CN108676921A - 一种用于禽腺病毒检测的lamp引物组及检测方法及其应用 - Google Patents

一种用于禽腺病毒检测的lamp引物组及检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及禽腺病毒检测方法，具体的，涉及一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组及检测方法。一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；其中外引物对的序列为：FAdV‑4‑F3，FAdV‑4‑B3；内引物对的序列为：FAdV‑4‑FIP，FAdV‑4‑BIP；环引物对的序列为：FAdV‑4‑ LF，FAdV‑4‑ LB。本发明建立的LAMP方法能够快速检测FadV，灵敏度高、特异性好，非常适用于检疫、科研、疫病监测工作中对禽腺病毒的检测鉴定，临床操作便捷，应用前景广阔。

Description

一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组及检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及禽腺病毒检测方法，具体的，涉及一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组及检测方法。
背景技术
自2015年6月开始，我国部分地区的肉鸡中爆发了一种传染和死亡速度快、死亡率高的传染病，临床以心包积液、肝脏病变为主要病变特征。经鉴定，最终确定病原为Ⅰ群禽腺病毒。目前，血清分型表明山东地区流行的禽腺病毒主要以血清4型（FAdV-4）为主，造成鸡群尤其是雏鸡群的死亡率较高，经济损失较大。
2000年Notomi等发明了环介导恒温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP），可以在等温条件下实现核酸扩增。LAMP技术的反应原理是：根据序列保守区域设计的一对外引物、一对内引物和一对环引物可以特异性识别靶序列上的六个独立区域，在嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus Stearothermophilus）Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～67℃范围30~60min内大量合成目标DNA，同时伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生，可以通过肉眼直接观察或者加入荧光染料观察颜色变化。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行高倍扩增，检测时间大大缩短，而且快速敏感，操作性强。
LAMP方法灵敏度高，比传统的PCR方法高2～5个数量级；反应时间短；临床使用不需要特殊的仪器；操作简单，不论模板是DNA还是RNA，肉眼可观察结果。
由于LAMP灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，容易造成样品的假阳性判定问题。针对这一情况，在肉眼观察的基础上，本发明同时另外使用实时浊度仪，每隔6秒测定反应管的浊度，并绘制成曲线来判断反应产物的阴阳性。另外一种是基于Te颜色改变的检测方法。Te是一种PH指示剂，根据反应液PH的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为无色，阳性时为亮绿色。由此，判定结果更为准确，对方法的建立和引物组反应特异性的诊断判断更为特异。
发明内容
本研究的目的是建立快速检测禽腺病毒FAdV-4的LAMP法，这种可视化的快速检测方法对疫情爆发调查、现场诊断、流行病学研究及疾病监测具有重要意义。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；其中外引物对的序列为：
FAdV-4-F3: AGTCTGGGCAACGACCTG；
FAdV-4-B3: GAATGTTGATGGTGAGGGC；
内引物对的序列为：
FAdV-4-FIP：TTACTGGTGTTGTGATCCATGGGCGCCAGCATCATCTACAACGAG；
FAdV-4- BIP：CTGATGCTGAGAAACGCCACCGGGCACCGAGTATAGAGC；
环引物对的序列为：
FAdV-4- LF：AAGTTGGCCATGAGGTTCA；
FAdV-4- LB：GATCAGACCTTCGTGGACT。
一种禽腺病毒检测方法，，所述方法包括使用上述的LAMP引物组进行LAMP扩增反应。
优选地，LAMP扩增反应的条件为：60-67℃恒温反应30-37min。
更优选地，上述LAMP扩增反应的条件为：63℃恒温反应35min。
进一步地，上述检测方法为每25μL 的LAMP扩增反应的反应体系中，含有外引物对的正向引物和反向引物各10pmol，内引物对的正向引物和反向引物各40pmol，环引物的正向引物和反向引物各20pmol。
一种禽腺病毒LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的LAMP引物组。
上述LAMP引物组在制备检测或诊断禽腺病毒的制剂中的用途。
本发明建立了快速检测禽腺病毒FAdV-4的基于肉眼观察、浊度分析曲线、变色指示剂判定的LAMP方法。使用实时浊度仪，每隔6秒测定反应管的浊度，并绘制成曲线来判断反应产物的阴阳性。另外一种是基于Te颜色改变的检测方法。Te是一种PH指示剂，根据反应液PH的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为无色，阳性时为亮绿色。由此，判定结果更为准确，对方法的建立和引物组反应特异性的诊断判断更为特异。
在60℃-67℃之间进行反应温度的判断，最终确定最佳反应温度为63℃。同时检测表明该方法仅仅在35 min之内即可检测到扩增曲线，无需凝胶电泳观察结果，大大减少了反应时间。
特异性试验表明：只有FAdV-4的核酸能够出现扩增曲线，而其他的参照病毒和ddH2O没有出现扩增曲线。
敏感性检测：模板DNA（经测量换算浓度为7.5×107 Copies/μL）做10倍比稀释（共8个稀释度）的基因组模板用于LAMP 反应，检测结果：LAMP能检测到样本的第7个稀释度，即浓度为75Copies/μL，仍可以得到有效扩增。而普通RT-PCR只能检测到第6个稀释度的模板。由此表明本发明的LAMP方法比普通PCR的灵敏度高10倍。
通过对临床的42份疑似禽腺病毒感染样品进行LAMP应用后证实：检测到14份阳性样品；后期的病毒分离和序列测定证明了此检测结果。
有益效果
本发明建立的LAMP方法能够快速检测FadV，灵敏度高、特异性好，非常适用于检疫、科研、疫病监测工作中对禽腺病毒的检测鉴定，临床操作便捷，应用前景广阔。
附图说明
图1为引物在基因中的位置示意图；
图2为最佳反应温度的筛选；
图3为样品的检测结果；
图4为敏感性检测的浊度结果；
图5为敏感性检测的Te染料判定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明技术方案，在围绕本发明所描述技术思想情况下，根据一般的技术知识和通常用的技术手段研究的多种方式替换或变更，都属于本发明的范围内。
实施例1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株 2015-2017年分离腺病毒FadV-4共7株(X1-X7)，对照毒株9-16分别为FAdV-8b、NDV、H9 AIV、IBV、AstV、ALV、CAV、大肠杆菌；均由本中心分离鉴定。
1.1.2 仪器与试剂
LAMP DNA Amplification Kit、可视染料、LAMP反应管、实时浊度仪La-320C均购自日本荣研化学株式会社；DNA/RNA提取Kit为北京百泰克生物公司；分光光度计NanoDrop ND-1000购自美国 Nanodrop公司。
1.2 方法
1.2.1探针和引物设计合成
根据FAdV-4的Helon基因（GenBank：KX421404）序列，进行特异性LAMP引物设计，软件网址：http://primerexplorer.jp/e/。将待扩增的序列分为六个独立的区域设计四条引物（内引物FIP 和BIP、外引物F3 和B3），同时根据两个茎环区域设计两条环引物（LB、LF）。通过实验优选设计1套扩增效率好，扩增速度快的LAMP引物，用于特异性的扩增靶基因。引物合成由北京奥科鼎盛生物公司合成并纯化。引物序列如下表1，引物位置见示意图1。
表1 FadV的LAMP引物组
1.2.2 核酸模板的制备
按照DNA/RNA提取Kit说明书分别FAdV-4共7株(X1-X7)的DNA，8号为ddH2O，对照毒株9-16为FadV-8b、NDV、H9 AIV、IBV、AstV、ALV、CAV、大肠杆菌亦分别提取DNA或者RNA。RNA样品按照Takara 公司RT Mix反转录成cDNA备用。
1.2.3 LAMP 反应
LAMP 25μl 反应体系：2×buffer 12.5μl、 酶混合物（EM）1μl、FIP和BIP各 40 pmol、F3和B3各10 pmol、LB和LF各20 pmol，模板2μl，余下为ddH2O。将混合物置于60℃-67℃恒温反应30-60min，并设双蒸水为对照。反应进行最佳反应温度和最佳反应时间的判定。
1.2.4 LAMP 反应结果判定
1.2.4.1 实时浊度仪检测
LAMP 在反应过程中发生以下反应式：
（DNA）n-1+dNTP —→ （DNA）n+P2O7 4-
P2O7 4-+2Mg2+ —→ Mg2P2O7↓
其中Mg2P2O7即焦磷酸镁，为白色沉淀。依据这个原理，使用实时浊度仪，每隔6秒测定反应管的浊度，并绘制成曲线来判断反应产物的阴阳性。
1.2.4.2基于Te颜色改变检测
Te是一种PH指示剂，根据反应液PH的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为无色，阳性时为亮绿色。
1.2.5 LAMP 方法敏感性实验
为了验证LAMP 方法的检测灵敏度，毒株X1的 DNA（经测量换算浓度为7.5×107 Copies/μL）） 做10倍比稀释，一共8个稀释梯度分别进行LAMP反应，采用显色法（Te）和浊度法来判定结果。同时采用普通RT-PCR进行8个稀释度模板的检测，来判定比较本发明建立的LAMP方法的敏感性。
2 结果与分析
2.1 最佳温度筛选
对引物进行最佳温度筛选，温度从60℃-67℃，梯度为1℃。从下图2可以看出62℃、63℃、64℃、65℃时LAMP反应启动较早，确定最佳温度选为63℃。
2.2 样本检测结果
从图3结果中可以看出： LAMP能检测阳性的模板（信号1-7；阳性样本X1-X7）；8号为ddH2O；对照毒株9-16分别为FAdV-8b、NDV、H9 AIV、IBV、AstV、ALV、CAV、大肠杆菌，未出现阳性信号。整个方法反应过程快速，仅35分钟就能给完成检测。
