因型特异性引物位点为引物3’端。
一组DBV各基因型特异性引物，分别为P-S1、P-S2、P-S3、P-S4、P-S5、P-S6；所述P-S1为S1反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；所述P-S2为S2反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；所述P-S3为S3反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；所述P-S4为S4反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示；所述P-S5为S5反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示；所述P-S6为S6反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示。
一种用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH2O以及如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.30所示的各特异性引物。
作为本发明的优选方式之一，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶PrimeStar，PCR缓冲溶液为5×PrimeStar buffer。
作为本发明的优选方式之一，所述PCR扩增试剂盒的扩增程序为：预变形94℃；94℃30s，58℃/59℃/60℃/62℃30s，72℃1min；40个循环，72℃延伸10min。
一种上述用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取DBV基因组RNA；
(2)利用反转录试剂将RNA反转录成cDNA；
(3)将步骤(2)制备的cDNA模板加入到PCR反应体系中，扩增相对应的片段；
(4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
一种上述用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒的应用，将所述试剂盒用于DBV的突变研究以及DBV不同基因型的快速诊断。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明建立了DBV各基因型参照序列，并根据建立的基因型参照序列找出各突变株的特异性突变位点，以此设计出了相应特异性引物，进而研发出了一种用于不同基因型DBV检测与区分的PCR扩增试剂盒；采用本发明试剂盒，能够快速、特异和灵敏地从临床样本中检测DBV并对其进行基因型分型，为DBV的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究DBV基因突变引起的功能改变提供依据。
附图说明
图1是实施例5中1型特异性引物的凝胶电泳图(图中：泳道1为marker，泳道2-7为Z1-1、Z2-1、Z3-1、Z4-1、Z5-1、Z6-1样品，泳道8为NTC；同时，Z1-1表示体系中含1型S序列质粒+1型特异性引物，Z2-1、Z3-1、Z4-1、Z5-1、Z6-1按此类推，NTC表示不添加模板的阴性对照组)；
图2是实施例5中2型特异性引物的凝胶电泳图(图中：泳道1为marker，泳道2-7为Z1-2、Z2-2、Z3-2、Z4-2、Z5-2、Z6-2样品，泳道8为NTC；同时，Z1-2表示体系中含1型S序列质粒+2型特异性引物，Z2-2、Z3-2、Z4-2、Z5-2、Z6-2按此类推，NTC表示不添加模板的阴性对照组)；
图3是实施例5中3型特异性引物的凝胶电泳图(图中：泳道1为marker，泳道2-7为Z1-3、Z2-3、Z3-3、Z4-3、Z5-3、Z6-3样品，泳道8为NTC；同时，Z1-3表示体系中含1型S序列质粒+3型特异性引物，Z2-3、Z3-3、Z4-3、Z5-3、Z6-3按此类推，NTC表示不添加模板的阴性对照组)；
图4是实施例5中4型特异性引物的凝胶电泳图(图中：泳道1为marker，泳道2-7为Z1-4、Z2-4、Z3-4、Z4-4、Z5-4、Z6-4样品，泳道8为NTC；同时，Z1-4表示体系中含1型S序列质粒+4型特异性引物，Z2-4、Z3-4、Z4-4、Z5-4、Z6-4按此类推，NTC表示不添加模板的阴性对照组)；
图5是实施例5中5型特异性引物的凝胶电泳图(图中：泳道1为marker，泳道2-7为Z1-5、Z2-5、Z3-5、Z4-5、Z5-5、Z6-5样品，泳道8为NTC；同时，Z1-5表示体系中含1型S序列质粒+5型特异性引物，Z2-5、Z3-5、Z4-5、Z5-5、Z6-5按此类推，NTC表示不添加模板的阴性对照组)；
图6是实施例5中6型特异性引物的凝胶电泳图(图中：泳道1为marker，泳道2-7为Z1-6、Z2-6、Z3-6、Z4-6、Z5-6、Z6-6样品，泳道8为NTC；同时，Z1-6表示体系中含1型S序列质粒+6型特异性引物，Z2-6、Z3-6、Z4-6、Z5-6、Z6-6按此类推，NTC表示不添加模板的阴性对照组)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
DBV各基因型参照序列的建立：
从NCBI网站上下载截止到2017年7月的所有完整的DBV序列，通过基因进化树和序列之间两两比对，做出基因分型。2017年7月后的序列作为分型标准的验证。
