CN108754029A - 基于rt-lamp检测sftsv的引物组及试剂盒 - Google Patents

基于rt-lamp检测sftsv的引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于RT‑LAMP快速检测发热伴血小板减少综合症病毒的寡核苷酸及试剂盒，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB，其中：外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；环引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，环引物LoopB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。本发明所提供的试剂盒操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低廉、反应快速、结果易于观察，可快速检测发热伴血小板减少综合征病毒。

Description

基于RT-LAMP检测SFTSV的引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于RT-LAMP快速检测发热伴血小板减少综合症病毒的寡核苷酸及试剂盒。
背景技术
发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是近年来我国新发现的一类以发热、血小板减少为主要临床特征的病毒性出血热，主要分布在我国中部和东部地区的山区丘陵地带。目前，我国已有16个省份有发热伴血小板减少综合征病例报告。蜱虫叮咬为其主要传播途径，直接接触病人血液和血性分泌物亦可感染该病并导致聚集性疫情发生。该病的病原体为一种新型的布尼亚病毒科、白蛉病毒属病毒，为分节段单股负链RNA病毒，被命名为发热伴血小板减少综合征病毒(Severe feverwith thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)。
发热伴血小板减少综合征早期临床症状不典型，多以发热和胃肠道症状、呼吸道症状为首发表现，不易引起重视。尤其是基层医疗机构普遍缺乏对该病的诊断能力，病例不能得到及时有效的诊断、治疗，导致该病病死率较高，已成为重要的公共卫生问题。目前，实验室主要通过病毒分离、核酸检测、抗原和抗体诊断等技术对SFTSV进行检测。但由于免疫学方法经常造成假阳性，细胞培养方法成本较高、培养时间较长、生物安全要求高、操作技术复杂、PCR技术需要精密昂贵的仪器，对操作人员要求也较高等原因，上述方法难以在基层单位推广。而SFTS多发生于山区和丘陵等医疗卫生条件相对较差的地区，所以迫切需要建立适合基层和现场应用的快速、可靠、不依赖于昂贵仪器设备的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适合基层和现场应用的快速、可靠、不依赖于昂贵仪器设备的SFTS的检测方法。
本发明的技术方案为：基于RT-LAMP快速检测发热伴血小板减少综合症病毒的寡核苷酸，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB，其中：
外引物F3的核苷酸序列为：GCACATCATCTCAGGGGGA(如SEQ ID No.1所示)，
外引物B3的核苷酸序列为：GGCATCAGGGAAGATGTCAA(如SEQ ID No.2所示)；
内引物FIP的核苷酸序列为：
GTGCTGCAGCAGCAGCCTTAACCTTCAGGTTCATGACGGC(如SEQ ID No.3所示)，
内引物BIP的核苷酸序列为：
GCGCTACCCTTACAGGGGTGGTTGATGGCACTCCAGGAG(如SEQ ID No.4所示)；
环引物LoopF的核苷酸序列为：AGGAGTATCTCCCAGTGGGG(如SEQ ID No.5所示)，
环引物LoopB的核苷酸序列为：AGAGCCTGGTCTCTGCCCT(如SEQ ID No.6所示)。
本发明还公开了一种基于RT-LAMP快速检测发热伴血小板减少综合症病毒的试剂盒，包括以下组分：
(1)SEQ ID No.1所示的外引物F3和SEQ ID No.2所示的外引物B3、SEQ ID No.3所示的内引物FIP和SEQ ID No.4所示的内引物BIP、SEQ ID No.5所示的环引物LoopF和SEQID No.6所示的环引物LoopB；
(2)dNTPs、甜菜碱、MgSO4、MnCl2、Bst聚合酶和AMV的反转录酶、钙黄绿素和无菌蒸馏水。
优选地，上述试剂盒中，包括以下组分：外引物F3和外引物B3各10μmol/L、内引物FIP和内引物BIP各10μmol/L、环引物LoopF和环引物LoopB各10μmol/L、dNTPs 2.5mmol/L、甜菜碱5mmol/L、MgSO4 100mmol/L、MnCl2 25mmol/L、Bst聚合酶8U/μL、AMV的反转录酶10U/μL。
本发明还公开了一种使用本发明的试剂盒非诊断目的检测发热伴血小板减少综合症病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取样本RNA；
(2)将步骤(1)提取的样本RNA加入试剂盒中，进行环介导恒温扩增；
(3)检测步骤(2)得到的扩增产物，进行结果判定。
进一步地，步骤(2)中，所述的环介导恒温扩增反应条件为：63℃恒温反应35～60min，以无菌双蒸水为阴性对照；较为理想的反应条件为：63℃恒温反应40min。
进一步地，步骤(3)中，所述的对扩增产物的检测采用荧光显色法，这样可以使步骤2的环介导恒温扩增反应完成后不开盖，很好地杜绝了空气污染，有效防止了假阳性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.由于LAMP检测方法在60-65℃条件下等温扩增，在水浴锅中即可完成，不需要昂贵复杂的仪器，因此本发明提供的试剂盒使用方便，成本较低；
2.本发明所述的LAMP检测试剂盒特异性好，可特异性的检测发热伴血小板减少综合征病毒，对登革热病毒、森林脑炎病毒、黄热病病毒均呈阴性；
3.本发明所述的LAMP检测试剂盒灵敏度高，最低可检测到102拷贝发热伴血小板减少综合征病毒；
4.本发明所提供的试剂盒反应时间短，最快可在40min内观察到结果；
5.本发明所提供的试剂盒操作简单，只需将核酸样品、引物和钙黄绿素加入适量的LAMP反应预混液即可，简化了分别添加各种试剂的步骤；
6.本发明所提供的试剂盒反应结果直观准确，通过肉眼观察颜色直接进行判定，无需进行复杂操作；
7.本发明所提供的试剂盒操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低廉、反应快速、结果易于观察，可快速检测发热伴血小板减少综合征病毒，适用于现场和基层使用，易于大范围推广应用。
附图说明
图1本发明RT-LAMP反应体系在不同温度条件下反应产物的电泳图；M：2000bp DNAMarker；1～8：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、ddH2O；
