CN114540522A - 用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒 - Google Patents

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CN114540522A CN202210293944.7A CN202210293944A CN114540522A CN 114540522 A CN114540522 A CN 114540522A CN 202210293944 A CN202210293944 A CN 202210293944A CN 114540522 A CN114540522 A CN 114540522A
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Abstract

本发明公开一种用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒。该反应体系包含检测并区分梅毒螺旋体、纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型的引物对和探针，其中引物对和探针均针对相同酶的基因。本发明的检测反应体系和试剂盒能够利用荧光PCR技术在全封闭的扩增体系中同时对梅毒螺旋体和纯疱疹病毒I型/II型进行检测。本发明进一步对检测的反应体系进行了优化，提高样本的分型和检出率的同时保证了样本中所含有的病原体的稳定检出。因此，本发明的反应体系及方法和试剂盒具有重要的临床意义和流行病学意义。

Description

用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子检测与分子诊断领域，具体地涉及用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒。
背景技术
性传播疾病主要由相关的微生物引起。目前的科学研究发现，已知有 30多种细菌、病毒和寄生虫通过性接触方式传播。性传播疾病常见病原体有细菌感染(淋球菌，沙眼衣原体，梅毒螺旋体，杜克雷嗜血杆菌，肉芽肿克雷白氏杆菌等)，病毒感染(艾滋病毒，单纯疱疹病毒，人乳头瘤病毒，乙型肝炎病毒，巨细胞病毒等)和寄生虫(阴道毛滴虫，白色念珠菌等)。
带来性传播疾病的各种病原体种类众多，造成的症状千差万别，传播性、发病率、以及致病的危害程度各不相同。这给性传播疾病的诊疗带来了诸多的挑战。在众多的性传播疾病导致的症状中，有一类疾病的症状表现在局部皮肤组织的缺损、液化、坏死类损伤，通常称为溃疡。不同的病原体，不同的病程，细节上有所不同。引起这类症状的病原体主要有梅毒螺旋体(Treponema pallidum)和单纯疱疹病毒。其中单纯疱疹病毒 (herpessimplex virus,HSV)按照常见发病部位的不同又分为两种亚型，单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，分别通常引起口腔疱疹和生殖器疱疹。
性传播感染所表现出来的症状非常复杂，上述提及的梅毒螺旋体、单纯疱疹病毒和杜克雷嗜血杆菌感染引起的症状类似，在临床诊断中往往需要鉴别诊断。总体来说，虽然大多数生殖器溃疡都是由性传播感染引起的，但在排除性传播感染后还应考虑一些非感染性病因。临床医生面临的挑战为确定生殖器溃疡的病因，以开始适当治疗并降低传播给他人的风险。然而，确定病因可能较为复杂，因为当前的诊断性试验具有一定局限性以及患者可能同时存在多种感染。
目前临床上，对于这几类疾病的诊断依赖医生的经验，实验室诊断的手段有限，也导致这些疾病容易产生漏诊和误诊，都会给就诊者及其家庭带来的身心痛苦和沉重的经济负担。因此，使得临床上对于病原体的鉴别诊断有非常重要的意义，尤其是对于合并感染的情况。
随着对病原体基因组研究的深入和分子生物学技术的发展，核酸检测正在成为病原体鉴别诊断一个强有力的工具。目前已开发了众多针对不同病原体基因的体外分子诊断试剂。例如，中国专利申请CN1865451A公开了一种性病混合感染PCR检测试剂盒，其包括预处理液、扩增管和阳性模板，阳性模板在血液型扩增管中为含乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或其中任意组合或单种病原体的特定基因序列的质粒载体；在分泌液型扩增管中为含白色念珠菌、解脲支原体、淋球菌、沙眼衣原体或其中任意组合或单种病原体的特定基因序列的质粒载体。
再例如，中国专利申请CN112301169A公开了一种同步检测多种生殖道感染相关的病原体的引物组、探针组及试剂盒，在同一反应管中同时对包括病原体单纯疱疹病毒1、2型、病原体B族链球菌等多个基因序列的扩增和特异性检测。
