CN102618669A

CN102618669A - 发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环sftsv介导等温扩增快速检测试剂盒及方法

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Publication number: CN102618669A
Application number: CN2012101061836A
Authority: CN
Inventors: 李兵; 黄尉初; 刘元东; 车吉泊; 靳晓红
Original assignee: Centers For Disease Control And Prevention Joint Logistics Department Jinan Military Region Chinese People's Liberation Army
Current assignee: Centers For Disease Control And Prevention Joint Logistics Department Jinan Military Region Chinese People's Liberation Army
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2012-04-12
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-04-12
Also published as: CN102618669B

Abstract

本发明公开了一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，由以下组分组成：(1)10X扩增反应液：2.5μl；(2)25mmol/l dNTP：2μl；(3)F3/B3外引物：各5pmol；FIP/BIP内引物：各40pmol；LF/LB环引物：各20pmol；(4)Bst DNA聚合酶：1μl；(5)反转录酶：1μl；(6)荧光染料：1μl；(7)ddH₂O。使用时，加入待检测者的RNA，扩增后，观察反应体系的颜色变化，并以此判断检测结果。本发明检测试剂盒及检测方法，检测成本低廉、操作方便、检测速度快，实现了高度特异性及与PCR相同的高灵敏度，为发热伴血小板减少综合症的及时诊疗提供科学的依据。

Description

发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，及其使用方法，以及在检测布尼亚病毒中的应用。

背景技术

发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)，目前已被确认为是2004年以来湖北、河南、江苏、浙江等地区高度散发出现的发热伴血小板减少综合征的主要病原体。经国家疾控中心相关研究，该病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒。

与其他布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒相似，SFTSV的基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA片段组成。各片段末端互补。其中大(L)片段全长6368个核苷酸，编码RNA依赖型RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRP)；中(M)片段全长3378个核苷酸，编码一个具有1073个氨基酸的膜蛋白前体，该蛋白前体经宿主细胞蛋白酶修饰，可进一步形成Gn膜蛋白和Gc膜蛋白；小(S)片段全长1744个核苷酸，具有双向读码框，分别编码核蛋白(Nucleocapsid protein，N)和非结构蛋白NSs。目前白蛉属病毒分两个组，一组为人类致病病毒组，如立夫特谷热病毒(Rift Vally Fever Virus)等，另一组为对人类不致病的病毒组，如乌库病毒(Uukuniemi virus)。而SFTSV经分析应属新的第三组病毒。

自2004年以来，我国多省份陆续发生了发热伴出血，白细胞减少及血小板减少，多脏器受损的病例。病人多来自华中山区，农业区，流行时间为每年4到8月份，与节肢动物活动繁殖期相吻合。病例都有明确的蜱虫叮咬历史，其发病死亡率达到12％-30％。在2009年，在河南一份发热伴血小板减少综合征病例标本中分离到一株新型布尼亚病毒。后又在2010年分离到20株同种病毒。经相关基因组生物信息学分析和电子显微镜形态学研究，该新型病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，命名为发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒，即SFTSV。

此外，这类发热伴血小板减少综合症还有另外一种主要病原体，即嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)。嗜吞噬细胞无形体感染产生的症状与SFTSV十分相似，没有典型特征性症状和区别，该无形体感染的发病死亡率达到22％。

目前，这类发热伴出血，白细胞减少及血小板减少的病例，主要就是由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和新型布尼亚病毒SFTSV感染引起。虽然这两种感染在症状表现上没有明显区别，死亡率也都很高，但其对症治疗方法则差别很大。对于嗜吞噬细胞无形体感染，主要应用强力霉素和四环素。而对抗生素和抗病毒药物不敏感。过多使用其他抗生素和抗病毒药物还会造成器官负担加重，脏器受损，病死率上升。对于新型布尼亚病毒SFTSV感染，则应尽早使用利巴韦林等抗病毒药物及抑制后续细菌真菌感染的各类敏感型抗生素配合治疗。