通过比对选择每个位置中出现次数最多的核苷酸来建立参考序列。最终选择的参照序列包括S1-S6型参照序列、M1-M6型参照序列以及L1-L6型参照序列；其中，所述S1-S6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示，M1-M6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示，L1-L6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.13-SEQ IDNO.18所示。以S1、M1和L1型参照序列为参照，各基因型特异性位点如表1所示：
表1各基因型参照序列特异性位点(表1A、1B、1C分别表示DBV的S、M、L片段)
Figure BDA0004065271830000091
Figure BDA0004065271830000101
Figure BDA0004065271830000111
Figure BDA0004065271830000121
Figure BDA0004065271830000131
注：表1A中，空白表示和S1型碱基相同；表1B中，空白表示和M1型碱基相同；表1C中，空白表示和L1型碱基相同。基因位点按照基因1型进行标记排序。
实施例2
DBV各基因型特异性引物位点的建立：
表1实际上是以S1、M1和L1型参照序列为参照，呈现出了其他基因型参照序列的相应特异性突变位点。因此，在表1各突变位点中，可选择一些合适的位点作为后续的特异性引物位点。
首先，在各参照序列中选择了相对序列更短的S1-S6型参照序列，接着通过对各突变位点的特异性和敏感性的考察发现，S1型设计特异性引物位点：第459位点由S2-6型的A突变为G(459A→G)，第586位点由S2-6型的C突变为T(586C→T)；S2型设计特异性引物位点：A→G第1544位点由S1/S3-6型的A突变为G(1544A→G)；S3型设计特异性引物位点：S3型第266位点由S1-2/S4-6型的C突变为T(266C→T)，第466位点由S1-2/S4-6型的T突变为C(466T→C)；S4型设计特异性引物位点：第167位点由S1-3/S5-6型的C突变为T(167C→T),第520位点由S1-3/S5-6型的G突变为A(520G→A)；S5型设计特异性引物位点：第1445位点由S1-4/S6型的G突变为A(1445G→A)；S6型设计特异性引物位点：第646位点由S1-5型的T突变为C(646T→C)。
因此，可从S1-S6型参照序列中的特异性引物位点中选出并确定基因型关键特异性引物位点，如表2所示。
表2各基因型中选出并确定的用于引物设计的特异性引物位点
Figure BDA0004065271830000141
注：表2中，空白表示和S1型碱基相同。
综上，本实施例最终选择并确定的特异性引物位点为：S1型(459A→G，586C→T)，S2型(1544A→G)，S3型(266C→T，466T→C)，S4型(167C→T，520G→A)，S5型(1445G→A)，S6型(646T→C)。
实施例3
DBV各基因型特异性引物的建立：
以实施例2中获得的各基因型特异性引物位点为引物3’端，设计相应的特异性引物，具体如表3所示。
表3各基因型引物序列
Figure BDA0004065271830000142
Figure BDA0004065271830000151
实施例4
PCR扩增试剂盒的构建及使用方法：
一、所述PCR扩增试剂盒用于DBV检测与基因型分型，主要包括PCR缓冲液(5×PrimeStar buffer)、DNA聚合酶(PrimeStar)、dNTP、ddH2O以及P-S1、P-S2、P-S3、P-S4、P-S5、P-S6对应的上、下游引物(如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.15)。为了方便后续使用，本实施例PCR扩增试剂盒还可以包括RNA提取试剂和反转录试剂。
本实施例试剂盒的PCR体系如表4所示。
表4PCR反应体系
cDNA模板 5μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
dNTP(四种dNTP浓度分别为2.5mM) 4μL
5×Prime Star buffer(Mg+Plus) 10μL
Prime Star 0.5μL
注：加ddH2O定容至总体积50μL。
PCR扩增试剂盒的扩增程序为：预变性94℃；94℃30s，60℃(或58，59，62℃)30s，72℃30s；40个循环，72℃延伸10min。
二、本实施例试剂盒的使用方法：
(1)RNA的提取：提取样本中DBV基因组RNA；
(2)cDNA模板的制备：利用反转录试剂将RNA反转录成cDNA；
(3)PCR扩增：将步骤(2)制备的cDNA模板加入到PCR反应体系中，扩增相对应的片段；
(4)结果分析：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，各基因型相对应结果如下：
表5理论上各基因型PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Figure BDA0004065271830000152
Figure BDA0004065271830000161
注：“+”PCR结果阳性，有对应的条带；“-”PCR结果阴性，无对应的条带。
实施例5
本实施例用于验证本发明设计的特异性引物的可行性：
我们将各基因型特异性位点相应的片段合成并插入到质粒中来验证我们设计的特异性引物的可行性。
一、携带扩增片段质粒的制备：
合成S1、S2、S3、S4、S5、S6型全长序列(碱基序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示)，并分别插入到质粒PUC-SP中。
二、利用型特异性引物扩增
