CN107858453A

CN107858453A - 猪脑心肌炎病毒lamp检测引物对、检测方法及应用

Info

Publication number: CN107858453A
Application number: CN201711258029.XA
Authority: CN
Inventors: 白娟; 刘宗霞; 姜平; 张日腾; 范慧
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2018-03-30

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及猪脑心肌炎病毒LAMP检测方法，提取待检样品核酸，反转录制备cDNA作为模板，使用检测引物对进行反应，检测待检样品中是否含有猪脑心肌炎病毒。本发明方法反应时间短，具有高特异性，高灵敏性，良好的稳定性和重复性。

Description

猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对，还涉及猪脑心肌炎病毒LAMP检测方法，以及猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对的应用。

背景技术

猪脑心肌炎（encephalomycarditis，EMC）是一种人兽共患传染病，主要引起仔猪脑炎、心肌炎以及母猪的繁殖障碍等临床症状。猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒引起，该病毒为单股正链RNA病毒，属微RNA病毒科，心病毒属。基因组全长约7.8 kb，含有一个开放阅读框（ORF），共编码4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7种非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。2005年，杨汉春教授带领的科研团队首次分离到EMCV，自此证明了EMCV在我国猪群内已普遍存在。

伴随着EMCV在我国养猪业的流行，应用于该病的检测方法也不断地更新发展，从最早建立的病毒分离鉴定法到目前最常用的传统PCR检测法，都是为寻找一种更为简便快速的检测方法。常规PCR、Real-time PCR，ELISA等，存在时间长，成本高，操作复杂等缺点，难以在大规模的基层生产中普及应用。近年来，环介导等温核酸扩增法（LAMP）作为一种快速、简便、特异、灵敏的方法已被应用于各种疾病检测中，此方法是一种全新的核酸扩增技术，可依赖6条特异性引物，在 Bst DNA聚合酶作用下等温反应几十分钟，即可完成扩增。目前，该技术已被广泛应用于各种动物疫病检测中。但EMCV RT-LAMP相关方面的报道仍较少。专利方面几乎是空白状态。

发明内容

为了解决以上现有技术中常规PCR、Real-time PCR，ELISA等，时间长，成本高，操作复杂等缺点，本申请公开了一组检测方便、检测时间短、灵敏度及特异性高的猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对。

本发明还提供了猪脑心肌炎病毒LAMP检测方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对，由三对引物对组成，碱基序列分别如下：

F3：5’-TTGGTGCCTTCACCGTGA-3’，

B3：5’-AGCGGAAAGACTTTTGAGGT-3’，

FIP：5’-ATCACTGAGTTCGGGCAAGTCC-TCCGGCAGTCTAGAATCTGG-3’，

BIP：5’-CTGGGCCCCAATTTGACCCC-TGCCCCAAATTTCTGTCAGA-3’，

LF：5’-GTGATGCCTGACGTCATCTTC-3’，

LB：5’-CAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA-3’。

猪脑心肌炎病毒LAMP检测方法，提取待检样品核酸，反转录制备cDNA作为模板，使用含有权利要求1中的猪脑心肌炎LAMP检测引物对的25 μL LAMP反应体系进行反应，检测待检样品中是否含有猪脑心肌炎病毒。

所述的检测方法，优选25 μL LAMP反应体系如下：内引物FIP/BIP（40μmol/L）各1μL，外引物F3/B3（5μmol/L）各1 μL，环引物LF/LB（10μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mmol·L^-1）3.5μL，10×Thermopol Buffer 2.5 μL，甜菜碱（Betaine）2.0 μL，MgSO₄（100 mmol·L^-1）1.5 μL，Bst DNA聚合酶（8000U/mL）1.0 μL，模板cDNA 1.5 μL，灭菌ddH₂O补足。