由此可见，对于因这两类病原体感染引起的出血伴血小板减小综合症病例，必须尽可能的以最快速度获得精确的定性诊断结果，这样才能及时为患者制定正确的治疗方案，否则，误诊，延误，就会导致病情的延误和错误的治疗方案，甚至错过治疗时机，造成病人死亡。所以，目前急需能快速、精确的诊断这些主要病原体，尤其是对新型SFTSV病毒进行快速精确诊断的诊断方法，并且要求这种诊断方法操作简便，成本低廉，适于农村，山区等欠发达地区有限的医疗资源和人员、设备条件，还要具有良好的灵敏度和高度的特异性。

根据卫生部2010年发布的《发热伴血小板减少综合征诊疗方案》，我国检测新型布尼亚病毒SFTSV的检测方法主要有：(1)血清中特异性抗体的检测；(2)病原体核酸的PCR检测；(3)病毒分离培养等方法。传统的血清学检测方法和病毒分离培养法。这些检测法本身大都需要数周时间才能获得准确的结果，完全无法及时对发病病患做出及时的诊断，且大都要求据有相当水准的实验技能和一些精密的诊断仪器。因此无法满足在农村，山区等条件艰苦地区开展。此外，由于患者血清中病毒血症的发生要大大早于病毒的特异性抗体的出现，因此相比于传统的血清学检测方案，基于核酸检测的PCR技术可以在更早的阶段对病原体做出精确的诊断。但是，PCR检测技术需要需要昂贵的设备和试剂，荧光定量PCR更是需要昂贵的探针和复杂的操作步骤，对人员的操作水平也有较高的要求，不适于在乡村，山区，县一级卫生院等一线采用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，及其使用方法，以及在检测布尼亚病毒中的应用。本发明的布尼亚病毒SFTSV环介导等温扩增快速检测方法，以低廉的检测成本、方便的操作、快速的检测速度，实现了高度特异性及与PCR相同的高灵敏度，将成为现有检测技术的有力补充，为发热伴血小板减少综合症的及时诊疗提供科学的依据，成为一种有效的诊断检测手段。

本发明是通过以下技术方案实现的：

发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分：

(1)10X扩增检测反应液：扩增检测反应液由水、200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、100mmol/L KCl、80mmol/L MgSO₄、100mmol/L(NH₄)₂SO₄和8mol/L Betaine组成；

(2)25mmol/l dNTP(四种等量的脱氧核糖核酸的混合物)；

(3)扩增检测用引物组：为S片段特异性引物组、L片段特异性引物组或M片段特异性引物组，其中，

S片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示，如表1所示；

L片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示，如表2所示；

M片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示，如表3所示；

表1.针对SFTSV病毒S片段的检测引物：

	引物检测目标：SFTSV病毒S片段
		引物名称	引物序列(5→3)
F3外引物	GCAACCCCAAAAATCCTCTTC
		B3外引物	CAGTTCTCTCTTCCGGTTTCC
FIP内引物	AGCACTCAGTTCTCTCTGGGAGT-AGCTTGAGCCTGGACTTGA
		BIP内引物	AGGTGGCCTAGTGGGAAGCC-CCCAGCTGTTCTTGATGGAG
LF环引物	CCTCATGTCCTTGTAGTACATGTCT
		LB环引物	TCTGTATGGTTCCTACAGGCAGC

表2.针对SFTSV病毒L片段的检测引物：

	引物检测目标：SFTSV病毒L片段
		引物名称	引物序列(5→3)
F3外引物	TGCACCATGCTGAACTCAA
		B3外引物	CATCTTTTGGGGCTTAGGCA
FIP内引物	ACCTGCTCTCTGAGCTCTGAACA-GAGAGAGAAGTTGGGCGTG
		BIP内引物	ACCTTCCTGATCAGTCTGGAGGA-AAAGCCCTCCATCTGGGT
LF环引物	GCTTTCGAACCAGCCATGG
		LB环引物	GACTGAGGAGATCATCACC