上述对病原微生物的检测均针对不同基因设计引物，这无疑增加了各引物之间的相互作用和引物二聚体的形成，进而影响病原微生物扩增和特异性检测结果。因此，目前仍需要一种反应体系及试剂盒，以实现同一反应管中同时检测梅毒螺旋体、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题，本发明提供一种用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，所述反应体系包含检测并区分梅毒螺旋体、纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型的引物对和探针，所述引物对和探针均针对相同酶的基因。
根据本发明所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，优选地，所述引物对包含用于扩增梅毒螺旋体的第一引物对、用于扩增纯疱疹病毒I型和用于扩增单纯疱疹病毒II型的第二引物对，且引物的 Tm值在55-70℃之间和所述引物对各自得到的扩增子在80-150bp之间。
根据本发明所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，优选地，所述探针包括与梅毒螺旋体特异性结合的第一探针、与纯疱疹病毒I型特异性结合的第二探针和与单纯疱疹病毒II型特异性结合的第三探针，且所述探针各自的Tm值高于对应的引物的Tm值。
根据本发明所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，优选地，所述探针包含荧光基团。
根据本发明所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，优选地，所述第一引物对的序列如SEQ ID NO:1-2所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID NO:3-4所示；所述第一探针的序列如SEQ ID NO:5 所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO:6所示，所述第三探针的序列如 SEQ ID NO:7所示。
根据本发明所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，优选地，进一步包括针对人源内参基因的特异性引物和探针。
根据本发明所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，优选地，所述相同酶为DNA聚合酶。
本发明的第二方面，提供一种构建反应体系的方法，所述反应体系为根据第一方面所述的反应体系，所述方法包括使引物对和探针与缓冲液接触混合的步骤。
本发明的第三方面，提供一种试剂盒，其包括针对相同酶的基因的引物对和探针，用于检测并区分梅毒螺旋体、纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型。
根据本发明所述的试剂盒，优选地，进一步包括说明书，其中记载有构建反应体系的步骤。
本发明的检测反应体系和试剂盒利用荧光PCR技术在全封闭的扩增体系中同时对梅毒螺旋体和纯疱疹病毒I型/II型进行检测，根据每种病原体的探针对应不同的荧光信号，从而实现其特异性检测。本发明进一步对检测的反应体系进行了优化，提高样本的分型和检出率的同时保证了样本中所含有的病原体的稳定检出。因此，本发明的用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒具有重要的临床意义和流行病学意义。
附图说明
图1利用特异性引物及特异性探针TP-qF11/TP-qR11，TP-qF12/TP- qR12，TP-qF13/TP-qR13进行定量检测的结果。
图2利用特异性引物及特异性探针UL27F/UL27R/UL27P1/UL27P2的定量检测的结果(HSV-1型)。
图3利用特异性引物及特异性探针UL27F/UL27R/UL27P1/UL27P2的定量检测的结果(HSV-2型)。
图4利用特异性引物及特异性探针POLF/POLR/POLP1/POLP2的定量检测的结果(HSV-1型)。
图5利用特异性引物及特异性探针POLF/POLR/POLP1/POLP2的定量检测的结果(HSV-2型)。
图6利用实施例3所示的探针引物组合对3种病原体同时进行荧光定量PCR的检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
除非另有说明，本文所用术语“检测”旨在包括检测/测定/测量样品中的梅毒螺旋体、纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型相关核酸(靶核酸)的存在与否和/或定量其相关核酸(靶核酸)。
本发明中的靶核酸(本文有时也称为“靶序列”)是指从待测样本中进行检测或定量的对象的核酸，是指后续检测中通过使用PCR引物对的核酸扩增反应所扩增的区域的核酸。
本发明中，术语“待测样本”是指来源于受试者/患者的生物样品。可用于本发明的生物样品类型的实例包括但不限于以下的一种或多种：尿、粪便、泪液、全血、血清、血浆、血液成分、骨髓、细胞、组织(组织渗液)、器官、体液、唾液、脸颊拭子、淋巴液、脑脊髓液、病变渗出物(例如疱液)和由身体产生的其他流体。生物样品类型也可以是冷冻、固定、石蜡包埋或新鲜的活检样品。
