CN102816857A

CN102816857A - 一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒

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Publication number: CN102816857A
Application number: CN2012103268268A
Authority: CN
Inventors: 李旭新; 杨玉芬
Original assignee: TRIPLEX INTERNATIONAL BIOSCIENCES (CHINA) CO Ltd
Current assignee: TRIPLEX INTERNATIONAL BIOSCIENCES (CHINA) CO Ltd
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2012-12-12

Abstract

一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，主要包括PCR反应试剂和DNA提取试剂，其要点在于所述PCR反应试剂包括：1）特异性扩增梅毒螺旋体核酸的上游外引物，其碱基序列为：5’-GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT-3’；2）特异性扩增梅毒螺旋体核酸的下游外引物，其碱基序列为：5’-CCGACTTCAATACGGAGTTCAC-3’；3）用于检测梅毒螺旋体核酸的探针，其碱基序列为：5’-ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG-3’；所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。本发明具备高灵敏度、高特异性、高通量等优点，能快速准确检测出梅毒螺旋体，适用于临床应用。

Description

一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒。

背景技术

梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)属于密螺旋体属苍白螺旋体的苍白亚种（Treponema pallidum subsp. pallidum），是引起人类梅毒的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体。一经传染，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯人体各器官，表现多种多样的类似很多疾病的临床表现，同时常时隐时现，病情变化难测，很容易造成误诊和漏诊。梅毒的传染途径有直接接触、间接接触和胎盘传染三种，其中性直接接触传染是梅毒传染的主要途径。此外，由胎盘传染导致的先天梅毒也正日益引起国家的关注。

最早发现和论述梅毒病人的是在北美。1505年经印度传入我国广东，至今已500多年。解放前是中国四大性病之首，60年代初基本被消灭，80年代再次发生和流行。90年代末以来，全国梅毒报告病例数明显增加，流行呈现快速上升趋势。据中国CDC性病控制中心统计数据显示，1999年报告病例80406例，年发病率为6.50/10万，2009年报告病例327433例，年发病率为24.66/10万，发病率年均增长14.3%。1997年先天梅毒报告病例数为109例,报告发病率为0.53/10万活产数，2009年报告病例数为10757例，报告发病率为64.41/10万活产数，发病率年均增长49.2%。2009年，梅毒报告病例数在我国甲乙类传染病报告中居第三位。

根据疾病的特点和经过，一般分为一期、二期和三期(晚期)梅毒。一期与二期梅毒传染性强，又称为早期梅毒，一般多在感染梅毒2年内。病期在2年以上者，临床为三期梅毒，几乎无传染性，但破坏性强，亦称晚期梅毒。一般梅毒的潜伏期为2～4周。

梅毒螺旋体的基因是由113.8万个碱基对组成的环状DNA，含有1041个开放读码框架（ORFs），55%的ORFs有生物学功能。早期针对梅毒螺旋体的基因检测，其靶基因主要集中在tmp基因、tpf-1基因、47KD外膜蛋白基因、bmp基因以及16S rRNA等。但是这些基因的大部分序列与其他微生物具有一定的同源性且功能不明，扩增时常出现非特异性产物，故运用这些靶基因的特异性和敏感度较低。

通过与其他微生物polA基因的同源性进行比较分析，可以发现梅毒螺旋体的polA基因非常独特，所编码的半胱氨酸多达24个，占polA酶氨基酸总数的2.4%，而绝大多数的微生物只有1~2个，只占0.1%。且对梅毒螺旋体的polA基因的序列进行分析，发现其中有4个特殊的插入点。因而，TP-polA基因具有较高的特异性和敏感性。

临床梅毒的初筛方法是血清学检测。但是人体感染梅毒要4～10周才可产生一定数量的抗体，使得血清学检测早期梅毒的检出率偏低。由于PCR反应的高灵敏度，使得采用基因诊断早期梅毒具有很大的优势，有报导感染后10天左右皮损刚一出现即可检出阳性，目前PCR法诊断一期梅毒的灵敏度是数种临床检测方法中最高。PCR检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法，能够很好地补充血清学方法的不足之处。