[0022] 表3.针对SFTSV病毒M片段的检测引物：

	引物检测目标：SFTSV病毒M片段
		引物名称	引物序列(5→3)
F3外引物	TGGGCAGGTAAGATGGACAG
		B3外引物	GCTCATGGGGTGGAATGTC
FIP内引物	GAAGGGGCCGCATTAAAGCAAC-GGATTCAGTGGCTGCTCTG
		BIP内引物	TGGAAAGTATCTCCATGTGCCGC-CCCTGAGGGCATTGTTAGC
LF环引物	GCTGCTCCTCCACATCCAT
		LB环引物	GTCCCATCAGCAGTTATAG

在SFTSV中三条染色体片段中，S片段的保守程度最高，因此通常选用针对S片段保守序列设计的检测引物组对SFTSV病毒进行检测即可，如出现因病毒在S区段特征识别部位发生突变，使针对S区段的检测引物无法正常工作，就可使用针对L区段或M区段的引物组实施检测，为最大可能的防止假阴性诊断，也可对待检样本做双份平行检测，同时使用S片段和L或M片段对同一份待检样本做双份平行检测，两套引物的检测结果都呈阳性的可确诊为阳性结果，如一套引物的检测结果为阳性，另一套引物的检测结果为阴性，则需要进一步的检测和确认；

(4)Bst DNA聚合酶：8U/μl；

(5)反转录酶：avian myeloblastrosis virus reverse transcriptase 100U/μl；

(6)荧光染料：1/1000倍浓度的SYBR GREEN I荧光染料或3mmol/L羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue，HNB)；

(7)ddH₂O：用于补足反应体系的体积。

上述各组分构成一个反应体系，优选的，其用量为：

(1)10X扩增反应液：2.5μl；

(2)25mmol/l dNTP：2μl；

(3)F3/B3外引物：各5pmol；

FIP/BIP内引物：各40pmol；

LF/LB环引物：各20pmol；

(4)Bst DNA聚合酶：1μl；

(5)反转录酶：1μl；

(6)荧光染料：1μl；

(7)ddH₂O：补足反应体积到20μl。

所述发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒能够用于特异性检测布尼亚病毒，具体应用时，其使用方法为：

(1)以常规RNA提取方法从待检测者血清标本中提取RNA溶液，提取的RNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀应在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μl范围内；

(2)按照试剂盒的配方组成，在冰上，组合成20μl反应体系，然后取上述提取的RNA溶液(作为RNA模板)5μl加入该反应体系中；

(3)上述反应体系置于63℃水浴中恒温反应40±2min；

(4)将水浴温度调整到80℃～85℃，保持3min，使扩增反应终止；

(5)扩增结果的判读：上述扩增反应终止后，观察反应体系的颜色，进行以下判断：

①可见光目视观察：在可见光下观察，若反应体系的颜色变成略混浊的亮绿色，则是阳性；若反应体系的颜色不变，仍保持清澈透明的暗黄色，则为阴性；

或：②紫外线辅助观察：在透射紫外线辅助照射下观察，若反应体系被紫外线激发出明亮的绿色荧光，则是阳性，若反应体系不发出荧光，仍保持清澈透明的暗黄色，则为阴性；

(6)根据以上判断结果，若判断结果为阳性，则证明待检测者血清标本中含有浓度大于10copy/μl的SFTSV病毒S/L/M片段(具体视检测时选用的引物组是针对S片段、L片段还是M片段的特异性引物组而定)；若检测结果为阴性，则证明待测血清标本中不含有SFTSV病毒或SFTSV病毒的浓度低于10copy/μl的水平。

本发明的检测特异性经特异性检测实验、大量的临床血清样本检测实验和统计学计算，达到100％。本发明的主要原理为：

(1)针对特征保守序列设计了全套检测引物：分别以SFTSV病毒L片段、M片段、S片段上的高度保守序列为检测目标，各设计了一套特异性引物组，每套引物组内含6条引物(包括F3/B3外引物、FIP/BIP内引物、LF/LB内引物)，用于识别检测目标片段序列上的8段特征序列(分别是F3c/B3c片段、F2c/B2c片段、F1/B1片段、LFc/LBc片段)。由于本检测方法为引物组内的6条引物针对8段目标序列进行共同识别后才能启动扩增反应，因此其检测特异性比基于PCR技术的检测法更高。此外，实际上每一套引物都可以独立完成检测，且都获得了高特异性和高灵敏度，但为了增大本检测方法的适应性，防止SFTSV病毒可能出现的基因序列的变异，就针对对SFTSV基因组上所有三个片段(L/M/S片段)都分析确定出了保守序列区域，然后针对这些保守序列设计出了宽适应性引物组；在实际应用时，仅使用其中的一个引物组即可完成检测。