术语“受试者”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选为哺乳动物，哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、家畜等。具体的哺乳动物包括大鼠、小鼠、猫、狗、猴子和人，优选为人。
无论是原核生物还是真核生物其DNA聚合酶序列高度同源，其属于序列高度保守的合成酶。目前对病原微生物检测一般都是针对不同基因设计引物，这无疑增加了各引物之间的相互作用和引物二聚体的形成，进而影响扩增的特异性以及可能产生的扩增抑制，最终导致病原微生物扩增和特异性检测结果的误判。而发明与传统设计思路不同，其基于不同病原微生物的高度同源的同一DNA聚合酶基因的高度保守区域设计引物，并且通过特异性探针实现在同一管中同时检测三种病原微生物。具体如下。
对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系
本发明的反应体系中的引物对和探针均针对相同酶的基因，尤其是针对不同目标微生物的DNA聚合酶基因组上的保守区域。其中所述引物对根据基因组序列上的特异区域进行设计，其能够特异地扩增所设计的目标区域的核酸序列。优选地，本发明所述引物对包含用于扩增梅毒螺旋体的第一引物对、用于扩增纯疱疹病毒I型和用于扩增单纯疱疹病毒II型的第二引物对，且所述引物的Tm值在55-70℃之间和所述引物对各自得到的扩增子在80-150bp之间。还优选地，引物的Tm值在58-65℃之间，所述引物对各自得到的扩增子在90-140bp之间。
本发明的反应体系中探针的结合区域位于检测引物对扩增区域内部。所述探针上同时带有荧光基团和猝灭基团。在反应体系中不存在探针序列的互补结合序列时，探针处于游离状态，此时荧光基团和猝灭基团所处的位置较近，荧光基团所发射的荧光信号为猝灭基团所吸收，对外不表现为荧光信号。在PCR过程中，如果存在与探针区域互补的特异性模板，则探针结合至模板上的特异位置，在酶的作用下，探针被水解，此时荧光基团与猝灭基团分离，荧光基团所发射的荧光不被吸收，对外表现为可以检测到的荧光信号。游离的荧光基团的量与PCR反应的量有关，从而通过检测反应体系中荧光信号的强度可以反映反应体系中PCR产物的多少。如果实时监控每一个PCR反应过程中所产生的荧光的量，则荧光强度信号可以实时监测整个PCR反应的过程，从而反映出检测体系中初始模板的情况。
本发明中，优选地，所述探针上带有的荧光基团和猝灭基团可以标记在探针中任何碱基的位置。更优选地，所述探针上带有的荧光基团和猝灭基团分别位于序列的两端。通常情况下，荧光基团标记于探针序列的5’端，猝灭基团标记于探针序列的3’端。所述荧光基团的实例包括但不限于：6-FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy3、 Cy5。所述猝灭基团的实例包括但不限于：BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB。本发明中，针对每个目标病原微生物的特异性检测探针标记不同的荧光基团。因此，可以在同一反应体系中，通过检测不同的荧光信号来区分不同的检测目标。
优选地，本发明的述探针包括与梅毒螺旋体特异性结合的第一探针、与纯疱疹病毒I型特异性结合的第二探针和与单纯疱疹病毒II型特异性结合的第三探针，且所述探针各自的Tm值高于对应的引物的Tm值，例如，探针的Tm值可以高于引物的Tm值至少5℃，例如探针可以具有高于引物的Tm值6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的Tm值。
在一些实施方案中，对于梅毒螺旋体，可以同时使用第一引物对和第一探针来与其他微生物区分。在另外的具体实施方案中，对于单纯疱疹病毒，考虑单纯疱疹病毒I型和II型在基因组序列上同源性达到50％，可以用第二引物对来与其他物种区分，并用第二探针和第三探针区分单纯疱疹病毒I型和II型。本发明还设计了针对DNA聚合酶基因另外的区域的引物对，在某些实施方案中，另外的区域是指UL27，但实验结果表明其效果远差于本发明的第二引物对。因此，本发明最终的引物/探针组合中包含分别对应三种不同检测目标的两组引物对和三种特异性探针。
优选地，在本发明的引物/探针组合中，包含一组针对人源基因组序列特异性基因区域的引物/探针作为内部参照，以监测样品采集和样品处理 (如核酸提取)的全过程是否有效。还优选地，内部参考序列的目标区域包括但不限于：Actin(肌动蛋白)基因、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因、β2微球蛋白基因、Globin(珠蛋白)基因等。