梅毒的血清学诊断对确定感染及治疗很有意义，但对早期梅毒诊断不敏感，对先天性及神经性梅毒的诊断不够特异。Burstain和Grimprel等人将PCR技术用于先天梅毒的诊断中，发现其敏感性和特异性均优于血清学方法。高度敏感性使PCR方法尤其适用于微量梅毒螺旋体的检测如先天梅毒、神经梅毒；良好的特异性使PCR技术在梅毒和其它螺旋体感染的鉴别诊断、梅毒螺旋体的病原学研究方法具有重要作用；艾滋病患者感染梅毒后可出现多种异常的免疫学变化，对梅毒的血清学反应延迟出现甚至完全消失，此时应用PCR方法检测组织中病原体将显示出独特价值。但PCR方法并不能取代梅毒的血清学反应，若病人下疳愈合，血清学反应阳性时无需再做PCR检测。

目前临床上对梅毒螺旋体的检测主要采用暗视野显微镜检查、血清学方法（包括非梅毒螺旋体抗原血清学试验和梅毒螺旋体抗原血清学试验）和基因诊断试验。

（1）暗视野显微镜检查法：该方法可直接观察到病灶分泌物中的梅毒螺旋体。对一期和二期梅毒的皮肤黏膜损害及淋巴结病变具有快速、简便和可靠的诊断价值，是性病实验室常用的方法，但由于要求严格的技术和敏感性较低而限制其应用。并非所有梅毒的病期中都能找到梅毒螺旋体，如果阴性，也不能完全排除梅毒。

（2）非梅毒螺旋体抗原血清学试验：由于操作简便，该方法常作为临床梅毒的初筛方法，其中以快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)为代表。RPR是80年代问世的非特异性梅毒血清学试验，所用抗原为标准的牛心肌脂抗原，该方法操作简便、迅速，适用于大量标本检测。该方法的缺点是当抗体含量过高时，易出现假阴性，即前带现象，还易出现生物学假阳性反应。对潜伏期梅毒、神经梅毒不敏感。

（3）梅毒螺旋体抗原血清学试验：由于非梅毒螺旋体抗原血清学试验的局限性，临床上常采用梅毒螺旋体抗原血清学试验作为确认试验。该方法检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体，该抗体即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应持续存在阳性，因此，不能用于观察疗效。

发明内容

本发明的目的是采用实时荧光PCR技术，针对梅毒螺旋体基因组中的DNA聚合酶基因的保守区域，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测梅毒螺旋体基因片段，提供一种能快速准确检测出梅毒螺旋体，适用于临床应用的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒。

本发明的技术方案为一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，主要包括PCR反应试剂和DNA提取试剂，其要点在于所述PCR反应试剂包括：

1）特异性扩增梅毒螺旋体核酸的上游外引物，其碱基序列为5’- GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’；

2）特异性扩增梅毒螺旋体核酸的下游外引物，其碱基序列为5’- CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’；

3）用于检测梅毒螺旋体核酸的探针，其碱基序列为5’- ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’；

所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

本发明采用基因诊断试验检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强、敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。PCR法诊断一期梅毒的灵敏度最高，这是因为人体感染梅毒要4～10周才可产生一定数量的抗体，而特异性抗体比非特异性抗体早1周出现。PCR检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法，能够很好地补充血清学方法的不足之处。

在本试剂盒中，采用一对TP特异性引物扩增TP基因组部分片段，该片段为梅毒螺旋体基因组的保守区域，再在该保守区域内，设计一条特异片段的探针，并进行荧光素标记。在含目的基因的PCR反应中，该探针会被Taq DNA聚合酶分解，释放出荧光信号。利用荧光PCR对荧光信号的检测，实现对TP基因的检测。

本发明的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，引入了一个人工构建的用于避免检测结果假阴性的内参照系统，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，包括：

1）上游引物，其碱基序列为5′- CGTCGCTGGAGCTGGTTTA -3′；

2）下游引物，其碱基序列为5′- GGCGGTTTGTCAAGCTGAT -3′；

3）荧光探针，其碱基序列为5′- CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3′。

在试剂盒设置了内参照，拟南芥基因即为SUC基因，SUC基因是一段与人及梅毒螺旋体无关的基因，因此可作为内参照以检测每次PCR（聚合酶链式反应）反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保 PCR 结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示没有PCR抑制物存在，PCR反应体系以及操作正常，表示此次实验结果可信，此时目的基因结果为阳时表示样本含有梅毒螺旋体，目的基因结果为阴时表示样本不存在梅毒螺旋体；当内参照结果为阴，目的基因结果为阳时，PCR反应体系以及操作都是正常的，表示此次实验结果可信，样本含有梅毒螺旋体，而此时若目的基因为阴，则说明该次PCR反应中存在PCR抑制物，此次实验结果不可信，该实验视为无效，需再重复。