(2)环介导扩增反应机制为：如果引物组内所有引物都与目标靶片段实现特异性结合，则在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下，链置换延长反应就得以启动，释放出单链DNA，随即成为进一步的DNA合成的模板，并形成初始的茎环DNA结构。随后，一系列的链置换反应和颈环结构逐次启动，实现了高速的特征性DNA扩增。极微量的模板DNA可以在很短时间内，模板量可达到10⁹拷贝数的数量级。整个反应过程都在60℃-65℃内的恒温条件下进行。

(3)通过在反应体系中添加荧光染料，使扩增检测的结果可以通过肉眼直接观察：在反应体系中添加1/1000倍浓度的SYBR GREEN I荧光染料或3mmol/L羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue，HNB)，则随着特异性扩增反应的进行，双链DNA等扩增产物不断积累，这些积累的扩增反应产物可以使SYBR GREEN I染料在可见光下由暗黄色变为亮绿色，颜色变化显著，因此本检测方法的检测结果可在可见光下直接由肉眼判断反应结果。

附图说明

图1a：以特异性检测S片段的引物组实施的RT-LAMP检测，模板浓度从10⁴ TCID₅₀ml^-1到10¹TCID₅₀ml^-1系列稀释液结果示意图。

图1b：模板浓度从10⁴ TCID₅₀ml^-1到10¹ TCID₅₀ml^-1系列稀释液采用实时荧光定量RT-PCR技术结果示意图。

图1c：以特异性检测M片段的引物组实施的RT-LAMP检测，模板浓度从10⁴ TCID₅₀ml^-1到10¹TCID₅₀ml^-1系列稀释液结果示意图。

图1d：以特异性检测L片段的引物组实施的RT-LAMP检测，模板浓度从10⁴ TCID₅₀ml^-1到10¹TCID₅₀ml^-1系列稀释液结果示意图。

用于检测的标本是从SFTSV strain JN001培养物提取的病毒RNA，并对标本浓度进行10倍系列稀释，使标本浓度范围为：10⁴ TCID50ml^-1-10^-1TCID50ml^-1。(Negative control)阴性对照：本实验以未感染SFTSV病毒的Vero cell中抽提的总RNA作为阴性对照。

图2：检测临床血清样本结果照片，图中1、2、3号反应管检测的标本为SFTSV阳性血清标本，4、5、6号标本为密切接触者血清标本，7号是Vero cell阴性对照；经63℃恒温反应30min后，反应管颜色变成亮绿色的为阳性结果，反应管颜色仍保持暗黄色的为阴性结果。

图3：FDR-RT-LAMP法验证特异性示意图，其中，1#-JN001，2#-JN002，3#-JN003，4#-JN004，5#-JN005，6#-JN006，7#-JN007，8#-肾综合症出血热病毒I型，9#-综合症出血热病毒II型，10#-黄热病毒，11#-日本脑炎病毒，12#-人类肠病毒71型，13#-柯萨奇病毒A16， 14#-甲型流感，15#-甲型H1N1，16#-甲型流感H3，17#-乙型流感(Yamagata)，18#-乙型流感(Victoria)，19#-轮状病毒，20#-阳性对照E，21#-阴性对照(Vero cell)。

具体实施方式

下面结合实验和实施例对本发明作进一步的说明。

实验对本发明的检测方法的检测灵敏度、检测特异性、临床标本检测应用的验证和评估

所使用的试剂盒配方为：

(1)10X扩增反应液：2.5μl；

(2)25mmol/l dNTP：2μl；

(3)F3/B3外引物：各5pmol；

FIP/BIP内引物：各40pmol；

LF/LB环引物：各20pmol；(针对S、L、M片段的引物序列分别如表1、表2、表3所示)

(4)Bst DNA聚合酶：1μl；

(5)反转录酶：1μl；

(6)荧光染料(1/1000 SYBR GREEN I)：1μl；

(7)ddH₂O：补足反应体积到20μl。

使用方法为：

(2)按照试剂盒的配方组成，在冰上，组合成20μl反应体系，然后取上述提取的RNA溶液作为RNA模板5μl加入该反应体系中；

(3)上述反应体系置于63℃水浴中恒温反应40min；

(6)根据以上判断结果，若判断结果为阳性，则证明待检测者血清标本中含有浓度大于 10copy/μl的SFTSV病毒S/L/M片段；若检测结果为阴性，则证明待测血清标本中不含有SFTSV病毒或SFTSV病毒的浓度低于10copy/μl的水平。

一、检测特异性的验证评估

使用上述检测试剂盒检测SFTSV病毒的特异性验证的具体结果如下(1)-(3)：

(1)所用检测病毒株

待检阳性毒株：SFTSV病毒毒株7株：(JN001到JN007)(注：该编号是济南市疾控中心分离到的发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的编号，该7株病毒经国家疾控中心配发的荧光定量PCR方法确认)。

待检阴性毒株：阴性对照病毒株12株：肾综合症出血热病毒I型HFRSV(strain Z10)，综合症出血热病毒II型HFRSV(strain Z37)，黄热病毒(strain 17D)，日本脑炎病毒(strain SA14-14-2)，人类肠病毒71型(HEV71/Jinan035/SD/CHN/2011(C4))，柯萨奇病毒A16(COXA16/Jinan034/SD/CHN/2011(B1))，甲型流感(A/ShandongTianqiao/11716/2011(H1))，甲型H1N1(A/ShandongTianqiao/SWL192/2011(H1N1))，甲型流感H3(A/ShandongTianqiao/1188/2011(H3N2))，乙型流感(B/ShandongZhangqiu/1100/2011(Yamagata))，乙型流感(B/ShandongZhangqiu/1171/2011(Victoria))，轮状病毒(strain LLR)，如表4所示。

表4

肾综合症出血热病毒I型(strain Z10)	(疫苗株)浙江天元生物6.0lg CCID50ml^-1
		肾综合症出血热病毒II型(strain Z37)	(疫苗株)浙江天元生物6.0lg CCID50ml^-1
黄热病毒(strain 17D)	(疫苗株)北京天坛生物≥3.66LogLD50
		日本脑炎病毒(strain SA14-14-2)	武汉生物制品研究所≥5.7LogPFU ml^-1
人类肠病毒71型(HEV71/Jinan035/SD/CHN/2011(C4))	10^6.5TCID50ml^-1
		柯萨奇病毒(A16COXA16/Jinan034/SD/CHN/2011(B1))	10^6.1TCID50ml^-1
甲型流感(A/ShandongTianqiao/11716/2011(H1))	10^4.8TCID50ml^-1
		甲型H1N1(A/ShandongTianqiao/SWL192/2011(H1N1))	10^6.0TCID50ml^-1
甲型流感H3(A/ShandongTianqiao/1188/2011(H3N2))	10^5.9TCID50ml^-1
		乙型流感(B/ShandongZhangqiu/1100/2011(Yamagata))	10^4.7TCID50ml^-1
乙型流感(B/ShandongZhangqiu/1171/2011(Victona))	10^5.2TCID50ml^-1
		轮状病毒(strain LLR)	(疫苗株)兰州生物制品研究所滴度10^5.5CCID50ml^-1

在本测试的所有病毒滴度均大于或等于10³ TCID₅₀ml^-1。

(2)采用目视反应液颜色变化法和琼脂糖凝胶电泳的方法确定RT-LAMP结果终点。

(3)结果显示该LAMP检测试剂可有效的鉴别出阳性毒株(JN001 to JN007)，而12株非SFTSV毒株检测结果均为阴性，如见图3所示(无论试剂盒中的引物是针对S片段的，还是针对L片段、M片段的，因为是颜色反应，结果都相同)，图中，1#-JN001，2#-JN002，3#-JN003，4#-JN004，5#-JN005，6#-JN006，7#-JN007，8#-肾综合症出血热病毒I型，9#-综合症出血热病毒II型，10#-黄热病毒，11#-日本脑炎病毒，12#-人类肠病毒71型，13#-柯萨奇病毒A16，14#-甲型流感，15#-甲型H1N1，16#-甲型流感H3，17#-乙型流感(Yamagata)，18#-乙型流感(Victoria)，19#-轮状病毒，20#-阳性对照E，21#-阴性对照(Vero cell)。

二、对检测灵敏度的验证评估：

为验证本发明检测方法的灵敏度，使用已知滴度的病毒标本经10倍系列稀释制成梯度标准浓度标本，使用本发明的检测法检测这些标本，以确定本发明的检测法的检测灵敏度范围。为评估和比较本检测方法的灵敏度，另使用国家疾控中心公布的SFTSV荧光定量PCR检测法对同批的梯度标准浓度标本进行检测，并与本发明的方法比较了检测灵敏度。

使用上述检测试剂盒检测SFTSV病毒的灵敏度试验验证的具体结果如下(1)-(4)：

(1)标本中待测RNA溶液的制备

待检标准液：选取浓度为10⁴ TCID₅₀ml^-1的SFTSV毒株JN001，提取病毒RNA 10倍系列稀释，作为标准液。

LAMP反应阴性对照：分离培养病毒毒株时使用的Vero细胞系培养物上清液。

所有样本都使用普通RNA样本提取试剂盒提取。比如使用ROCHE公司High Pure Viral RNA kit(ROCHE，Mannheim，Germany)提取样品RNA。经提取的RNA样品液OD₂₆₀/OD₂₈₀达到1.8，浓度达到20ng/μl。

(2)本发明的LAMP检测法的反应条件及检测结果的实时监测：

为更准确的监测本检测方法的检测反应过程，在LAMP反应体系中添加荧光染料，在荧光定量PCR仪上进行LAMP反应并监测反应体系的荧光强度变化。具体实施方法是：在Stratagene公司MX3005P型荧光定量PCR仪(美国Agilent公司)上进行SFTSV标本检测，在上述配方中加入1μl 1/1000的SYBR GREEN I(TIANGEN，北京，中国)溶液，选取FAM通道。参数设置如下：63℃1分钟，循环数40。在每个周期结束时读取荧光信号，实时监测反应过程。阳性反应的判断标准是：1)在40个循环之内，扩增曲线以指数增长形式越过基准线时，即确定为阳性反应，以CT值确定阳性检出时间。2)反应结束，按照本发明描述的结果判断方法，由目视观察反应溶液的颜色变化，如反应溶液由暗黄色变为亮绿色，则为阳性反应。

(3)国家疾控标准荧光定量PCR方法检测法检测试剂待检标准液

(A)国家疾控公布SFTSV荧光定量PCR引物序列，如表5所示。

表5

	引物检测目标：SFTSV病毒S片段
			引物名称	引物序列(5→3)	备注
S-F-3	GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA	1104-1125
			S-R-3	TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT	1155-1178
S-Probe-3	FAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ-1	1127-1148

(B)国家疾控公布SFTSV荧光定量RT-PCR反应体系

使用QIAGEN公司的一步法荧光定量PCR试剂盒(QuantiTect Probe RT-PCR Kit)

