CN111154922B - 一种SARS-CoV-2干粉化LAMP快速检测试剂盒 - Google Patents

一种SARS-CoV-2干粉化LAMP快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化O检测试剂、干粉化N检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉和显色指示剂组成，以上6种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的特异性引物对应SARS‑CoV‑2特异性靶基因ORF1ab和N序列的8个区段，通过加入显色指示剂，阴阳性显色差异明显，具有灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于对当前COVID‑19疫情中的SARS‑CoV‑2快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场对SARS‑CoV‑2的快速检测，具有广泛的应用前景。

Description

一种SARS-CoV-2干粉化LAMP快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种病毒快速检测试剂，特别涉及一种SARS-CoV-2干粉化LAMP快速检测试剂盒。
背景技术
由SARS-CoV-2感染引起新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情呈现全球蔓延的趋势。截至2020年3月，该病毒已导致国内外数十万人感染，对全球公共卫生安全构成了巨大威胁。SARS-CoV-2是一种正义单链RNA病毒，RNA基因组包含29891个核苷酸，编码9860个氨基酸，与SARS-CoV的核苷酸同源性为82%。COVID-19疫情的快速蔓延，导致疑似感染者和密切接触者数量激增。尽早进行病毒检测，不仅可以使感染者获得及时治疗，降低死亡风险，还能有效控制传染源，通过隔离切断传播途径。
SARS-CoV-2核酸检测可为诊断提供直接证据，在目前最新版本诊疗方案中，SARS-CoV-2核酸的检出仍是唯一确诊依据。实时荧光逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法是目前针对于SARS-CoV-2核酸检测的首选方法，如中国疾病预防控制中心就发布了针对于SARS-CoV-2的开放读码框1ab（ORF1ab）和核壳蛋白（N）特异性靶位基因核酸qRT-PCR检测所对应的引物和探针序列。但其有其天然的缺陷，需要昂贵的检测仪器、试剂和专业技术人员，检测成本高，更加无法满足突发事件中基层及现场的快速检测需求。也有新闻报导，已有企业开发出针对SARS-CoV-2核酸检测的LAMP试剂，但是其保藏条件相对苛刻，需要在-20℃进行保藏，以避免失效。
2000年日本研究人员Notomi等人发明了一种新型的核酸体外恒温扩增特异片段的分子检测技术，即环介导的恒温扩增技术。该技术利用2对特殊引物识别靶基因的6个区段，在恒温条件下（60～65℃），具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在1h内就可以对目的基因进行高效、特异的链置换扩增反应。与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于qPCR方法。而在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是Bst DNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前LAMP技术已被广泛应用众多微生物的检测应用中，不过尚未发布基于LAMP技术的SARS-CoV-2国家检验标准，且市场上基于LAMP技术的SARS-CoV-2快速诊断试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一种不足，提供一种可以常温运输的干粉化SARS-CoV-2快速检测试剂。该试剂盒涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足当前疫情中对SARS-CoV-2快速检测的需求。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于SARS-CoV-2检测的LAMP引物组，包括：SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab对应的LAMP引物组和SARS-CoV-2特异性基因N对应的LAMP引物组中的至少一组，其中：
SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab对应的LAMP引物组，由外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB组成，各引物的序列如下：
ORF1ab-F3：tgcttcagtcagctgatg
ORF1ab-B3：ttaaattgtcatcttcgtcctt
ORF1ab-FIP：tcagtactagtgcctgtgcccacaatcgtttttaaacgggt
ORF1ab-BIP：tcgtatacagggcttttgacatctatcttggaagcgacaacaa
ORF1ab-LF：gacgggctgcacttacaccg
ORF1ab-LB：agctggttttgctaaattccc；
SARS-CoV-2特异性基因N对应的LAMP引物组，由外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB组成，各引物的序列如下：
N-F3：gctgcaatcgtgctacaact
N-B3：tctgtcaagcagcagcaaag
N-FIP：tgcgactacgtgatgaggaacgttgccaaaaggcttctacgc
N-BIP：ttcaactccaggcagcagtaggcaagagcagcatcaccgc
N-LF：gcttgactgccgcctctgct
N-LB：tctcctgctagaatggctgga。
本发明的第二个方面，提供：
一种用于SARS-CoV-2的干粉化LAMP快速检测试剂盒，包括本发明第一个方面的LAMP引物组。
在一些实例中，所述检测试剂盒包括干粉化的O检测试剂、干粉化的N检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉和显色指示剂；
所述干粉化的O检测试剂中含有SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab对应的LAMP引物组；
所述干粉化的N检测试剂含有SARS-CoV-2特异性基因N对应的LAMP引物组。
在一些实例中，所述干粉化的O检测试剂冻干前含有0.6～2.2 mmol/L dNTPs、0.2～0.6 U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.5 U/μL AMV逆转录酶、0.1～0.9 μmol/L ORF1ab-F3/ORF1ab-B3、1.1～2.2 μmol/L ORF1ab-FIP/ORF1ab-BIP、0.5～2.0 μmol/L ORF1ab-LF/ORF1ab-LB、80～420 μmol/L以及含3%～6%海藻糖（w/v）、0.01%～0.1%甘氨酸（w/v）、0.1%～1%牛血清白蛋白（w/v）的冻干复合保护剂，余量为DEPC处理水。
在一些实例中，所述干粉化的N检测试剂冻干前含有0.6～2.2 mmol/L dNTPs、0.2～0.6 U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.5 U/μL AMV逆转录酶、0.1～0.9 μmol/L N-F3/N-B3、1.1～2.2 μmol/L N-FIP/N-BIP、0.5～2.0 μmol/L N-LF/N-LB、80～420 μmol/L以及含3%～6%海藻糖（w/v）、0.01%～0.1%甘氨酸（w/v）、0.1%～1%牛血清白蛋白（w/v）的冻干复合保护剂，余量为DEPC处理水。
在一些实例中，复溶液含有3～10 mmol/L MgSO4、7～13 mmol/L KCl、13～22mmol/L Tris-HCl、8～15 mmol/L (NH4)2SO4、0.1～0.3% Triton X-100以及0.3～1.6 mol/L甜菜碱。
在一些实例中，显色指示剂为由0.2～1.6 mmol/L的钙黄绿素和2.3～7.5 mmol/L的MnCl2按照混合得到。
在一些实例中，阳性对照干粉为SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab和N对应的人工合成RNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非SARS-CoV-2人工合成RNA冻干粉。
在一些实例中，还包括病毒RNA提取试剂。
在一些实例中，其使用方法包括如下步骤：
1)取待检样品，经病毒RNA提取试剂盒提取获得相应的RNA检测样品；
2)取所述干粉化的O检测试剂和所述干粉化的N检测试剂，分别加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，分别加入待检测核酸样品，对照管分别加入经DEPC处理水溶解的SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab和N对应的人工合成RNA作为阳性对照，以溶解的非SARS-CoV-2人工合成RNA为阴性对照，后按照一定比例加入显色指示剂，充分混匀、短暂离心后61℃恒温反应；
3)反应后结果判读：在自然光线充足的环境条件下，将反应结束后的反应管置于白色背景下观察，阴性对照反应前后无颜色变化呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，且O检测试剂管和N检测试剂管均为阳性时，判定为SARS-CoV-2检出；若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
本发明的有益效果是：
本试剂盒基于LAMP技术快速检测SARS-CoV-2，利用3对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的8个独立区域，在恒温条件下（60～65℃）进行高效特异的链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板等缺点，同时该方法操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，可对大样本实现成本低廉的快速筛选。本试剂盒，全程检测仅需1～2小时，检测结果可通过肉眼判读结果，更加直观清晰。
①该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，且便于常温运输，节约运输成本；
②该干粉化试剂已将部分反应组分按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，避免反复加样，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；
③恒温条件下反应，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；
④反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至10拷贝数/Test；
⑤利用特异性检测靶基因序列的3对特殊引物，特异性地识别靶序列上的8个独立区域，具有高度特异性，实现反应在30～45 min内完成；
⑥反应前加入显色指示剂，可通过肉眼颜色变化判读结果，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且避免反应后开盖鉴定扩增产物造成的气溶胶二次污染，减少了检测过程中暴露的风险。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
人工合成RNA的制备
分别人工合成SARS-CoV-2特异性靶基因ORF1ab和N对应的DNA片段，插入到pET-28a(+)质粒中，由上海生物工程有限公司完成，含以上DNA片段的pET-28a(+)质粒用含启动子和终止子序列的引物进行PCR扩增，纯化后得到的DNA扩增产物，用T7-RNA聚合酶试剂盒（HiScribe T7高效RNA合成试剂盒）进行体外转录，分别得到ORF1ab和N基因对应的阳性RNA，然后用DNase I进行消化处理，去除转录后残余的DNA模板，最后用RNA纯化试剂盒分别纯化得到ORF1ab和N基因对应的人工合成RNA，测定其浓度均为20～30 ng/μL，并分别计算其拷贝数浓度均约为1.0×1011拷贝数/μL，合成的RNA于-70℃保存待用。另外，同样以上述方法人工合成得到非SARS-CoV-2的RNA，-70℃保存待用。
引物的筛选
Figure 858975DEST_PATH_IMAGE002
引物序列的编号如下：
Figure 946754DEST_PATH_IMAGE004
使用浓度为1.0×105拷贝数/μL的上述人工合成ORF1ab和N基因对应的RNA样品作为模板，分别对以上的ORF1ab和N基因对应的3套LAMP引物组进行评价。用荧光染料10×SYBR Green I替代钙黄绿素混合反应液，分装后最后加入引物，用荧光检测仪设置恒温进行扩增，分3次反应，每次每组设置3个平行样品，记录每组引物所在体系的最早出峰时间。最终比较分析3次反应3个平行样的出峰时间。发现ORF1ab基因对应的引物组1的出峰效果最佳，N基因对应的引物组2的出峰效果最佳，且约在13～16分钟出峰，21～25分钟左右峰值最大，进入稳定区。而其他的引物组在15～18分钟陆续出峰，在24～30分钟后峰值最大。
试剂盒的制备
1)引物合成：按照ORF1ab基因对应的引物组1和N基因对应的引物组2提供的序列合成寡聚核苷酸引物，并定量配制；
2)制备该试剂冻干粉：按照表3所示在无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分，分装于容器中，置于液氮预冻后再按照常规冷冻干燥，最后得到干粉化的检测试剂；
3)制备复溶液：按照表4所示在无菌环境下混合复溶液混合液，置于容器中；
4)制备阳性对照干粉：向含有ORF1ab和N基因对应的人工合成RNA溶液分别加入3%的海藻糖（w/v）、0.05%甘氨酸（w/v）和0.5% BSA（w/v），分装后经上述冻干程序制备阳性对照干粉；
5)制备阴性对照干粉：向人工合成的非SARS-CoV-2 RNA溶液分别加入3%的海藻糖（w/v）、0.05%甘氨酸（w/v）和0.5% BSA（w/v），分装后经上述冻干程序制备阴性对照干粉；
6)配制显色指示剂：10×浓度，由0.7 mmol/L的钙黄绿素和3.8 mmol/L的MnCl2按照混合得到，置于避光管中；
7)包装：组装试剂盒，提供使用说明书，封装。
Figure 398595DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
下面结合实验，进一步说明本发明试剂的特性。
最低检验限测试
1)分别经DEPC处理水将以上ORF1ab和N基因RNA样品进行梯度稀释，其中稀释倍数分别为105、106、107、108、109、1010、1011和1012倍，进而得到对应拷贝数浓度各为1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0和0拷贝数/μL的8份稀释RNA样品；
2)以上述得到的8份ORF1ab和N基因RNA稀释样品为模板进行LAMP反应，分别取出O检测试剂和N检测试剂干粉化反应管，每管分别加入上述复溶液20 μL，待管中干粉完全溶解，分别加入对应的RNA稀释样品模板2.5 μL，各加入10×显色指示剂2.5 μL，充分混匀后紧盖，设置61℃恒温反应50 min；
3)反应结束后，观察各个反应管中溶液颜色，无颜色变化呈淡橙色则为阴性，呈荧光绿则为阳性。
结果：经观察各个反应管反应后溶液颜色，显示ORF1ab和N基因对应的最低检验限均在上述ORF1ab和N基因RNA样品1010稀释倍数处，即其最低检验限均可达到10拷贝数/Test。
特异性测试
1)取各种经RNA提取试剂盒提取获取的实际核酸样品（样品由广东省微生物研究所提供），包括诺如病毒、轮状病毒和札幌病毒，均为RNA病毒；
2)取出O检测试剂和N检测试剂冻干粉管，每管分别加入上述复溶液20 μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上实际核酸样品2.5 μL；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5 μL，后分别向所有各管中加入10×显色指示剂2.5 μL，充分混匀后紧盖，设置Biometra professional PCR仪至61℃恒温反应50 min；
3)反应结束后，在自然光线条件、白色背景对比观察反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，且O检测试剂管和N检测试剂管均与阳性对照管变化相同，表示有SARS-CoV-2检出，若阴阳性对照结果与上述任一情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。
检测结果见表5。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
结果显示，经本发明检测，以上实际核酸样品对应检测管反应前后都为淡橙色，显示为阴性，阴阳性对照结果也与预期结果一致。可见本发明具有较好的特异性，能有效鉴定SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因。
样品中SARS-CoV-2的快速检测
1)样品处理，取待检样品，经病毒RNA提取试剂盒提取获得相应的RNA检测样品；
2)恒温扩增反应，取出O检测试剂和N检测试剂冻干粉管，每管分别加入上述复溶液20 μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上RNA检测样品2.5 μL；另取2管分别做阴性对照和阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5 μL，后分别向所有各管中加入10×显色指示剂2.5 μL，充分混匀后紧盖，设置Biometra professional PCR仪至61℃恒温反应50 min；
3)反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，若O检测试剂管和N检测试剂管均与阳性对照管变化相同，表示有SARS-CoV-2检出，如颜色无变化，表示无检出。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东环凯生物科技有限公司
广东环凯生物技术有限公司
<120> 一种SARS-CoV-2干粉化LAMP快速检测试剂盒
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<400> 28
ttcaactcca ggcagcagta ggcaagagca gcatcaccgc 40
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcttgactgc cgcctctgct 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tctcctgcta gaatggctgg a 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgtctggtaa aggccaacaa 20
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gcaatttgcg gccaatgt 18
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gtggcagtac gtttttgccg agcaacaagg ccaaactgtc ac 42
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aacacaagct ttcggcagac gttgattagt tcctggtccc ca 42