所述荧光染料为FAM、JOE或HEX，所述淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2或TAMRA。

所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，探针为Taqman或MGB探针。

荧光PCR是在引物特异的基础上采用模版序列特异的荧光探针进一步提高PCR检测的专一性，每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。同时利用荧光共振能量转移的原理，使得PCR的检测灵敏度得极大的提高。

梅毒螺旋体核酸检测试剂盒上游引物的浓度为5-20μM，下游引物的浓度为5-20μM，探针的浓度为5-20μM。

所述PCR反应试剂还包括每人份：25μL纯水、5μL 10倍PCR 缓冲液、7μL 20-40mM 的MgCl2，1μL 10mM 的dNTP、1μL 4-6U/μL 的Taq酶和1μL 0.5-1.5U/μL 的UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP，并且为dATP:dCTP:dGTP:dUTP=1:1:1:2配制。所述的10倍PCR 缓冲液是指称取18.171-30.285gTris和48.425-70.775gKCL，加入700-800mL去离子水并搅拌均，待所有固体溶解后，使用盐酸调节pH值至8.5-8.9，去离子水定容至1000mL的混合液。

所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒DNA提取试剂包括提取液A和提取液B，其中：

所述DNA提取试剂包括提取液A和提取液B，其中：

所述提取液A的制备方法为：取684-1368g蔗糖,7.874-10.297g三羟甲基氨基甲烷（Tris）,250-350mL聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）,混合均匀，盐酸调pH值为7.5-8.0，纯水定容至3000mL，取每人份3mL；

所述提取液B的制备方法为：取0.05-0.15g聚苯乙烯基体离子交换树脂(Chelex100)，0.25-0.75mL TritonX-100，0.04-0.08g Tris，盐酸调pH值为7.8-8.3，纯水定容至50mL，取每人份0.05mL 。

所述试剂盒还包括梅毒螺旋体核酸检测的阳性质控品和阴性质控品。

所述阳性质控品的制备方法为：a)收集测序检测为TP阳性的样本，b)经PCR扩增和T载体克隆获得质粒，c)将该质粒转化入大肠杆菌中，d)菌株培养，e)离心收集大肠杆菌细胞， f）用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×10⁷copies/ml作为试验用阳性质控品。

所述阴性质控品的制备方法为：a)将空白T载体转化入大肠杆菌中，b)菌株培养，c)离心收集大肠杆菌细胞。d) 用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×10⁷copies/ml，作为试验用阴性质控品。

本发明的有益效果为利用梅毒螺旋体核酸中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断梅毒螺旋体的存在。本试剂盒具有设计合理，技术可行；质量控制体系稳定可靠；产品稳定性能良好，检测所需模板量少，检测结果可靠准确，具有较高的临床应用价值。灵敏度和特异性高。最低检出限为5.0×10²copies/mL。使用了拟南芥内参照系统它在梅毒螺旋体基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

图1为最低检测量参考品TS1-TS6的PCR扩增曲线

图2为精密度参考品TP1的PCR扩增曲线

图3为精密度参考品TP3的PCR扩增曲线

图4为强阳性参考品TP1-TP2的PCR扩增曲线

图5为弱阳性参考品TP3-TP4的PCR扩增曲线

图6为阴性参考品TN1-TN4的PCR扩增曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本行业技术人员更理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

本产品的主要技术原理是将荧光PCR技术和dUTP-UNG防污染技术相结合的基因检测技术，该方法具有快速、灵敏、准确、稳定等特点。

荧光PCR是在引物特异的基础上采用模版序列特异的荧光探针进一步提高PCR检测的专一性，每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。同时利用荧光共振能量转移的原理，使得PCR的检测灵敏度得极大的提高。检测探针一般是Taqman或MGB 探针。

一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，主要包括PCR反应试剂和DNA提取试剂，所述PCR反应试剂包括：

