CN104673937A - 一种猪脑心肌炎病毒纳米pcr检测试剂盒及其检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。该试剂盒可用于检测猪脑心肌炎病毒。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行猪脑心肌炎病毒检测的方法，能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒，大大提高了猪脑心肌炎病毒的检测效率及猪脑心肌炎病毒的特异性扩增产量。

Description

一种猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测试剂盒及其检验方法

技术领域

本发明涉及猪脑心肌炎病毒的检测技术领域。

背景技术

猪脑心肌炎（Porcine encephalomyocarditis）是由脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV）引起的一种以脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍为主要特征的人兽共患传染病。自从1958年从患心肌炎的病猪中分离到EMCV以来，随后世界上一些养猪国家都曾有该病的发生、流行以及EMCV感染的报道，给养猪业造成了一定的经济损失。我国从病原学和血清学方面已经证实在不少养猪生产地区的规模化猪场存在EMCV的感染，对养猪生产潜在的危害受到关注。

EMCV的检测方法主要包括传统的病毒的分离、免疫荧光抗体染色、聚合酶链式反应（PCR）等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高 PCR 特异性和效率的添加剂显得极其重要。

纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒的纳米PCR检测手段。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒。

本发明所采取的技术方案是：一种用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。

引物是根据GenBank公布的猪脑心肌炎病毒序列，在其3D基因保守序列区域设计的一对特异性引物。

优选的，2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR buffer和dNTP Mixture组成。

优选的，反转录酶为M-MLV反转录酶。

优选的，反转录引物的序列为SEQ ID No.2所示。

优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。

其中，阳性对照可为将猪脑心肌炎病毒接种BHK-21细胞后，收集24～48小时细胞培养物。

本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪脑心肌炎病毒的产品中的应用。

应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有猪脑心肌炎病毒的方法，包括如下步骤：

1、病毒RNA的提取

（1）将250 μL经过预处理的待测样品加入750 μL TRIzol LS Reagent中，剧烈振荡2 min，室温放置5 min。加入250 μL氯仿，剧烈振荡1min，室温放置5min后，4℃ 12,000 rpm离心15 min，将上层水相转入新的离心管。（2）加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置15 min，4℃ 12,000 rpm离心15 min，轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇700～800μL，4℃ 12,000 rpm离心5 min，弃上清。（3）将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行PCR或贮存于-80℃备用。

待测样品可为脑、心脏、淋巴结。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，之后再进行RNA的提取。

2、反转录反应

  取上述步骤所得的病毒总RNA 11 μL，加入2 μL 10μM的反转录引物（SEQ ID No.2），4 μL 5×反转录缓冲液、0.5 μL反转录酶、0.5 μL RNA酶抑制剂、2 μL dNTP Mixture至20 μL，42℃水浴1～2 h，即得到cDNA溶液。

3、纳米PCR反应

    在反应管中加入10 μL 2×NanoPCR Mix、1 μL上述cDNA溶液、0.5 μL 10μM的上游引物（SEQ ID No.1） 、0.5 μL 10μM的下游引物（SEQ ID No.2），最后加入无核酸酶水至总体积为20 μL。

    混匀后按如下反应程序进行：94℃ 3min，1个循环；94℃ 10s, 56℃ 30 s，72℃ 25 s，共30个循环；72℃ 5 min 1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，若出现425 bp大小的条带则待测样品含有猪脑心肌炎病毒。

本发明提供了一对检测猪脑心肌炎病毒的特异性引物，利用其制成的纳米PCR试剂盒，能够快速、特异的检测猪脑心肌炎病毒。本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了猪脑心肌炎病毒的检测效率，并有效提高了猪脑心肌炎病毒的特异性扩增产量，减少了非特异性扩增，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测结果；

M：DL2000 Marker； 1：阳性对照；

图2为猪脑心肌炎病毒纳米PCR敏感性检测结果；

M: DL2000 Marker；1～6依次为10⁰～10^-5倍比稀释病毒核酸的扩增产物；7:阴性对照；

图3为猪脑心肌炎病毒纳米PCR特异性检测结果。

M:DL2000 Marker；1: 猪脑心肌炎病毒；2:猪瘟病毒；3:猪捷申病毒；4：猪肠道病毒；5：猪繁殖与呼吸综合征病毒; 6：阴性对照。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。 但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 一种检测猪脑心肌炎病毒的纳米PCR试剂盒最佳实施例

本实施例试剂盒包括：（1）猪脑心肌炎病毒RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇；（2）反转录试剂：5×反转录缓冲液、浓度为2.5 mM的dNTP Mixture、浓度为2.5 U/μL的M-MLV反转录酶、浓度为30 U/μL的RNA酶抑制剂和反转录引物；（3）纳米PCR反应试剂： 2×NanoPCR Mix 、上游引物、下游引物；（4）其他：阳性对照和无核酸酶水。其中，2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR buffer和dNTP Mixture组成，阳性对照为将猪脑心肌炎病毒接种接种BHK-21细胞后，收集24～48小时细胞培养物，引物为冻干粉，HPLC纯。本实施例试剂盒包含的引物序列见表1。

表1引物序列

引物	序列 (5’-3’)
		上游引物（SEQ ID No.1）	5' CAG AGG CTG ATG TAG ATG AAG TGG C 3'
下游引物（SEQ ID No.2）	5' CAG AAT GCA ATG CTC AAA TGG TGG A 3'

 实施例2 非诊断目的以纳米PCR法检测猪脑心肌炎病毒的方法

 本实施例检测方法采用实施例1中的试剂盒。取脑、心脏、淋巴结为待测样品。实际中，待测样品可为发病猪脾脏。

本实施例检测方法包括以下步骤 ：

1、病毒RNA提取  具体步骤如下：（1）将待测样品剪碎，按照1:5的质量体积比加入生理盐水后研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟，取上清。（2）分别取250 μL上述处理后待测样品以及阳性对照，加750 μL TRIzol LS Regent，剧烈振荡2 min，室温放置10 min。加入250μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置10min后，4℃ 12,000 g离心10 min，将600μL上层水相转入新的离心管。（3）在水相中加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30 min后，4℃ 12,000 g离心10 min，吸弃上清，加入DEPC处理的75%乙醇800μL轻轻振摇后，4℃ 7,500 g离心5 min。（4）将沉淀自然风干后，分别溶于11μL无核酸酶的水中即得RNA模板。

2、反转录反应：分别向上述11μL RNA模板中加入2μL浓度为 10μM的下游引物（SEQ ID No.2）、4 μL 5×反转录缓冲液、0.5 μL反转录酶、0.5 μL RNA酶抑制剂、2 μL dNTP Mixture至20 μL，42℃水浴1～2 h，即得到cDNA溶液。

3、纳米PCR反应：分别在反应管中加入10 μL 2×NanoPCR Mix、1 μL 上述cDNA溶液、0.5μL 上游引物（10μM）、0.5μL 下游引物（10μM），最后加无核酸酶水至体积为20 μL，混匀。

反应程序如下：94℃ 3min，1个循环；94℃ 10s, 55℃ 30 s，72℃ 25 s，共30个循环；72℃ 5 min 1个循环。

    4、电泳检测：反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，猪脑心肌炎病毒的阳性对照样本扩增产物的条带大小为425 bp，结果见图1。若待测样品电泳检测后出现425 bp大小的条带则含有猪脑心肌炎病毒，反之则不含有猪脑心肌炎病毒。

实施例3 猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测方法的敏感性试验

通过超微量分光光度计测量，计算的猪脑心肌炎病毒总RNA浓度为1.2×10⁷ copies/μL的核酸模板进行敏感性试验。同时采用纳米PCR与普通PCR方法对10倍稀释的猪脑心肌炎病毒核酸模板检测。

猪脑心肌炎病毒的纳米PCR和普通PCR操作过程按照实施例2 进行，其中，普通PCR反应将步骤3中的2×NanoPCR Mix换成2×PCR反应液，其组成如下：DNA聚合酶、2×PCR buffer、dNTP Mixture，其余操作过程保持不变。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示。可见，普通PCR最低能检测到1.2×10⁴ copies/μL猪脑心肌炎病毒核酸模板，而纳米PCR最低能检测到1.2×10² copies/μL猪脑心肌炎病毒核酸模板。纳米PCR反应是普通PCR反应敏感性的100倍。

实施例4 猪脑心肌炎病毒纳米PCR检测方法的特异性试验

按照实施例2的方法，分别对猪脑心肌炎病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus ，CSFV), 猪肠道病毒（porcine enteroviruse ，PEV), 猪捷申病毒（porcine teschovirus，PTV), 猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的标准参考毒株，以及灭菌超纯水的阴性对照进行纳米PCR反应，检测纳米PCR方法的特异性。以上扩增产物均用 1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。

结果如图3所示，猪脑心肌炎病毒核酸扩增出了与预期大小相符的425bp的条带，而阴性对照以及其他5种猪病核酸均未扩增出任何条带。上述结果表明本发明纳米PCR检测方法能特异性扩增猪脑心肌炎病毒核酸，而不与其它禽病病毒核酸发生交叉反应，本发明纳米PCR检测方法具有很好的特异性。

本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了猪脑心肌炎病毒的检测效率，并有效提高了猪脑心肌炎病毒的特异性扩增产量，具有检测快速、特异性高的优点。

Claims (7)

1.一种用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求１所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR buffer和dNTP Mixture组成。

3.根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述反转录酶为M-MLV反转录酶。

4.根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述反转录引物的序列为SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。

6.根据权利要求1所述的用于猪脑心肌炎病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照。

7.如权利要求 1～6 任一项所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪脑心肌炎病毒的产品中的应用。