CN105200163A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米pcr鉴别诊断试剂盒及其检验方法 - Google Patents
猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米pcr鉴别诊断试剂盒及其检验方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105200163A CN105200163A CN201510499430.7A CN201510499430A CN105200163A CN 105200163 A CN105200163 A CN 105200163A CN 201510499430 A CN201510499430 A CN 201510499430A CN 105200163 A CN105200163 A CN 105200163A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- respiratory syndrome
- porcine reproductive
- syndrome virus
- primer
- differential diagnosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 title claims abstract description 64
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 15
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 10
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 abstract 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 abstract 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000124740 Bocaparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N csfv Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 101150051014 NSP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000032625 disorder of ear Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR鉴别诊断试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括5×反转录缓冲液、dNTP？Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR？Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ？ID？No.1所示，下游引物的序列为SEQ？ID？No.2所示。该试剂盒可用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并区分毒株类型（经典株或高致病性毒株）。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的方法，能够快速、特异的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并区分毒株类型，大大提高了猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测效率及猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性扩增产量。
Description
技术领域
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种以猪繁殖障碍和呼吸道系统疾病为主要症状的传染病。目前，我国猪群主要流行经典猪繁殖与呼吸综合征病毒（Classicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,C-PRRSV）与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,HP-PRRSV），两种毒株基因组的主要区别是HP-PRRSVNSP2基因存在30个不连续氨基酸的缺失，而C-PRRSV没有缺失。
PRRSV的鉴别诊断方法主要包括传统的病毒分离、血清学实验、聚合酶链式反应（PCR）等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂显得极其重要。
纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的纳米PCR诊断手段。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的区分猪繁殖与呼吸综合征病毒。
本发明所采取的技术方案是：一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米鉴别诊断PCR试剂盒，包括5×反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示。
引物是根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列，在其NSP2基因保守序列区域设计的一对特异性引物。
优选的，2×NanoPCRMix由DNA聚合酶、2×NanoPCRbuffer和dNTPMixture组成。
优选的，反转录酶为M-MLV反转录酶。
优选的，反转录引物的序列为SEQIDNo.2所示。
优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。
其中，阳性对照可为将猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性毒株分别接种Marc-145细胞后，收集72～96小时细胞培养物，测定TCID50，通过甲醛灭活后，两种毒株混合，最终含量均为105TCID50/mL。
本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。
应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括如下步骤：
1、病毒RNA的提取
（1）将250μL经过预处理的待测样品加入750μLTRIzolLSReagent中，剧烈振荡2min，室温放置5min。加入250μL氯仿，剧烈振荡1min，室温放置5min后，4℃12,000rpm离心15min，将上层水相转入新的离心管。（2）加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，4℃12,000rpm离心15min，轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇700～800μL，4℃12,000rpm离心5min，弃上清。（3）将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行PCR或贮存于-80℃备用。
待测样品可为病死猪肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏等组织。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，之后再进行RNA的提取。
反转录反应
取上述步骤所得的病毒总RNA11μL，加入2μL10μM的反转录引物（SEQIDNo.2），4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1～2h，即得到cDNA溶液。
2、纳米PCR反应
在反应管中加入10μL2×NanoPCRMix、1μL上述cDNA溶液、0.5μL10μM的上游引物（SEQIDNo.1）、0.5μL10μM的下游引物（SEQIDNo.2），最后加入无核酸酶水至总体积为20μL。
混匀后按如下反应程序进行：94℃3min，1个循环；94℃10s,55℃30s，72℃4820s，共30个循环；72℃5min1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，若出现691bp大小的条带则待测样品含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，若出现781bp大小的条带则待测样品为经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒。
本发明提供了一对鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物，利用其制成的纳米PCR试剂盒，能够快速、特异的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒。本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测效率，并有效提高了猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性扩增产量，减少了非特异性扩增，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR鉴别诊断结果；
M：DL2000Marker；1：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）；2：经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒（C-PRRSV）；