1）特异性扩增梅毒螺旋体核酸的上游外引物，其碱基序列为:

5’- GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’；

2）特异性扩增梅毒螺旋体核酸的下游外引物，其碱基序列为:

5’- CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’；

3）用于检测梅毒螺旋体核酸的探针，其碱基序列为:

5’- ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’；

所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。所述荧光探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，所述荧光报告基团为FAM、JOE或HEX，所述淬灭荧光基团为BHQ1、BHQ2或TAMRA。所述探针为Taqman或MGB探针。

dUTP-UNG防污染技术的原理是：在PCR反应液中用dUTP代替dTTP，使PCR产物中掺入大量dU。利用UNG酶可分解含UTP的单或双链DNA，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用的性质，在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。该技术可有效地消除或减弱因PCR产物污染造成的假阳性。

本试剂盒中引入了一个人工构建的用于避免检测结果假阴性的内参照系统，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，包括：

1）上游引物，其碱基序列为5′- CGTCGCTGGAGCTGGTTTA -3′；

2）下游引物，其碱基序列为5′- GGCGGTTTGTCAAGCTGAT -3′；

3）荧光探针，其碱基序列为5′- CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3′。

内参照原理：试剂盒设置了内参照，该内参照为含拟南芥基因（SUC基因）的质粒，SUC基因是一段与人及梅毒螺旋体无关的基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保 PCR 结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了；但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。

本试剂盒中的DNA提取试剂包括提取液A和提取液B，其中：

本试剂盒中还包括梅毒螺旋体核酸检测的阳性质控品和阴性质控品。

阳性质控品的制备方法为：a)收集测序检测为TP阳性的样本，b)经PCR扩增和T载体克隆获得质粒，c)将该质粒转化入大肠杆菌中，d)菌株培养，e)离心收集大肠杆菌细胞，f）用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×107copies/ml作为试验用阳性质控品。

阳性对照原理：每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。

阴性质控品的制备方法为：a)将空白T载体转化入大肠杆菌中，b)菌株培养，c)离心收集大肠杆菌细胞。d) 用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×107copies/ml，作为试验用阴性质控品。

阴性对照原理：为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。

实施例1

表1：试剂盒组成

提取液A的制备方法为：取684g蔗糖,7.874g三羟甲基氨基甲烷（Tris）,250mL聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）,混合均匀，盐酸调pH值为7.5-8.0，纯水定容至3000mL，取每人份3mL；

提取液B的制备方法为：取0.05g聚苯乙烯基体离子交换树脂(Chelex100)，0.25mL TritonX-100，0.04g Tris，盐酸调pH值为7.8-8.3，纯水定容至50mL，取每人份0.05mL 。

表2：TP-PCR反应液配方

序号	组分	初浓度	数量
				1	纯水	-	25μL
2	PCR buffer	10x	5μL
				3	MgCl₂	25mM	7μL
4	dNTP	-	1μL
				5	L-pri-T1	10μmol	1μL
6	L-pri-T2	10μmol	1μL
				7	L-pri-I1	10μmol	0.5μL
8	L-pri-I2	10μmol	0.5μL
				9	L-pro-T1	10μmol	1μL
10	L-pro-I1	10μmol	0.5μL
				11	IC Template	5.0x10³copies/mL	0.5μL
12	总量	-	43μL

取一只配液瓶，按配制单上每种试剂的量乘以配制人份数，混合均匀。使用单通道移液器将上述TP-PCR反应液按1032μL/管分装。分装1000人份TP-PCR反应液约需要1小时。

表3：酶系配制单

试剂	浓度	用量（μL/1人份）
			Taq DNA聚合酶	5U/μL	1
UNG酶	1U/μL	1
			总量		2

取一只配液瓶，按配制单上每种试剂的量乘以配制人份数，混合均匀。使用单通道移液器将上述酶系按96μL/管分装。分装1000人份酶系约需要1小时。

表4：核酸提取试剂配制单

表5：核酸提取试剂分装单

	分装量（mL/管）
		提取液A	72
提取液B	1.2

取若干配液瓶，按配制单上各种提取液的配方配制，混合均匀。使用单通道移液器将上述各种提取液按照分装单表分装。分装1000人份核酸提取试剂约需要2小时。

一、主要原材料来源及制备方法

1.引物和探针：本发明所应用的引物、探针均由上海英骏生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。