所述的检测方法，优选反应条件为63℃恒温反应45min。

所述的检测方法，优选LAMP反应体系中加入SYBR Green I染料进行显色。

所述的检测方法，优选检测限为10³copies/uL。

所述的检测引物对或检测方法，在猪脑心肌炎病毒检测中的应用。

本发明所建立的EMCV环介导等温扩增检测法，通过不断优化其反应条件及反应体系进而使检测效果达到最佳，在63℃恒温条件下反应45min，即可完成扩增，大大缩短了反应时间。由于LAMP扩增产物呈阶梯状，且大小不等，很难判断产物的准确性，因此本发明用限制性内切酶 Xba I 将LAMP产物做酶切鉴定，进一步证明了实验的准确性。此外，LAMP反应具有高灵敏性，在操作过程中开盖极易造成气溶胶污染，产生假阳性。为此，本发明比较了三种可视性实验结果，尽量在不开盖的情况下完成检测，其中反应前在管盖中央加入SYBR GreenＩ染料效果更明显，但成本高，不利于大量样本的检测。而通过肉眼观察白色沉淀，成本低，可用于基层实际生产中，但对反应结果难以分辨，因此对其PCR管的透明度有一定的要求。本发明成功建立的LAMP法检出率较传统PCR高，且具有高特异性，高灵敏性。同时，在LAMP可视化检测方面的研究，为LAMP检测方法的进一步发展提供了一条全新的思路。

本发明的有益效果：

1）本发明所建立的EMCV环介导等温扩增检测法，通过不断优化其反应条件及反应体系进而使检测效果达到最佳，在63℃恒温条件下反应45min，即可完成扩增，大大缩短了反应时间；

2）检出率较传统PCR高，且具有高特异性，高灵敏性，最低检测浓度达到10³copies/uL；

3）本发明的LAMP检测方法对临床样品也具有较高的符合率，具有良好的稳定性和重复性。

附图说明

图1 LAMP反应条件和体系，A: 温度优化； B:时间优化；C；Bst DNA聚合酶浓度优化；D:内外引物浓度比优化； E:甜菜碱优化； F:Mg2 +优化，

图2 LAMP扩增产物可视化效果比较，A:不加染料观察； B: HNB显色结果； C:SYBRGreen I显色结果，

图3 RT-LAMP 反应产物内切酶鉴定，M：DNA分子质量标准；A：LAMP产物酶切前；B：LAMP产物酶切后，

图4 LAMP反应特异性试验，M：DNA分子质量标准；1.猪脑心肌炎病毒；2.猪伪狂犬病毒；3.猪圆环病毒；4.猪瘟病毒；5.猪繁殖与呼吸综合症病毒；6.阴性对照，

图5 LAMP反应灵敏性试验，A:LAMP电泳结果； B:RT-PCR； C:荧光定量PCR； D:LAMP-SYBR Green Ⅰ显色。M: DNA分子质量标准；1-9: 109copies/ul -102copies/ul；10: 阴性对照，

图6 LAMP反应重复性和稳定性试验，M: DNA分子质量标准； A、B: 两次不同时间提取的EMCV核酸；6:阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.1 材料

1.1.1 毒株

猪脑心肌炎病毒（EMCV）NJ08毒株、猪伪狂犬病毒（PRV）ZJ01毒株、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）BB0907毒株、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）SH毒株、猪瘟病毒（CSFV）C株等均由本实验室保存。

1.1.2 试剂

Bst DNA聚合酶大片段、硫酸镁（MgSO₄）和10×Thermopol Buffer购自NEB公司；核酸染料SYBR GreenⅠ购自Invitrogen公司；甜菜碱（Betaine）购自Sigma公司；HNB购自源叶生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据Genbank中登陆的EMCV NJ08株的VP1基因序列，利用在线生物软件PrimerExplorerV4在其保守区域筛选6条特异性引物，包括两条外引物（B3/F3），两条内引物（BIP/FIP）及两条环引物（LF/LB）（见表1）。

表1 引物序列

引物名称	序列(5,-3,)
		F3	TTGGTGCCTTCACCGTGA
B3	AGCGGAAAGACTTTTGAGGT
		FIP	ATCACTGAGTTCGGGCAAGTCC-TCCGGCAGTCTAGAATCTGG
BIP	CTGGGCCCCAATTTGACCCC-TGCCCCAAATTTCTGTCAGA
		LF	GTGATGCCTGACGTCATCTTC
LB	CAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA

1.2.2 病毒核酸的提取

采用TRIZOL法提取EMCV、PRRSV及CSFV病毒核酸，并进行反转录制备cDNA作为模板，PCV和PRV核酸按照酚氯仿法进行抽提，产物置-20°C保存。

1.2.3 LAMP反应体系的初步建立

反应体系（25 μL）如下：内引物FIP/BIP（40 μmol/L）各1 μL，外引物F3/B3（5 μmol/L）各1 μL，环引物LF/LB（10 μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mmol·L^-1）3.5 μL，10×ThermopolBuffer 2.5 μL，甜菜碱（Betaine）2.0 μL，MgSO₄（100 mmol·L^-1）1.5 μL，Bst DNA聚合酶（8000U/mL）1.5 μL，模板cDNA 1.5 μL，灭菌ddH₂O 补足。

1.2.4 LAMP反应条件及体系优化

根据反应条件的优化策略，反应温度设置56、58、60、62、64℃ 5个温度梯度进行LAMP反应，反应时间设置15、30、45、50、60 min 5个时间梯度进行LAMP反应，确定最佳反应条件。

在已优化的反应温度和反应时间下，分别对Bst DNA聚合酶浓度（1.5ul、1ul、0.8ul、0.6ul）、内、外引物浓度比（40μM:4μM、40:5、36:6、32:8）、甜菜碱（0ul、1ul、1.5ul、2ul、2.5ul）、Mg²⁺浓度（1ul、1.5ul、2μL、2.5ul）依次进行优化。反应结束后取5 μL反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，根据条带扩增效果确定其最佳反应体系。

优化后反应体系（25 μL）如下：内引物FIP/BIP（40μmol/L）各1 μL，外引物F3/B3（5μmol/L）各1 μL，环引物LF/LB（10μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mmol·L^-1）3.5μL，10×Thermopol Buffer 2.5 μL，甜菜碱（Betaine）2.0 μL，MgSO₄（100 mmol·L^-1）1.5 μL，BstDNA聚合酶（8000U/mL）1.0 μL，模板cDNA 1.5 μL，灭菌ddH₂O补足。63℃恒温反应45min（见图1）。

本研究共比较三种不同的可视性实验：焦磷酸镁沉淀（见图2中A），羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue, HNB）显色（见图2中B），SYBR Green I 荧光显色（见图2中C）。结果表明，SYBR Green I 染色效果最佳。

1.2.5 LAMP产物酶切鉴定

用Primer Premier 5软件分析并筛选出单一的酶切位点XbaⅠ(识别TCTAGA)。酶切反应体系(20 μL)包括：XbaI 1.5 µL，10×Buffer 2 μL，LAMP产物1 μL，灭菌ddH₂O补足。最后，37℃反应1.5h，取15 μL的酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将LAMP反应产物于37℃下酶切1.5h，取15 μL的酶切产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，产生约178bp和147bp的目的条带，证明扩增产物正确（见图3）。

1.2.6 特异性实验

分别以猪脑心肌炎病毒（EMCV）NJ08毒株、猪伪狂犬病毒（PRV）ZJ01毒株、猪圆环病毒II型（PCV）SH毒株、猪瘟病毒（CSFV）C株、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）BB0907毒株提取的核酸为模板，进行LAMP扩增反应，确定该引物的特异性。除EMCV阳性样品扩增出梯形条带外，其他待检样品未见梯形条带，证明该引物具有特异性（见图4）。

1.2.7 敏感性实验

用已知浓度的阳性质粒(PET-32a-VP1)标准品做10倍倍比稀释(10⁹copies/µL~10¹copies/µL)，用LAMP检测方法和Real-time PCR方法以及RT-PCR 法同步进行敏感性比较，确定实验的敏感性。结果表明，LAMP方法可检测到10³copies/ul的EMCV病毒，比常规PCR的灵敏度高100倍，表明该实验灵敏性高（见图5）。

1.2.8 稳定性实验

分别以两次不同时间提取的EMCV阳性样品为模板，重复实验5次。比较上述两次结果是否具有一致性。以两次不同时间提取的EMCV阳性样品为模板，各重复实验5次。两次实验结果一致，表明本实验所建立的LAMP法具有良好的稳定性和重复性（见图6）。