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
agaagcctca gcagcagatt 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cagaacaaac ccaaggaaat t 21

Claims (8)

1.一种用于SARS-CoV-2的干粉化LAMP快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括干粉化的O检测试剂、干粉化的N检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉和显色指示剂；
所述干粉化的O检测试剂中含有SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab对应的LAMP引物组；所述干粉化的N检测试剂中含有SARS-CoV-2特异性基因N对应的LAMP引物组；
其中：
所述SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab对应的LAMP引物组，由外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB组成，各引物的序列如下：
ORF1ab-F3：tgcttcagtcagctgatg
ORF1ab-B3：ttaaattgtcatcttcgtcctt
ORF1ab-FIP：tcagtactagtgcctgtgcccacaatcgtttttaaacgggt
ORF1ab-BIP：tcgtatacagggcttttgacatctatcttggaagcgacaacaa
ORF1ab-LF：gacgggctgcacttacaccg
ORF1ab-LB：agctggttttgctaaattccc；
所述SARS-CoV-2特异性基因N对应的LAMP引物组，由外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB组成，各引物的序列如下：
N-F3：gctgcaatcgtgctacaact
N-B3：tctgtcaagcagcagcaaag
N-FIP：tgcgactacgtgatgaggaacgttgccaaaaggcttctacgc
N-BIP：ttcaactccaggcagcagtaggcaagagcagcatcaccgc
N-LF：gcttgactgccgcctctgct
N-LB：tctcctgctagaatggctgga。
2.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：所述干粉化的O检测试剂冻干前含有0.6～2.2 mmol/L dNTPs、0.2～0.6 U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.5 U/μL AMV逆转录酶、0.1～0.9 μmol/L ORF1ab-F3/ORF1ab-B3、1.1～2.2 μmol/L ORF1ab-FIP/ORF1ab-BIP、0.5～2.0 μmol/L ORF1ab-LF/ORF1ab-LB、80～420 μmol/L以及含3 w/v%～6 w/v %海藻糖、0.01 w/v %～0.1 w/v %甘氨酸、0.1 w/v %～1 w/v %牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为DEPC处理水。
3.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：所述干粉化的N检测试剂冻干前含有0.6～2.2 mmol/L dNTPs、0.2～0.6 U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.5 U/μL AMV逆转录酶、0.1～0.9 μmol/L N-F3/N-B3、1.1～2.2 μmol/L N-FIP/N-BIP、0.5～2.0μmol/L N-LF/N-LB、80～420 μmol/L以及含3 w/v %～6 w/v %海藻糖、0.01 w/v %～0.1w/v %甘氨酸、0.1 w/v %～1 w/v %牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为DEPC处理水。
4.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有3～10mmol/L MgSO4、7～13 mmol/L KCl、13～22 mmol/L Tris-HCl、8～15 mmol/L (NH4)2SO4、0.1～0.3% Triton X-100以及0.3～1.6 mol/L甜菜碱。
5.根据权利要求3所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：显色指示剂为由0.2～1.6 mmol/L的钙黄绿素和2.3～7.5 mmol/L的MnCl2按照混合得到。
6.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：阳性对照干粉为SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab和N对应的人工合成RNA冻干粉，阴性对照干粉为提纯的非SARS-CoV-2人工合成RNA冻干粉。
7.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：还包括病毒RNA提取试剂。
8.根据权利要求1所述的干粉化LAMP快速检测试剂盒，其特征在于：其使用方法包括如下步骤：
1)取待检样品，经病毒RNA提取试剂盒提取获得相应的RNA检测样品；
2)取所述干粉化的O检测试剂和所述干粉化的N检测试剂，分别加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，分别加入待检测核酸样品，对照管分别加入经DEPC处理水溶解的SARS-CoV-2特异性基因ORF1ab和N对应的人工合成RNA作为阳性对照，以溶解的非SARS-CoV-2人工合成RNA为阴性对照，后按照一定比例加入显色指示剂，充分混匀、短暂离心后61℃恒温反应；
3)反应后结果判读：在自然光线充足的环境条件下，将反应结束后的反应管置于白色背景下观察，阴性对照反应前后无颜色变化呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，且O检测试剂管和N检测试剂管均为阳性时，判定为SARS-CoV-2检出；若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。
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