图2本发明RT-LAMP反应体系在不同温度条件下反应产物荧光亮度图；1～8：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、ddH2O；
图3本发明外引物特异性检测电泳图；M：2000bp DNA Marker；1.ddH2O 2.发热伴血小板减少综合征病毒样品3.登革热病毒样品4.黄热病病毒样品5.森林脑炎病毒样品；
图4本发明外引物特异性检测荧光图；1.ddH2O 2.发热伴血小板减少综合征病毒样品3.登革热病毒样品；4.黄热病病毒样品5.森林脑炎病毒样品；
图5本发明引物敏感性检测电泳图；M：2000bp DNAMarker；1-6：100拷贝/μl，101拷贝/μl，102拷贝/μl，103拷贝/μl，104拷贝/μl，105拷贝/μl；
图6本发明引物敏感性显色检测实验结果；1-6：100拷贝/μl，101拷贝/μl，102拷贝/μl，103拷贝/μl，104拷贝/μl，105拷贝/μl；
图7本发明利用PCR方法进行敏感性试验的结果图；M：2000bp DNAMarker；1-6：
100拷贝/μl，101拷贝/μl，102拷贝/μl，103拷贝/μl，104拷贝/μl，105拷贝/μl。
具体实施方式
以下实施例中，发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever withthrombocytopenia syndrome virus)、登革热病毒(Dengue virus)、森林脑炎病毒(Russian spring-summer encephalitis virus)、黄热病病毒(Yellow fever virus)均由泰山医学院病媒生物与虫媒病实验室保存和提供；Trizol Reagent试剂盒、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、钙黄绿素(Calcein)、硫酸镁(MgSO4)均购自NEB公司，甜菜碱(Betaine)、氯化锰(MnCl2)购自Sigma公司，dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
1.RNA模板的制备
样本用Trizol Reagent试剂盒提取。
2.LAMP反应引物的设计
本发明通过对发热伴血小板减少综合征病毒S片段(GenBank:KP339888)序列进行生物信息学分析，确定保守区，并利用PrimerExplorer 5设计了用于检测发热伴血小板减少综合症病毒的特异性引物组，包括外引物(F3和B3)、内引物(FIP和BIP)、环引物(LoopF和LoopB)；
外引物F3：GCACATCATCTCAGGGGGA(SEQ ID No.1)；
外引物B3：GGCATCAGGGAAGATGTCAA(SEQ ID No.2)；
内引物FIP：GTGCTGCAGCAGCAGCCTTAACCTTCAGGTTCATGACGGC(SEQ ID No.3)；
内引物BIP：GCGCTACCCTTACAGGGGTGGTTGATGGCACTCCAGGAG(SEQ ID No.4)；
环引物LoopF：AGGAGTATCTCCCAGTGGGG(SEQ ID No.5)；
环引物LoopB：AGAGCCTGGTCTCTGCCCT(SEQ ID No.6)；
引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成浓度为10μM，-20℃保存备用。
3.反应条件的优化
为了得到最优化的反应温度，分别设置60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃进行交叉等温扩增反应，反应时间是30-60min，反应产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，从多次重复试验中确定最佳反应温度和反应时间，结果如图1所示，说明最佳反应温度为63℃，最适反应时间为40min。
4.RT-LAMP检测方法的特异性、敏感性分析
1)特异性分析
使用登革热病毒、森林脑炎病毒、黄热病病毒RNA为模板检测体系的特异性。
利用步骤3优化后的反应条件，得到的结果如图4所示：以发热伴血小板减少综合征病毒为模板的反应产物呈现亮绿色，以登革热病毒、森林脑炎病毒、黄热病病毒RNA分别为模板反应产物呈现浅橙黄色。结果显示检测体系的特异性良好，可特异的检测到发热伴血小板减少综合征病毒。
2)灵敏度分析
为了验证本发明LAMP方法的检测灵敏度，以提取的发热伴血小板减少综合征病毒总核酸作为模板，F3(SEQ ID No.1)和B3(SEQ ID No.2)为引物，利用AMV逆转录酶扩增目的片段。将目的片段克隆到T载体上，以含有目的基因的质粒为检测对象，计算拷贝数进行10倍稀释度稀释，使得最终核酸浓度分别为105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl，并以双蒸水作为阴性对照，结果显示(图5和6)，该方法对发热伴血小板减少综合征病毒的最低检测量为102拷贝/μl。
将上述10倍梯度稀释的质粒，用引物F3和B3进行PCR扩增反应。反应体系包括：12.5μl 2×Taq MIX、各10pmol引物、1μl模板，用无菌蒸馏水补足25μl。扩增循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸7min，反应产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。由电泳结果(图7)可知PCR最低检测浓度为103拷贝/μl。由此可见，本发明的检测方法对于发热伴血小板减少综合征病毒的检测敏感性是PCR法的10倍。
综上，本发明的发热伴血小板减少综合征病毒LAMP检测试剂盒灵敏度比常规PCR高10倍、反应时间短、灵敏度高、结果判定直观且不需要依赖PCR仪等昂贵设备，具有广阔的应用前景。
序列表
<110> 申请人名称：泰山医学院
<120> 基于RT-LAMP检测SFTSV的引物组及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacatcatc tcaggggga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcatcaggg aagatgtcaa 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgctgcagc agcagcctta accttcaggt tcatgacggc 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgctaccct tacaggggtg gttgatggca ctccaggag 39
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggagtatct cccagtgggg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agagcctggt ctctgccct 19