其中梅毒螺旋体核酸保守序列最优引物、探针序列组合如下：

所述上游引物A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：

5’- GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：

5’- CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’；

所述荧光探针A的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：

5’- ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’。

本试剂盒的拟南芥内参照系统（Suc），所述内参照系统包括上游引物：SEQ ID NO.4、下游引物：SEQ ID NO.5、荧光探针：SEQ ID NO.6,具体如下：

上游引物：5′- CGTCGCTGGAGCTGGTTTA -3′

下游引物：5′- GGCGGTTTGTCAAGCTGAT -3′

荧光探针：5′- CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3′。

2.Taq DNA聚合酶：经供应商审计，选用KaTaRa公司的产品。规格为5U/μL，纯度＞ 95%，具有DNA聚合酶活性和5’-3’ DNA外切酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，94℃1小时后仍保持50％活性，于-20±5℃保存不冻结。

3.UNG酶:经供应商审计，选用Promega公司的产品。规格为1U/μL，于-20℃不冻结，-20±5℃保存。

4.dNTPs：经供应商审计，选用Promega公司的产品。dATP、dCTP、dGTP和dUTP为澄清透明溶液，标示值为100mmol/L；将dATP:dCTP:dGTP:dUTP=1:1:1:2配制成混合液。

5.产品使用质量控制标准品：本产品使用的阳性质控品为含目的基因质粒的细胞溶液，阴性质控品为不含目的基因质粒的细胞溶液。

6.10倍PCR缓冲液：称取18.171-30.285gTris、48.425-70.775gKCL，加入700-800mL去离子水并搅拌，待所有固体溶解后，使用盐酸调节pH值至8.5-8.9，去离子水定容至1000mL。

二、标准品、质控品的制备方法及溯源情况

1.企业工作参考品的制备方法及溯源情况

1.1 工作参考品的组成：

强阳性参考品（2份，TP1-TP2，1.0×10⁶copies/ml）

弱阳性参考品（2份，TP3-TP4，1.0×10⁴copies/ml）

阴性参考品（4份，TN1-TN4）

最低检测量参考品（1份，TS1-TS6）

精密度参考品（2份，TP1、TP3）

1.2 工作参考品的制备及溯源情况

1.2.1 强阳性参考品

1.2.1.1 制备及溯源情况

收集测序检测为TP阳性的样本，经PCR扩增和T载体克隆获得质粒，将该质粒转化入大肠杆菌中，经培养后，离心收集大肠杆菌细胞。使用高纯度质粒小提试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取质粒，经紫外分光定量换算后，确定培养后的大肠杆菌菌液相应的质粒浓度。使用含30%甘油的TE溶液稀释大肠杆菌菌液至质粒浓度为1.0×10⁷copies/ml，按1000μL /管分装，1套2份，编号TP1-TP2，-20±5℃保存。

1.2.1.2 质量控制

以企业阳性参考品作为待检样本，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按照试剂盒说明书进行检测，检测结果如图4所示，即TP1-TP2均有标准S型扩增曲线，检测结果均为阳性，符合产品标准要求。

1.2.2 弱阳性参考品

1.2.2.1 制备及溯源情况

收集测序检测为TP阳性的样本，经PCR扩增和T载体克隆获得质粒，将该质粒转化入大肠杆菌中，经培养后，离心收集大肠杆菌细胞。使用高纯度质粒小提试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取质粒，经紫外分光定量换算后，确定培养后的大肠杆菌菌液相应的质粒浓度。使用含30%甘油的TE溶液稀释大肠杆菌菌液至质粒浓度为1.0×10⁴copies/ml，按1000μL /管分装，1套2份，编号TP3-TP4，-20±5℃保存。

1.2.2.2 质量控制

以弱阳性参考品作为待检样本，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按照试剂盒说明书进行检测，检测结果如图5所示，即TP3-TP4均有标准S型扩增曲线，检测结果均为阳性，符合产品标准要求。

1.2.3 阴性参考品

1.2.3.1 制备及溯源情况

收集临床检测结果为梅毒螺旋体阴性的已灭活的分泌物样本，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行荧光PCR检测，检测结果为阴性的样本，用清洗液A适当稀释后，按1000μL /管分装，1套4份，编号TN1-TN4，-20±5℃保存。