优选地，除了引物/探针组合之外，所述反应体系的组分还包括DNA 聚合酶，dNTP(脱氧核苷三磷酸，包括dATP/dGTP/dCTP/dTTP四种组分)以及聚合酶起作用所必须的缓冲条件和辅助离子，以及其他保持体系稳定性的添加物。还优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。进一步优选地，使用热启动型Taq DNA聚合酶以减少扩增过程中的非特异性。
优选地，所述缓冲条件包括但不限于：Tris缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等。还优选地，使用Tris缓冲液作为缓冲条件。
优选地，反应体系的添加物包括但不限于BSA、甘油、甜菜碱等。
优选地，所述PCR反应体系中添加有适当比例的dUTP(脱氧尿苷三磷酸)和UDG酶(尿嘧啶DNA糖基酶)，以消除PCR产物带来的污染。其原理在于，在带有dUTP的反应体系中，PCR扩增产物中有部分碱基位置T(胸腺嘧啶)被U(尿嘧啶)取代，带有U碱基的产物片段如果进入后续反应体系中，在UDG酶的作用下发生断裂，从而不会被扩增，起到了防止污染的作用。
构建反应体系的方法
本发明的构建反应体系的方法包括使引物对和探针与缓冲液接触混合的步骤。需要说明的是，本发明的反应体系是将不同病原微生物的引物/探针进行组合，形成可以同时检测梅毒螺旋体/单纯疱疹病毒I型/单纯疱疹病毒II型这三种目标微生物的引物/探针组合。本发明进一步对该反应体系中的引物/探针浓度，酶的种类和浓度，dNTP的浓度，dUTP/dNTP的比例等进行了优化，以达到所需的样本分型和检出率。
具体地，其包括如下步骤：
(1)按照如前所述的设计DNA引物和探针序列；
(2)采用化学合成的方法获得引物和探针；
(3)用单一模板对相应的引物/探针进行筛选和优化；
(4)将优选的引物/探针进行组合并对多个病原微生物核酸模板进行组合筛选和优化；
(5)进一步对聚合酶和反应体系中的其他组分进行调整；
优选地，所述化学合成是指采用有机合成的方法，将核苷酸单体按照所要求的序列依次连接，形成具有特定碱基排列顺序的DNA分子的过程。
本发明中，所述引物和探针的浓度为1-20μM，优选为5-15μM，还优选为8-12μM。引物和探针的体积比为1.5-2.5:1，优选为1.8-2.2:1，还优选为1.9-2.1:1。
本发明中，扩增程序如下：Taq酶活化92-97℃，15-45s，1个循环；变性92-97℃，5-15s，退火、延伸及荧光采集55-70℃，45-60s，共30-55 个循环。优选地，Taq酶活化93-96℃，20-40s，1个循环；变性93-96℃， 8-12s，退火、延伸及荧光采集58-65℃，48-55s，共40-50个循环。
试剂盒
本发明进一步提供试剂盒，其包含本发明的包括针对相同酶的基因的引物对和探针。本发明的试剂盒进一步记载有构建反应体系的步骤。该试剂盒可进一步包含能够通过各种测定类型(诸如ELISA测定、免疫测定、蛋白质芯片或微阵列、DNA/RNA芯片或微阵列、RT-PCR等)进行常规检测的其他试剂。
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
本发明中，检测反应可以在荧光PCR仪器上进行。荧光PCR仪器具体类型不特别限定，只要其能够独立分辨的荧光通道数量不少于反应体系中用到的荧光基团的数量即可。
实施例1
本实施例为梅毒螺旋体检测引物筛选，具体如下。
1.引物设计与合成
根据本发明的设计思路，通过梅毒螺旋体基因组序列分析，针对其 DNA聚合酶I(polA)基因的保守区域，按荧光定量PCR技术的原理与方法，设计如表1所示引物和表2所示的探针，经DNA合成供应商合成。
表1
Figure BDA0003562516450000111
表2
Figure BDA0003562516450000112
Figure BDA0003562516450000121
上表中，正向引物TP-qF11、反向引物TP-qR11和探针TP-qP11为一检测组合；正向引物TP-qF12、反向引物TP-qR12和探针TP-qP12为一检测组合；正向引物TP-qF13、反向引物TP-qR13和探针TP-qP13为一检测组合。
2.荧光PCR反应
以含有靶序列的人工合成的质粒标准品为模板，使用TAKARA公司的taq酶PremixEx TaqTM(Probe qPCR)，货号：RR390L，对设计的3组特异性引物进行测试，以筛选获得最佳的特异性引物。反应体系如下表所示。
表3
成分 加入量(μL)
正向引物(10μM) 0.5
反向引物(10μM) 0.5
探针(10μM) 0.25
Taq酶 12.5
DNA模板 5
无核酸酶水 6.25
合计 25
用ABI7500荧光定量PCR仪器，选择ROX通道(Reporter：ROX， Quencher：None)，参比荧光(Passive Reference)设置为none，按下表所示条件设置反应程序。
表4
Figure BDA0003562516450000122
3.检测结果说明