Claims (6)

1.基于RT-LAMP快速检测发热伴血小板减少综合症病毒的寡核苷酸，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB，其中：
外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；环引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，环引物LoopB的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
2.基于RT-LAMP快速检测发热伴血小板减少综合症病毒的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)权利要求1所示的外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP、环引物LoopF和环引物LoopB；
(2)LAMP扩增预混液、钙黄绿素和无菌蒸馏水。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：外引物F3和外引物B3各10μmol/L、内引物FIP和内引物BIP各10μmol/L、环引物LoopF和环引物LoopB各10μmol/L、2.5mmol/L的dNTPs、5mmol/L的甜菜碱、100mmol/L的MgSO4、25mmol/L的MnCl2、8U/μL的Bst聚合酶、10U/μL的AMV的反转录酶。
4.使用权利要求2或3所示的试剂盒非诊断目检测发热伴血小板减少综合症病毒的的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本RNA；
(2)将步骤(1)提取的样本RNA加入试剂盒中，进行环介导恒温扩增；
(3)检测步骤(2)得到的扩增产物，进行结果判定。
5.根据权利要求4所示的方法，其特征在于，步骤(2)中，环介导恒温扩增反应条件为：63℃恒温反应40min。
6.根据权利要求4所示的方法，其特征在于，步骤(3)中，对扩增产物的检测采用荧光显色法。
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汪川主编: "《分子生物学检验技术》", 31 July 2016, 四川大学出版社 *

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