1.2.3.2 质量控制

以企业阴性参考品作为待检样本，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按照试剂盒说明书进行检测，检测结果如图6所示，即TN1-TN4均没有标准S型扩增曲线，检测结果均为阴性，符合产品标准要求。应符合产品标准要求，即TN1-TN4均为阴性。

1.2.4 最低检出量参考品

1.2.4.1 制备及溯源情况

收集测序检测为TP阳性的样本，经PCR扩增和T载体克隆获得质粒，将该质粒转化入大肠杆菌中，经培养后，离心收集大肠杆菌细胞。使用高纯度质粒小提试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取质粒，经紫外分光定量换算后，确定培养后的大肠杆菌菌液相应的质粒浓度。使用含30%甘油的TE溶液稀释大肠杆菌菌液至质粒浓度分别为1.0×10⁷copies/ml（编号TS1）、1.0×10⁶copies/ml（编号TS2）、1.0×10⁵copies/ml（编号TS3）、1.0×10⁴copies/ml（编号TS4）、1.0×10³copies/ml（编号TS5）、5.0×10²copies/ml（编号TS6），各浓度按1000μL /管分装，1套6份， -20±5℃保存。

1.2.4.2 质量控制

以最低检出量参考品作为待检样本，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），检测结果如图1所示，TS1有明显的标准S型曲线，根据大肠杆菌质粒浓度的递减， TS2-TS4的S型曲线强度依次逐渐减小但仍然明显，TS5-TS6只有微弱的PCR扩增曲线，即TS1-TS6均为阳性，样本的最低检测量为TS6，即5.0×102拷贝/ml。

1.2.5 精密度参考品

1.2.5.1 制备及溯源情况

采用强阳性参考品中TP1和弱阳性参考品TP3作为精密度参考品。

1.2.5.2 质量控制

如图2所示，以精密度参考品TP1为待检样本进行检测，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按照试剂盒说明书进行检测，重复10次扩增，均得到标准S型PCR扩增曲线，10次检测结果均为阳性，且CV≤10%，精密度参考品TP1符合产品标准要求。

如图3所示，以精密度参考品TP3为待检样本进行检测，用本公司的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按照试剂盒说明书进行检测，重复10次扩增，均得到标准S型PCR扩增曲线， 10次检测结果均为阳性，且CV≤10%，精密度参考品TP3符合产品标准要求。

2.质控品的制备方法及溯源情况

2.1 阳性质控品

2.1.1 制备及溯源情况

采用强阳性参考品TP1作为阳性质控品，按200μL /管分装，-20±5℃保存。

2.1.2 质量控制

以阳性质控品作为待检样本，用质检合格的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按试剂盒说明书进行检测，检测结果应符合产品标准要求，即阳性质控品为阳性。

2.2 阴性质控品

2.2.1 制备及溯源情况

将空白T载体转化入大肠杆菌中，经培养后，离心收集大肠杆菌细胞。用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×107copies/ml，按200μL /管分装，-20±5℃保存。

2.2.2 质量控制

以阴性质控品为待检样本，用质检合格的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），按试剂盒说明书进行检测，检测结果应符合产品标准要求，即阴性质控品为阴性。

实施例2 本发明试剂盒的使用

一、试剂准备

1.备料

检测试剂盒使用2条梅毒螺旋体特异性扩增引物、2条内参照扩增引物、1条毒螺旋体特异性探针和1条内参照探针，配以RT-PCR Buffer、DNA聚合酶（Taq）、逆转录酶、dATP、dUTP、dCTP、dGTP 四种单核苷酸单体等成分，通过PCR体外扩增和荧光信号检测进行梅毒螺旋体基因检测。上述的引物和探针均为专用原料，原材料消耗量均较小，原材料取样、检验均在质检中心进行，周转容器的清洁、干燥、消毒在车间清洗间进行。

2.配制

包括核酸提取试剂的配制：提取液A配制和提取液B配制；PCR试剂配制：酶系的配制、TP-PCR 反应液的配制、阳性质控品的配制和阴性质控品的配制；其中阳性质控品和阴性质控品的制备在一万级工作区内的Ⅱ级生物安全柜内进行；其他项目的配制在车间配制间内进行。