2.3 敏感性实验
毒株X1的DNA（经测量换算浓度为7.5×107 Copies/μL）做10倍比稀释（共8个稀释度）的基因组模板用于LAMP 反应，检测结果见下图4。LAMP能检测到样本的第7个稀释度，即浓度为75Copies/μL，仍可以得到有效扩增。而普通RT-PCR只能检测到第6个稀释度的模板。由此表明本发明的LAMP方法比普通PCR的灵敏度高10倍。其中图4和图5中编号1-8从左到右依次为模板浓度为原液、10、102、103~107倍稀释。
2.4 临床应用
通过对临床的42份疑似禽腺病毒感染样品进行LAMP应用后证实：检测到14份阳性样品；后期的病毒分离和序列测定证明了此检测结果。
将X1毒株(按照106TCID 50/100μL剂量）接种15只4周龄SPF鸡。采用建立的FAdV-4LAMP方法来检测FAdV-4在鸡体内分布情况。结果：在攻毒48h后，在实验鸡的口腔、喉头、泄殖腔、肝脏、十二指肠均可以检测到病毒，其中以肝脏含量最高。盐水对照组未检测到病毒存在。
禽腺病毒是禽体内的一种条件性病原体，一般情况下不表现临床症状，但在某些条件下，腺病毒会表现严重的致病性。2015 年以来，我国多个省份暴发了由 I 群禽腺病毒引发的疫病，给养殖生产造成了严重的经济损失。由此，加强本疫病的检测就尤为重要。传统的鸡胚分离接种周期长；普通PCR方法针对病毒含量很低的样品不能检出，费时；荧光定量PCR相对成本较高、需要昂贵的仪器，对技术人员要求也较高。因此急需建立一种操作简便、快速、高灵敏度的检测方法。本发明的整个方法特异性高、灵敏性强，反应过程快速，仅35分钟就能给完成检测。同时由于LAMP灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，由此针对可能出现的假阳性问题，针对这一问题，本方法使用实时浊度仪，无需开盖，每隔6秒测定反应管的浊度，并绘制成曲线来判断反应产物的阴阳性，避免了检测结果的误判。综上，本文建立的方法可快速灵敏准确地检测血清4型FAV，极大地缩短检测时间，临床操作便捷，应用前景广阔。
<110> 山东省农科院家禽研究所
<120> 一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组及检测方法及其应用
<160> 6
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
AGTCTGGGCA ACGACCTG 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
GAATGTTGAT GGTGAGGGC 19
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
TTACTGGTGT TGTGATCCAT GGGCGCCAGC ATCATCTACA ACGAG 45
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
CTGATGCTGA GAAACGCCAC CGGGCACCGA GTATAGAGC 39
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
AAGTTGGCCA TGAGGTTCA 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
GATCAGACCT TCGTGGACT

Claims (7)

1.一种用于禽腺病毒检测的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成；其中外引物对的序列为：
FAdV-4-F3: AGTCTGGGCAACGACCTG；
FAdV-4-B3: GAATGTTGATGGTGAGGGC；
内引物对的序列为：
FAdV-4-FIP：TTACTGGTGTTGTGATCCATGGGCGCCAGCATCATCTACAACGAG；
FAdV-4- BIP：CTGATGCTGAGAAACGCCACCGGGCACCGAGTATAGAGC；
环引物对的序列为：
FAdV-4- LF：AAGTTGGCCATGAGGTTCA；
FAdV-4- LB：GATCAGACCTTCGTGGACT。
2.一种禽腺病毒检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的LAMP引物组进行LAMP扩增反应。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应的条件为：60-67℃恒温反应30-37min。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，LAMP扩增反应的条件为：63℃恒温反应35min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，每25μL 的LAMP扩增反应的反应体系中，含有外引物对的正向引物和反向引物各10pmol，内引物对的正向引物和反向引物各40pmol，环引物的正向引物和反向引物各20pmol。
6.一种禽腺病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物组。
7.权利要求1所述的LAMP引物组在制备检测或诊断禽腺病毒的制剂中的用途。
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