1.2.9 RT-PCR检测EMCV

按施开创等^[7]方法进行。将上述提取的RNA样品反转录制得cDNA模板。PCR反应程序为（25μL反应体系）：95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，进行35个循环；72℃ 5min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.10 Real-time PCR检测EMCV

按 Yuan W等方法进行。PCR引物针对EMCV VP1基因序列。反应体系（20μL）: 2×PowerSYBR Green PCR Master Mix 10μL，引物F/R 400nmol/L，Rox Reference Dye 0.4μL，cDNA2μL，灭菌ddH₂O补齐。反应程序为：预变性95℃ 5min；95℃ 10s；60℃ 31s，循环数为40。

1.2.11 临床样本检测

用所建立的EMCV LAMP检测方法和常规PCR法同时对来自不同地区118份临床样本进行检测，比较两种检测方法的检测结果。

用LAMP检测方法和普通PCR法同时对临床上的118份样品进行EMCV检测，检测结果显示：LAMP法阳性检出率38.14%（45/118），RT-PCR阳性检出率27.12%（32/118)。表明本实验具有较高的符合率（见表2）。

表2 LAMP与RT-PCR检测临床样品EMCV结果的比较

2005年，猪脑心肌炎病毒（EMCV）首次在我国被分离，之后2005-2006年间国内13个省市的平均抗体阳性率达72%，该结果表明国内规模化养殖场已普遍感染EMCV。该病在临床上主要引起仔猪急性心肌炎及母猪生殖障碍。目前，该病虽未在我国造成重大疫情，但对我国养殖业已存在潜在威胁。因此，加强对该病的检测变得尤为重要。

本实验所建立的EMCV环介导等温扩增检测法，通过不断优化其反应条件及反应体系进而使检测效果达到最佳，大大缩短了反应时间。此外，LAMP反应具有高灵敏性，在操作过程中开盖极易造成气溶胶污染，产生假阳性。本实验成功建立的LAMP法检出率较传统PCR高，且具有高特异性，高灵敏性，为LAMP检测方法的进一步发展提供了一条全新的思路。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对、检测方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttggtgcctt caccgtga 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

agcggaaaga cttttgaggt 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atcactgagt tcgggcaagt cctccggcag tctagaatct gg 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctgggcccca atttgacccc tgccccaaat ttctgtcaga 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gtgatgcctg acgtcatctt c 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cagggaggat aagttacact gtgga 25

Claims

1.猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对，其特征在于由三对引物对组成，碱基序列分别如下：

F3：5’-TTGGTGCCTTCACCGTGA-3’，

B3：5’-AGCGGAAAGACTTTTGAGGT-3’，

FIP：5’-ATCACTGAGTTCGGGCAAGTCC-TCCGGCAGTCTAGAATCTGG-3’，

BIP：5’-CTGGGCCCCAATTTGACCCC-TGCCCCAAATTTCTGTCAGA-3’，

LF：5’-GTGATGCCTGACGTCATCTTC-3’，

LB：5’-CAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGA-3’。

2.一种使用权利要求1中的猪脑心肌炎病毒LAMP检测引物对的检测方法，其特征在于提取待检样品核酸，反转录制备cDNA作为模板，使用含有权利要求1中的猪脑心肌炎LAMP检测引物对的25 μL LAMP反应体系进行反应，检测待检样品中是否含有猪脑心肌炎病毒。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于25 μL LAMP反应体系如下：内引物FIP/BIP（40μmol/L）各1 μL，外引物F3/B3（5μmol/L）各1 μL，环引物LF/LB（10μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mmol·L^-1）3.5μL，10×Thermopol Buffer 2.5 μL，甜菜碱（Betaine）2.0 μL，MgSO₄（100 mmol·L^-1）1.5 μL，Bst DNA聚合酶（8000U/mL）1.0 μL，模板cDNA 1.5 μL，灭菌ddH₂O补足。

4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于反应条件为63℃恒温反应45min。

5.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于LAMP反应体系中加入SYBR Green I染料进行显色。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的检测方法，其特征在于检测限为10³copies/uL。

7.一种权利要求1所述的检测引物对或权利要求2-6中任一项所述的检测方法，在猪脑心肌炎病毒检测中的应用。