3.分装

包括核酸提取试剂的分装：提取液A分装和提取液B分装； PCR试剂分装：PCR酶系的分装、TP-PCR反应液分装、阳性质控品的分装和阴性质控品的分装。其中阳性质控品和阴性质控品的分装在一万级工作区内的Ⅱ级生物安全柜内进行；其它项目的分装在车间配制间内进行。

二、样本处理

1.全血

1.1吸取200μl的全血样本（或阳性质控品，或阴性质控品）转入洁净的1.5ml离心管，加入800ul的提取液A，震荡混匀（转数不要太高，能混匀即可），室温静置2分钟，8000rpm离心1min；

1.2吸弃上清，加入1ml提取液A，震荡混匀，室温静置2分钟，8000rpm离心1min；

1.3重复步骤1.2一次；

1.4吸弃上清液，加入50ul的提取液B，100℃煮沸10分钟，10000rpm离心5分钟，上清备用。

2溃疡分泌物

2.1往拭子套管中加入1mL提取液A（保证提取液A能没过无菌拭子取样部位），将标本管用震荡器高速震荡2 min制成标本悬浮液。

2.2吸取200μl的标本悬浮液（或阳性质控品，或阴性质控品）转入洁净的1.5ml离心管，8000rpm离心1min；

2.3重复步骤1.2-1.4；

三、PCR扩增

1.取一只1.5mL离心管，加入TP-PCR反应液43×（n+2）μl和酶系2×（n+2）μl，（n=受检样本数），混匀，各管分别按45ul/管分装到PCR反应管中。加入样本或质控品的DNA提取产物各5μl。

2.轻弹管壁混匀，应避免气泡产生，6000rpm瞬时离心后，放入荧光PCR仪，按下列程序条件扩增：

步骤1：设置温度为50℃，运行时间为2min；

步骤2：设置温度为95℃，运行时间为3min；

步骤3：设置温度为94℃、运行时间为15sec，温度为60℃、运行时间为45sec,按上述两个不同的温度与时间设置（94℃、15sec及60℃、45sec），重复循环40次。

另外：

荧光素设置：所有检测孔均设置为FAM-TAMRA和HEX-TAMRA（无HEX可设置为JOE）；

荧光信号收集：Stage3：60℃---45sec；

反应体积：50ul。

3.结果分析：反应结束后，根据分析后图像调节Baseline 的Start 值、End 值以及Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可以在2～6、End 值可设在6～15，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis 自动获得分析结果，在Report界面察看结果。

四、质量控制

1.阴性质控品：FAM信号无对数扩增曲线或Ct 值≥40，HEX信号有较好的对数扩增曲线，且Ct 值<35.1；

2.阳性质控品：FAM信号有较好的对数扩增曲线，且Ct 值<35.1，HEX信号无要求。

3.以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

五、结果分析

1.检验结果的解释

检测样本时，若FAM信号的Ct值≤35.1，且有较好的对数扩增曲线，可解释为TP核酸阳性；若FAM信号的Ct值=40 或“No Ct”( Mx3000P) 或者“Undet.” (ABI 7500)且HEX信号的Ct 值<35.1，且有较好的对数扩增曲线，可解释为TP核酸阴性；若FAM信号的Ct 值介于35.1-40.0之间，需重复检测2次，若2次FAM信号的Ct值均=40，则可解释为TP核酸阴性，若其中至少1次FAM信号的Ct值≤35.1 且有较好的对数扩增曲线，判定为疑似阳性结果，建议临床上重新取样检测或采用其它检测手段进行检测。详见参考值表。

表6参考值

2. 产品性能的研究总结

本试剂盒在实验室性能评价方面主要进行了包括以下几个方面的性能研究：最低检出量、准确性、特异性、精密度等。

分析最低检出量实验结果表明本试剂盒可以检出最小浓度为5.0×10²copies/mL TP DNA；

分析准确性实验结果表明本试剂盒能准确地检测出梅毒阳性样本，准确性为100%；

分析特异性实验结果表明本产品不会与临床常见其他各类病原体（B族链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、牛链球菌、铜绿假单胞菌、近平滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、丘陵假丝酵母、季也蒙假丝酵母、清酒假丝酵母、乳酒假丝酵母、间型假丝酵母、罗伦隐球酵母、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、光滑假丝酵母、热带假丝酵母）产生交叉反应。