图1示出了利用3组特异性引物TP-qF11/TP-qR11、TP-qF12/TP- qR12、TP-qF13/TP-qR13进行扩增，并分别利用特异性探针TP-qP11、TP- qP12、TP-qP13进行定量检测的结果。由图中可以看出，3组特异性引物和探针均可以保证PCR过程正常进行。相较来说，引物探针组合TP- qF12/TP-qR12/TP-qP12扩增效率更高一些，有助于提高样本的检出率。
实施例2
本实施例为单纯疱疹病毒I型/II型分型引物筛选，具体如下。
1.引物设计与合成
通过对单纯疱疹病毒I型/II型的基因组序列进行比对分析，分别针对其UL27和DNA聚合酶基因POL的保守区域设计通用引物，并利用检测区段内两者存在的差异化保守位点设计分型探针，从而达到分型的目的。设计的引物和探针序列如下表所示。
表5
Figure BDA0003562516450000131
Figure BDA0003562516450000141
2.荧光PCR反应
以单纯疱疹病毒I型/II型的标准毒株为模板，使用TAKARA公司的 taq酶PremixEx TaqTM(Probe qPCR)，货号：RR390L，对设计的2组特异性分型引物进行测试，以筛选获得最佳的分型引物。反应体系如下表所示。
表6
成分 加入量(μL)
通用正向引物F(10μM) 0.5
通用反向引物R(10μM) 0.5
HSV1检测探针P1(10μM) 0.25
HSV2检测探针P2(10μM) 0.25
Taq酶 12.5
DNA模板 5
无核酸酶水 6.0
合计 25
用ABI 7500荧光定量PCR仪器，选择VIC通道(Reporter：VIC， Quencher：None)检测HSV-1型，选择FAM通道(Reporter：FAM， Quencher：None)检测HSV-2型，参比荧光(Passive Reference)设置为 none，按如下条件设置反应程序。
表7
Figure BDA0003562516450000142
3.检测结果说明
图2-5示出了利用2组通用特异性引物UL27F/UL27R、通用引物 POLF/R对HSV-1型和HSV2型标准品分别进行扩增，并分别利用特异性分型探针UL27P1/UL27P2、通用引物P1/P2进行定量检测的结果。由图中可以看出，通用引物F/R及探针组合的荧光信号更高，能够进行样本的分型和检出率。而UL27F/UL27R引物及其探针不能很好地对HSV-1型和 HSV2型正确分型。
实施例3
本实施例为同时检测三种病原体的应用方案，具体如下。
1.引物组合
从前述引物中，选择梅毒螺旋体检测的引物探针TP-qF12/TP- qR12/TP-qP12，以及用于HSV-1型/2型分型检测的通用引物探针 POLF/POLR/POLP1/POLP2，对梅毒螺旋体、HSV1和HSV2等3种病原体同时进行检测。
2.荧光PCR反应
使用含有梅毒螺旋体靶序列的人工合成的质粒标准品 (104copies/mL)、单纯疱疹病毒I型(104copies/mL)和II型 (104copies/mL)的标准毒株配制同时含有3种病原题的样品，并以此为模板使用TAKARA公司的taq酶Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，货号：RR390L，对3种病原体同时进行检测。反应体系如下：
表8
Figure BDA0003562516450000151
Figure BDA0003562516450000161
用ABI 7500荧光定量PCR仪器，选择VIC通道(Reporter：VIC， Quencher：None)检测HSV-1型，选择FAM通道(Reporter：FAM， Quencher：None)检测HSV-2型，选择ROX通道(Reporter：ROX， Quencher：None)检测梅毒螺旋体，参比荧光(Passive Reference)设置为none，按如下条件设置反应程序。
表9
Figure BDA0003562516450000162
3.检测结果说明
图6示出了使用上述组合对3种病原体同时进行荧光定量PCR的检测结果，从图中可以看出，上述组合可同时稳定的检测出样本中所含有的3 种病原体。
实施例4
本实施例为同时检测三种病原体的另一应用方案，具体如下。
1.引物选择与组合
使用上述梅毒螺旋体检测的引物探针TP-qF12/TP-qR12/TP-qP12、 HSV-1型/2型分型检测的引物探针POLF/POLR/POLP1/POLP2，对编号为 1-76的76例样本进行检测。
2.荧光PCR反应
反应体系如下表所示。
表10
Figure BDA0003562516450000163
Figure BDA0003562516450000171
用ABI 7500荧光定量PCR仪器，选择VIC通道(Reporter：VIC， Quencher：None)检测HSV-1型，选择FAM通道(Reporter：FAM， Quencher：None)检测HSV-2型，选择ROX通道(Reporter：ROX， Quencher：None)检测梅毒螺旋体，参比荧光(Passive Reference)设置为none，按如下条件设置反应程序。
表11