2X扩增反应液： 12.5μl

S-F-3引物：加入40pmol每反应体系。

S-R-3引物：加入40pmol每反应体系。

S-Probe探针：加入10pmol每反应体系。

QuantiTect RT Mix酶混合液： 0.5μl

病毒提取液(或稀释液)： 5μl

ddH₂O：补足反应体积到25μl

(C)反应条件

(4)结果对比

实验证明，RT-LAMP检测试剂S片段的检测限为101TCID₅₀ml^-1(图1a)，RT-LAMP检测试剂M片段的检测限为10¹TCID₅₀ml^-1(图1c)RT-LAMP检测试剂L片段的检测限为10¹TCID₅₀ml^-1(图1d)。该灵敏度范围与国家疾控公布的SFTSV实时荧光定量RT-PCR的灵敏度范围(图1b，约10TCID₅₀ml^-1)(Sun等人2011年)无显著差异。因此，根据该实验结果可知，本发明的SFTSV RT-LAMP检测法检测灵敏度与SFTSV实时荧光RT-PCR检测的灵敏度一致，高于其它普通PCR检测方法的灵敏度。

三、对临床样本的检测能力的验证评估

为验证本发明的SFTSV LAMP检测法对临床标本的实际检测性能，使用本发明描述的检测试剂和方法对临床血清标本进行检测，并对检测结果进行了评估。具体结果如下：

使用本发明描述的RT-LAMP试剂对53份临床血清标本和10份健康人血清标本进行了检测。

反应条件是：在63℃等温条件下的孵育30分钟，直接以目视观察法判断检测结果。

临床血清标本检测结果：

本检测方法的灵敏度为90％，其中20份阳性标本的检测结果为18份阳性，2份阴性。其中这2份假阴性标本分别是在发病后13天和15天采集的血样，因此可能是由于病毒浓度已低于检测限而呈假阴性结果；

在该测试中，本检测方法的特异性为100％，43份阴性标本的检测结果全为阴性，无假阳性结果；

SFTSV LAMP检测诊断准确率为96.83％。在所有43个非SFTSV标本的检测中均无假阳性扩增，证明了本方法的高度特异性。本检测法的阴性预测值(NPV)为95.56％，阳性预测值(PPV)为100％。

总结：

本发明针对新型布尼亚病毒SFTSV的基因组片段(L/M/S)上的保守区域分别设计了3套引物组，所有这些保守区域都是SFTSV各毒株所共有的。因此，在实际检测中，可选用其中的任意一套引物组用于检测临床血清标本中含有的SFTSV病毒。本检测方法采用环介导等温扩增技术(LAMP)为扩增技术，检测特异性强，并且具有与PCR检测法相同的高灵敏度。本检测法不需昂贵的PCR仪器或其他精密设备。只需一台水浴锅就可完成精密的核酸检测实验。其检测结果在荧光染料的辅助下，可由肉眼直接读取，不需任何专门仪器，也无需再次打开反应管。快捷，简便，也避免了二次开盖检测造成的污染。非常适合在基层医疗机构和野外作业。如果本方法得以广泛采用，则相当于把高灵敏度，高特异性的核酸检测能力直接送入乡村，山区等蜱传疾病高发地区，而且本方法操作简便，成本低廉，速度快，可以让疑似患者在第一时间就能获得正确的诊断，直接指导采取正确的救治措施，大大降低因误诊，拖延等造成的发病致死率。