精密度研究结果表明本试剂盒批内与批间一致性好，批内精密度与批间精密度均≤10%。

2.1临床性能评估研究结果

通过随机、盲法的临床试验，共检测标本576例，其中有效标本576例，与金标准结果相比，本试剂盒的灵敏度为98.45%，特异性为99.74%，一致性为99.31%。实验表明试剂盒可靠，准确，安全，简便，稳定，具有较高的临床应用价值。

综上，与实验室普通PCR定量检测相比，本产品技术可行；质量控制体系稳定可靠；产品稳定性能良好，检测结果可靠准确，具有较高的临床应用价值。优点在于缩短梅毒检测的窗口期，有助患者提早治疗；对检测设备要求简单，可以在绝大多数临床检测实验室开展。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 泰普生物科学(中国)有限公司

<120> 一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒

<141> 2012-07-13

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtcgatgtg caaatgagtg tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgacttcaa tacggagttc ac 22

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actagccctc ccttctacct gagataag 28

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtcgctgga gctggttta 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcggtttgt caagctgat 19

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgccgatat aggtcacagc atgg 24

Claims

1.一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，主要包括PCR反应试剂和DNA提取试剂，其特征在于，所述PCR反应试剂包括：

5’- GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’；

5’- CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’；

3）用于检测梅毒螺旋体核酸的探针，其碱基序列为:

5’- ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’；

2.根据权利要求1所述的一种梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的用于避免检测结果假阴性的内参照系统，所述内参照系统为拟南芥内参照系统包括：

1）上游引物，其碱基序列为5′- CGTCGCTGGAGCTGGTTTA -3′；

2）下游引物，其碱基序列为5′- GGCGGTTTGTCAAGCTGAT -3′；

3）荧光探针，其碱基序列为5′- CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3′。

3.根据权利要求1所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，所述荧光报告基团为FAM、JOE或HEX，所述淬灭荧光基团为BHQ1、BHQ2或TAMRA。

4.根据权利要求1所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述探针为Taqman或MGB探针。

5.按权利要求1所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为5-20μM，所述下游引物的浓度为5-20μM，所述探针的浓度为5-20μM。

6.按权利要求1所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括每人份：25μL纯水、5μL 10倍PCR 缓冲液、7μL 20-40mM 的MgCl₂、1μL 10mM 的dNTP、1μL 4-6U/μL 的Taq酶和1μL 0.5-1.5U/μL 的UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP，并且为dATP:dCTP:dGTP:dUTP=1:1:1:2配制，所述的10倍PCR 缓冲液的配制方法为：称取18.171-30.285gTris和48.425-70.775gKCL，加入700-800mL去离子水并搅拌均，待所有固体溶解后，使用盐酸调节pH值至8.5-8.9，去离子水定容至1000mL的混合液。

7.根据权利要求1所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂包括提取液A和提取液B，其中：

所述提取液A的制备方法为：取684-1368g蔗糖、7.874-10.297g三羟甲基氨基甲烷（Tris）和250-350mL聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）,混合均匀，盐酸调pH值为7.5-8.0，纯水定容至3000mL，取每人份3mL；

所述提取液B的制备方法为：取0.05-0.15g聚苯乙烯基体离子交换树脂(Chelex100)、0.25-0.75mL TritonX-100和0.04-0.08g Tris，盐酸调pH值为7.8-8.3，纯水定容至50mL，取每人份0.05mL 。

8.根据权利要求1所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

9.根据权利要求8所述的梅毒螺旋体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品的制备方法为：a)收集测序检测为TP阳性的样本，b)经PCR扩增和T载体克隆获得质粒，c)将该质粒转化入大肠杆菌中，d)菌株培养，e)离心收集大肠杆菌细胞， f）用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×10⁷copies/ml作为试验用阳性质控品；所述阴性质控品的制备方法为：1)将空白T载体转化入大肠杆菌中，2)菌株培养，3)离心收集大肠杆菌细胞，4) 用含30%甘油的TE溶液稀释重悬细胞至质粒浓度为1.0×10⁷copies/ml，作为试验用阴性质控品。