以上述质粒作为模板，加入相应的引物进行PCR，具体步骤：PCR反应总体积50μL，其中模板(质粒20pg/μL)5μL，对应的上游和下游引物(10μM)各1μL，dNTP(四种dNTP各2.5mM)4μL，5×Prime Star buffer(Mg2+Plus)10μL，Prime Star(5U/ul)0.5μL，ddH2O定容至总体积50μL。循环参数：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火(引物P-S1，P-S6退火温度59℃；引物P-S2,P-S4,退火温度60℃；引物P-S3退火温度58℃；P-S5退火温度62℃)30s,72℃30s，40个循环，72℃10min延伸。
三、结果分析
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1-6所示。由图1-6可知，本发明基因型特异性引物能够有效准确的扩增出目标条带。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种DBV基因型参照序列，其特征在于，包括S1-S6型参照序列、M1-M6型参照序列以及L1-L6型参照序列；其中，所述S1-S6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.6所示，M1-M6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.12所示，L1-L6型参照序列的碱基分别如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18所示；以S1、M1和L1型参照序列为参照，各基因型特异性位点如表1所示：
表1各基因型参照序列特异性位点
Figure FDA0004065271820000011
Figure FDA0004065271820000021
Figure FDA0004065271820000031
Figure FDA0004065271820000041
Figure FDA0004065271820000051
表1A、1B、1C分别表示DBV的S、M、L片段；表1A中，空白表示和S1型碱基相同；表1B中，空白表示和M1型碱基相同；表1C中，空白表示和L1型碱基相同。
2.一种DBV基因型特异性引物位点，其特征在于，根据权利要求1所述的DBV基因型参照序列，从中选出并确定各基因型特异性引物位点，如表2所示：
表2各基因型中选出并确定的用于引物设计的特异性引物位点
Figure FDA0004065271820000052
表2中，空白表示和S1型碱基相同。
3.根据权利要求2所述的DBV基因型特异性引物位点，其特征在于，最终选择并确定的特异性引物位点为：S1型，459A→G，586C→T；S2型，1544A→G；S3型，266C→T，466T→C；S4型，167C→T，520G→A；S5型，1445G→A；S6型，646T→C。
4.根据权利要求2或3所述的DBV基因型特异性引物位点，其特征在于，各基因型特异性引物位点用于设计相应特异性引物，从而通过PCR来区分不同基因型；具体设计时，以所述各基因型特异性引物位点为引物3’端。
5.一组DBV各基因型特异性引物，其特征在于，分别为P-S1、P-S2、P-S3、P-S4、P-S5、P-S6；所述P-S1为S1反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；所述P-S2为S2反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；所述P-S3为S3反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；所述P-S4为S4反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示；所述P-S5为S5反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示；所述P-S6为S6反应引物，其上、下游引物的序列分别如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示。
6.一种用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，其特征在于，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH2O以及如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.30所示的各特异性引物。
7.根据权利要求6所述的用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶PrimeStar，PCR缓冲溶液为5×PrimeStar buffer。
8.根据权利要求6所述的用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂盒的扩增程序为：预变形94℃；94℃30s，58℃/59℃/60℃/62℃30s，72℃1min；40个循环，72℃延伸10min。
9.一种如权利要求6-8任一所述的用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取DBV基因组RNA；
(2)利用反转录试剂将RNA反转录成cDNA；
(3)将步骤(2)制备的cDNA模板加入到PCR反应体系中，扩增相对应的片段；
(4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
10.一种如权利要求6-8任一所述的用于DBV检测与基因型分型的PCR扩增试剂盒的应用，其特征在于，将所述试剂盒用于DBV的突变研究以及DBV不同基因型的快速诊断。
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