实施例应用实例

按下列配方配置SFTSV病毒环介导等温扩增反应体系：

把离心管放置在冰上，然后依次加入如下试剂：

10X扩增反应液：2.5μl；

25mmol/l dNTP：2μl；

F3/B3外引物：各加入5pmol每反应体系。如选择检测SFTSV基因组的S片段，则外引物序列为：

F3：5-GCAACCCCAAAAATCCTCTTC-3；

B3：5-CAGTTCTCTCTTCCGGTTTCC-3；

引物纯度为普通Desalting级。如选择检测L片段、M片段，其序列如表2、表3所示，下同。

FIP/BIP内引物：各加入40pmol每反应体系。如选择检测SFTSV基因组的S片段，则内引物序列为：

FIP：5-AGCACTCAGTTCTCTCTGGGAGT-AGCTTGAGCCTGGACTTGA-3；

BIP：5-AGGTGGCCTAGTGGGAAGCC-CCCAGCTGTTCTTGATGGAG-3；

引物纯度为普通Desalting级。

LF/LB环引物：各加入20pmol每反应体系。如选择检测SFTSV基因组的S片段，则环引物序列为：

FIP：5-CCTCATGTCCTTGTAGTACATGTCT-3；

BIP：5-TCTGTATGGTTCCTACAGGCAGC-3；

引物纯度为普通Desalting级。

然后按照如下程序进行检测：

(1)血清标本中待测RNA溶液的提取

待检阳性血清样本：样本已经济南市疾病预防控制中心检验确认为SFTSV病毒感染阳性。

待检阴性血清样本：样本经济南市疾病预防控制中心根据卫生部颁布的SFTSV病毒诊疗方案检测，确认为SFTSV阴性。

LAMP反应阳性对照：SFTSV病毒PJN001毒株。由济南市疾病预防控制中心分离、保存。

所有样本都使用普通RNA样本提取试剂盒提取。比如使用ROCHE公司High Pure Viral RNAkit(ROCHE，Mannheim，Germany)提取样品RNA。经提取的RNA样品液OD₂₆₀/OD₂₈₀达到1.8，浓度达到20ng/μl。

(2)装填反应体系

将上述抽提的RNA样本液各取5μl，分别加入各反应管中。

再向各反应管中加入：

Bst DNA聚合酶：1μl；

反转录酶：1μl；

荧光染料(1/1000 SYBR GREEN I)：1μl。

再加入ddH₂O把反应体系的体积补足到25μl。

(3)进行SFTSV新型布尼亚病毒的环介导等温扩增

将所有反应管放入65℃恒温水浴中，计时40min，时间到，将恒温水浴调整到85℃，保持3min，终止反应。

(4)显色检测

取出反应管，在可见光下直接用肉眼目视观察各反应管颜色变化。阳性对照管应变为略混浊的亮绿色。阴性对照管颜色不发生变化，仍保持清澈的暗黄色。

结果：所有阳性血清样本检测管变为略混浊的亮绿色，证实为SFTSV病毒阳性。所有阴性血清样本检测管颜色不发生变化，仍保持暗黄色，证实为SFTSV病毒阴性，如表6所示(无

论试剂盒中的引物是针对S片段的，还是针对L片段、M片段的，结果都相同)。

表6 RT-LAMP测试剂检测临床血清标本结果评价

a，‘PJN’SFTS疑似患者

b，‘M’密切接触者

c，‘D’健康对照。

Claims

1.发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下组分：

(1)10X扩增检测反应液：扩增检测反应液由水、200mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl、80mmol/L MgSO₄、100mmol/L(NH₄)₂SO₄和8mol/L Betaine组成；

(2)25mmol/l dNTP；

S片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；

L片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示；

M片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13～18所示；

(4)Bst DNA聚合酶：8U/μl；

(5)反转录酶：avian myeloblastrosis virus reverse transcriptase 100U/μl；

(6)荧光染料：1/1000 SYBR GREEN I或HNB dye；

(7)ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于：所述各组分构成一个反应体系，其用量为：

(1)10X扩增反应液：2.5μl；

(2)25mmol/l dNTP：2μl；

(3)F3/B3外引物：各5pmol；

FIP/BIP内引物：各40pmol；

LF/LB环引物：各20pmol；

(4)Bst DNA聚合酶：1μl；

(5)反转录酶：1μl；

(6)荧光染料：1μl；

(7)ddH₂O：补足反应体积到20μl。

3.权利要求1或2所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒在特异性检测布尼亚病毒中的应用。

4.权利要求1或2所述的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤如下：

(2)按照试剂盒的配方组成，在冰上，组合成20μl反应体系，然后取上述提取的RNA溶液5μl加入该反应体系中；

(3)上述反应体系置于63℃水浴中恒温反应40±2min；

(6)根据以上判断结果，若判断结果为阳性，则证明待检测者血清标本中含有浓度大于10copy/μl的SFTSV病毒S/L/M片段；若检测结果为阴性，则证明待测血清标本中不含有SFTSV病毒或SFTSV病毒的浓度低于10copy/μl的水平。