图2为猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR特异性检测结果。
M:DL2000Marker；1：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）；2：经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒（C-PRRSV）；3：猪瘟病毒（CSFV）；4：猪圆环病毒2型（PCV2）；5：猪伪狂犬病毒（PRV）；6：猪博卡病毒（PboV）
图3为猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR敏感性检测结果；
A:高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）；B：经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒（C-PRRSV）；M:DL2000Marker；1-9：依次为100-10-8倍比稀释病毒核酸的RT-PCR扩增产物；11-19：依次为100-10-8倍比稀释病毒核酸的纳米PCR扩增产物
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的纳米PCR鉴别诊断试剂盒最佳实施例
本实施例试剂盒包括：（1）猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇；（2）反转录试剂：5×反转录缓冲液、浓度为2.5mM的dNTPMixture、浓度为2.5U/μL的M-MLV反转录酶、浓度为30U/μL的RNA酶抑制剂和反转录引物；（3）纳米PCR反应试剂：2×NanoPCRMix、上游引物、下游引物；（4）其他：阳性对照和无核酸酶水。其中，2×NanoPCRMix由DNA聚合酶、2×NanoPCRbuffer和dNTPMixture组成，阳性对照为将猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性毒株分别接种Marc-145细胞后，收集72～96小时细胞培养物，测定TCID50，通过甲醛灭活后，两种毒株混合，最终含量均为105TCID50/mL。引物为冻干粉，HPLC纯。本实施例试剂盒包含的引物序列见表1。
表1引物序列
| 引物 | 序列 (5’-3’) |
| 上游引物（SEQ ID No.1） | GCAGCTGAGCAGGTCGATTTA |
| 下游引物（SEQ ID No.2） | TAGCCGCATCACAAGCCTCAC |
实施例2非诊断目的以纳米PCR法区分猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法
本实施例检测方法采用实施例1中的试剂盒。取病死猪肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏为待测样品。
本实施例检测方法包括以下步骤：
1、病毒RNA提取具体步骤如下：（1）将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，取上清。（2）分别取250μL上述处理后待测样品以及阳性对照，加750μLTRIzolLSReagent，剧烈振荡2min，室温放置10min。加入250μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min后，4℃12,000g离心10min，将600μL上层水相转入新的离心管。（3）在水相中加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min后，4℃12,000g离心10min，吸弃上清，加入DEPC处理的75%乙醇800μL轻轻振摇后，4℃7,500g离心5min。（4）将沉淀自然风干后，分别溶于11μL无核酸酶的水中即得RNA模板。
2、反转录反应：分别向上述11μLRNA模板中加入2μL浓度为10μM的下游引物（SEQIDNo.2）、4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1～2h，即得到cDNA溶液。
3、纳米PCR反应：分别在反应管中加入10μL2×NanoPCRMix、1μL上述cDNA溶液、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM），最后加无核酸酶水至体积为20μL，混匀。
反应程序如下：94℃3min，1个循环；94℃10s,55℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃5min1个循环。
4、电泳检测：反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性样本扩增产物的条带大小为691bp，经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性样本扩增产物的条带大小为781bp，结果见图1。
实施例3猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR鉴别诊断方法的特异性试验
按照实施例2的方法，分别对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）、经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒（C-PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪博卡病毒（PboV）进行扩增，检测纳米PCR方法的特异性。以上扩增产物均用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果如图2所示，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒扩增出了与预期大小相符的691bp的条带，经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒扩增出了与预期大小相符的781bp的条带，而其他4种猪源病毒核酸均未扩增出任何条带。上述结果表明本发明纳米PCR检测方法能特异性扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，本发明纳米PCR检测方法具有很好的特异性。
实施例4猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米PCR鉴别诊断方法的敏感性试验
通过超微量分光光度计测量，计算猪繁殖与呼吸综合征病毒总RNA浓度为4.3ng/μL的核酸模板进行敏感性试验。同时采用纳米PCR与普通PCR方法对10倍稀释的猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸模板检测。
猪繁殖与呼吸综合征病毒的纳米PCR和普通PCR操作过程按照实施例2进行，其中，普通PCR反应将步骤3中的2×NanoPCRMix换成2×PCR反应液，其组成如下：DNA聚合酶、2×PCRbuffer、dNTPMixture，其余操作过程保持不变。
用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图3所示。可见，针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与经典株猪繁殖与呼吸综合征病毒，普通PCR均最低能检测到4.3×10-3ng/μL病毒核酸模板，而纳米PCR均最低能检测到4.3×10-5ng/μL病毒核酸模板。纳米PCR反应是普通PCR反应敏感性的10倍。
本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测效率，并有效提高了猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性扩增产量，具有检测快速、特异性高的优点。
Claims (7)
1.一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒，包括5×反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo.2所示。
2.根据权利要求１所述的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于所述2×NanoPCRMix由DNA聚合酶、2×NanoPCRbuffer和dNTPMixture组成。
3.根据权利要求1所述的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于所述反转录酶为M-MLV反转录酶。
4.根据权利要求1所述的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于所述反转录引物的序列为SEQIDNo.2所示。
5.根据权利要求1所述的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。
6.根据权利要求1所述的用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的纳米PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照。
7.如权利要求1～6任一项所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510499430.7A CN105200163A (zh) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米pcr鉴别诊断试剂盒及其检验方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510499430.7A CN105200163A (zh) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米pcr鉴别诊断试剂盒及其检验方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105200163A true CN105200163A (zh) | 2015-12-30 |