Figure BDA0003562516450000172
3.检测结果说明
根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值和Threshold值(可根据实际情况自行调整，Start值可在3～15，End值可设在5～20，调节阈值线至扩增曲线升起的拐点处，得到Ct值)，使用仪器配套软件自动分析结果。
检测结果如下表：76例样本有3例样本未检出内参IC，在有IC的73 例样本中共检出阳性54例，具体为HSV1型：2例，HSV2型：15例，梅毒：35例，HSV1合并HSV2感染：1例，梅毒合并HSV2型：1例。该结果与临床诊断结果一致。
表12
Figure BDA0003562516450000173
Figure BDA0003562516450000181
Figure BDA0003562516450000191
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 用于病原微生物检测的反应体系及方法和试剂盒
<130> BH2110609
<141> 2022-03-24
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaactccgct tggaaacagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctgcacaa catccttacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtctctcgt ggaccagaag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtccatat gcgctgaacc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccgctttt gcctatccta gca 23
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccggacct acgtcgg 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accctgacct gcggcgg 17

Claims (10)

1.一种对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，所述反应体系包含检测并区分梅毒螺旋体、纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型的引物对和探针，所述引物对和探针均针对相同酶的基因。
2.根据权利要求1所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，所述引物对包含用于扩增梅毒螺旋体的第一引物对、用于扩增纯疱疹病毒I型和用于扩增单纯疱疹病毒II型的第二引物对，且所述引物的Tm值在55-70℃之间和所述引物对各自得到的扩增子在80-150bp之间。
3.根据权利要求2所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，所述探针包括与梅毒螺旋体特异性结合的第一探针、与纯疱疹病毒I型特异性结合的第二探针和与单纯疱疹病毒II型特异性结合的第三探针，且所述探针各自的Tm值高于对应的引物的Tm值。
4.根据权利要求1所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，所述探针包含荧光基团。
5.根据权利要求3所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，所述第一引物对具有SEQ ID NO:1-2所示的序列，所述第二引物对具有SEQ ID NO:3-4所示的序列；所述第一探针具有SEQ ID NO:5所示的序列，所述第二探针具有SEQ ID NO:6所示的序列，所述第三探针具有SEQ ID NO:7所示的序列。
6.根据权利要求1所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，进一步包括针对人源内参基因的特异性引物和探针。
7.根据权利要求1所述的对性传播疾病相关病原微生物进行检测的反应体系，其特征在于，所述相同酶为DNA聚合酶。
8.一种构建反应体系的方法，其特征在于，所述反应体系为根据权利要求1-7任一项所述的反应体系，所述方法包括使引物对和探针与缓冲液接触混合的步骤。
9.一种用于构建权利要求1-7任一项所述反应体系的试剂盒，其特征在于，包括针对相同酶的基因的引物对和探针，用于检测并区分梅毒螺旋体、纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括说明书，其中记载有构建反应体系的步骤。
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