Family
ID=54948117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510499430.7A Pending CN105200163A (zh) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米pcr鉴别诊断试剂盒及其检验方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105200163A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105648119A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-06-08 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法 |
| CN107058620A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-18 | 中国农业科学院特产研究所 | 牛传染性鼻气管炎病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法 |
| CN108611439A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-10-02 | 河北农业大学 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343670A (zh) * | 2008-08-25 | 2009-01-14 | 湖南省兽医总站 | 高致病性猪蓝耳病病毒rt-pcr快速检测试剂盒 |
| US20140335118A1 (en) * | 2011-12-30 | 2014-11-13 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide-based marker vaccine and diagnostic system for effective control of porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) |
| CN104651532A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-05-27 | 河北农业大学 | 用于新城疫病毒检测的纳米pcr试剂盒及其应用 |
-
2015
- 2015-11-20 CN CN201510499430.7A patent/CN105200163A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343670A (zh) * | 2008-08-25 | 2009-01-14 | 湖南省兽医总站 | 高致病性猪蓝耳病病毒rt-pcr快速检测试剂盒 |
| US20140335118A1 (en) * | 2011-12-30 | 2014-11-13 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide-based marker vaccine and diagnostic system for effective control of porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) |
| CN104651532A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-05-27 | 河北农业大学 | 用于新城疫病毒检测的纳米pcr试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 周峰等: "2012-2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查", 《中国兽医学报》 * |
| 郝晓芳等: "高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105648119A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-06-08 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法 |
| CN105648119B (zh) * | 2016-03-30 | 2019-09-17 | 温氏食品集团股份有限公司 | 检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法 |
| CN107058620A (zh) * | 2017-03-10 | 2017-08-18 | 中国农业科学院特产研究所 | 牛传染性鼻气管炎病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法 |
| CN108611439A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-10-02 | 河北农业大学 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103275862B (zh) | 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| CN104673937A (zh) | 一种猪脑心肌炎病毒纳米pcr检测试剂盒及其检验方法 | |
| CN105483292A (zh) | 禽腺病毒4型pcr检测试剂盒及其检验方法 | |
| CN105695631B (zh) | 人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用 | |
| CN105506175A (zh) | 一种prrsv、pcv2、prv和csfv的多重pcr检测试剂盒 | |
| CN103060478B (zh) | 一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重rt-pcr方法 | |
| CN107338330A (zh) | 检测猪圆环病毒3型的实时荧光定量pcr引物、试剂盒和检测方法 | |
| CN104046704A (zh) | 一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法 | |
| CN103509882A (zh) | 猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr引物和探针 | |
| CN105200163A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒纳米pcr鉴别诊断试剂盒及其检验方法 | |
| CN103789451A (zh) | 一种检测柯萨奇病毒a6、a10型的荧光定量试剂盒 | |
| CN103571865A (zh) | 内含a型流感病毒m基因装甲rna标准物质 | |
| CN106676197A (zh) | 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用 | |
| CN105039585A (zh) | 用于鸡传染性支气管炎病毒rt-pcr检测的引物及含有该引物的试剂盒及其检测方法 | |
| CN102409109B (zh) | 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法 | |
| CN109234462A (zh) | 一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法 | |
| CN103981289B (zh) | 同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片 | |
| CN105256073A (zh) | 3型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法 | |
| CN101328507B (zh) | 肠道病毒ev71核酸荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN103276109A (zh) | 禽流感h7n9病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104711371A (zh) | 一种坦布苏病毒纳米pcr检测试剂盒及其检验方法 | |
| CN104745689A (zh) | 一种用于检测百日咳杆菌的引物、探针和试剂盒 | |
| CN104120192B (zh) | 水仙退化病毒巢式rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103205512A (zh) | 检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒 | |
| CN102534052B (zh) | 一种用于检测猪流感病毒的nasba方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151230 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |