CN106811552A - 荧光定量rt‑pcr检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量RT‑PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，所述检测方法是以鼠的脑组织的cDNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量RT‑PCR扩增，采集荧光信号。本发明的荧光定量RT‑PCR检测方法可以实现快速、准确、方便快捷、特异性地针对小鼠体内鼠脑心肌炎病毒核酸检测，灵敏度、重复性和特异性都可以保证。

Description

荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒 及方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。
背景技术
鼠脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMV)属于小RNA病毒科心病毒属成员，只有1个血清型。鼠是EMV的天然储存宿主，EMV可感染多种宿主动物，包括哺乳动物、啮齿类动物、节肢动物和人，其中猪的感染最普遍，也是最严重的动物。小鼠对EMV极为易感，主要表现为急性脑炎、心肌炎、糖尿病、睾丸炎、眼结膜炎等。EMV为单股正链的RNA病毒，基因组全长约7.8kb，有一个大的开放性阅读框(ORF)，其基因组结构与其他微小RNA病毒相似。猪源和鼠源毒株基因组同源性高达99.93％。有此可见，该病毒可在鼠和猪之间跨物种传播，能引致母猪繁殖障碍和仔猪致死性心肌炎，致死率可达100％。目前EMV流行范围越来越广，EMV也是一种重要的人兽共患病致病因子，有研究发现人类食用感染的猪肉，血清中检测到了EMV的病毒抗体。此病给养猪业造成严重经济损失，有研究表明猪与猪之间基本不会发生病原的传播，或者说传播能力极其的有限，基本都是通过跨种间传播，而小鼠便是EMV的天然储存宿主，所以从小鼠的源头扼杀EMV的传播，最为理想，可以大大的减少EMV在猪及其他有经价值的饲养动物中的流行和感染，从而减少经济损失。
在各种生物医学实验研究中，大鼠和小鼠是使用量最大、用途最多的实验动物。建立一种小鼠脑心肌炎病毒的可靠检测方法，对及时发现并监测动物的健康状况，降低因感染造成严重的经济损失，防止工作人员感染十分重要。目前，国内和国际上常用的鼠脑心肌炎病毒(EMV)感染的检测方法是血清学ELISA检测，其中鼠的采血，血清分离都是特别繁琐和耗时的，特别是在大型的实验动物饲养机构，每年的实验鼠的检测，采用传统ELISA方法太过于繁琐了，且现如今市场上有的鼠脑心肌炎病毒感染检测ELISA试剂盒，大部分为进口试剂盒，价格都在2000-3000元左右，而且仅可以检测96乘以2个样。因此，传统的方法存在着繁琐、局限性、灵敏度低、价格高等不足。
本发明拟建立一种快速、简便、敏感、特异的EMV荧光定量PCR检测方法，旨在为监测EMV提供方法支持。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对，所述引物对具有如SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列。
本发明还提供了一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的探针，采取了以下技术方案：
一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的探针，所述探针具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。
在其中一些实施例中，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。
本发明还提供了一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的试剂盒，采取了以下技术方案：
一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2所示的引物对、以及SEQ ID No:3所示的探针。
本发明还提供了一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的方法，采取了以下技术方案：
一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的方法，包括以下步骤：以鼠的脑组织的cDNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量RT-PCR扩增，采集荧光信号。
在其中一些实施例中，所述荧光定量RT-PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq10μL、ROX Reference Dye II0.2μL、cDNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探针0.8μL、加灭菌蒸馏水至20μL。
在其中一些实施例中，所述荧光定量RT-PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过设计出特异性的引物对和探针，优化荧光定量RT-PCR检测方法的反应条件，从而快速、准确、特异性地针对小鼠体内鼠脑心肌炎病毒核酸(EMV)进行检测，不仅可以实现对实验鼠的大样本筛查，也可以对细胞系和生物原材料进行外源因子检测；
2、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法只需收集能提取到微量的cDNA的组织即可，EMV主要在小鼠的脑、心、胰腺等器官大量复制，为了更好的监测效果，应该尽量收集脑、心、胰腺等组织样本进行cDNA的提取，且本发明仅需要合成引物对，探针，染料试剂盒，便可方便快捷精确的检测几千个样本，便捷廉价；
3、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法的最低检测限为3个拷贝数/μL，约10fgDNA，高于普通PCR方法1000倍，常见的小鼠病毒株均无特异性扩增，没发现交叉反应，批内和批间变异系数均小于2％，灵敏度、重复性和特异性都可以保证。
附图说明
图1为本发明实施例1的临床样本的检测结果(X-轴表示PCR循环数，Y-轴表示扩增反应的荧光值)；
图2为本发明试验例1中荧光定量PCR检测方法的标准曲线图(X-轴表示PCR循环数，Y-轴表示扩增反应的荧光值)；
图3为本发明试验例1中荧光定量PCR检测方法的动力学曲线图；其中，1-8号对应模板浓度依次为：3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100拷贝数/μL；9为阴性对照；
图4为本发明试验例1中普通PCR的检测结果，其中1-6号孔的模板浓度依次为3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101拷贝数；
图5为本发明试验例1中荧光定量PCR检测方法的特异性结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
实施例1荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒
1、实验样品
来自上海实验动物研究中心的小鼠的脑样品病料120份。
2、cDNA合成
取一小块小鼠的脑组织，加PBS加钢珠放入震荡器中震荡1min左右，离心4000rpm，2min，吸去上清，提取RNA。提取方法参照TIANamp Virus RNA Kit提取盒说明书，提取的核酸RNA进行反转录合成cDNA。
模板为提取的病毒RNA，引物对为OligdT18，进行反转录合成cDNA，反转录体系(40μL)为：RNA模板20μL，引物对2μL，5×反转录Buffer 8μL，dNTP(10mmol/L)4μL，Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)1μL，Prime Script反转录酶(200U)1μL，DEPC水4μL。42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴4min。-20℃保存备用。
3、设计引物对和探针
根据NCBI上发表的鼠脑心肌炎病毒PEC9毒株全基因组序列(DQ288856.1)，在其保守特异区域919-1022nt处，设计了引物对和探针：
上游引物对qRT-EMV-F，其序列为：
5’-CCACCTCCTCAGACAAGAATAAC-3’(SEQ ID No:1)
下游引物对qRT-EMV-R，其序列为：
5’-GCAGAGAG GTCAATGGAGTTT-3’(SEQ ID No:2)，
Taqman探针FAM-EMV，其序列为：
5’-FAM-CCTCGGAAGGCAATGAAGGTGTGA-3’-BHQ1(SEQ ID No:3)。
4、TaqMan荧光定量PCR检测
荧光定量PCR扩增反应总体系为20μL，其中：
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)10μL
ROX Reference Dye II(50×)0.2μL
cDNA模板2μL
引物SEQ ID No:1(10μmol/L)0.4μL
引物SEQ ID No:2(10μmol/L)0.4μL
探针SEQ ID No:3(10μmol/L)0.8μL
加灭菌蒸馏水至20μL。
荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环，采集荧光。
5、检测结果
检测结果如图1所示。结果表明，上海实验动物研究中心的小鼠中未出现鼠脑心肌炎病毒(EMV)的感染，利用本实施例的检测方法可以实现针对鼠脑心肌炎病毒的监控目的。在图1中，1：EMV标准品；2：小鼠微小病毒；3：小鼠细小病毒；4：小鼠肺炎病毒；5：小鼠肝炎病毒A59株；6：仙台病毒；7：鼠呼肠孤病毒3型；8：鼠痘病毒；9：阴性对照。
试验例1荧光定量RT-PCR的标准曲线的绘制及最佳线性范围的确定
本试验例检测了实施例1建立的EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法的特异性，敏感性和稳定性。
1、标准曲线和动力学曲线的绘制
人工合成鼠脑心肌炎病毒PEC9毒株(DQ288856.1)全基因组的919-1022nt DNA序列，合成并连接pUC57质粒中，构建EMV的质粒标准品pUC-EMV，作为EMV标准质粒。按EMV质粒标准品3×108拷贝数/μL为起始模板浓度，以倍比稀释次数(分别为3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100拷贝数/μL)和相应的Ct值绘制出标准曲线和动力学曲线，标准曲线如图2所示，从图2可知，当EMV的最终浓度分别在3×107～3×100拷贝数/μL时，其相关系数R2＝0.9974，标准曲线都具有良好的线关系，各个稀释度相关性好，误差较小；反应的扩增效率E＝2.28，说明扩增体系和条件优化的较好。动力学曲线如图3所示，EMV灵敏度可以达到30个拷贝/μL，且动力学扩增曲线指数增长阶段和平台期都完整，荧光定量PCR的结果是可靠的。
2、敏感性试验
将EMV的质粒标准品分别做8个稀释度从3×107～3×100拷贝数/μL，以倍比稀释为模板分别进行荧光定量PCR扩增，Ct值大于35，视为阴性，同时利用引物对SEQ ID No:1和SEQ ID No:2进行常规RT-PCR扩增。
检测结果如图3和图4所示，结果表明，利用本发明的方法检测EMV标准质粒的灵敏度可达3×100拷贝数/μL，而普通PCR最低可以检测到3×103拷贝数/μL，说明本发明的方法高于普通PCR方法1000倍。
3、特异性试验
通过本发明实施例1的检测方法，分别对小鼠通常感染的病毒，小鼠微小病毒(MVM)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠肝炎病毒A59株(MHV-A59)、仙台病毒(SEV)、小鼠呼肠孤病毒3型(Reo-3)和鼠痘病毒(ECT)均由上海实验动物研究中心提供。MVM和ECT提取病毒DNA，PVM、MHV-A59、SEV和Reo-3提取病毒总RNA，再反转录为DNA。在调整浓度后，分别作为模板进行EMV的实时荧光定量PCR反应，进行检测，验证方法的特异性。结果如图5所示，结果表明，除EMV标准品会有特征性的扩增曲线外，其他病毒均没有特征性的扩增曲线，证明本发明建立的荧光定量PCR检测方法特异性强，与其他常见的鼠类病毒株均无交叉反应。
4、重复性试验
以EMV质粒标准品中的3×106和3×104拷贝数/μL两个稀释度的作为模板，对这两个稀释度在不同时间段进行2次重复测定，每次对同一模板同时进行3次重复测定及设置3个重复孔，按照本发明实施例1所述的方法进行实时荧光定量PCR。其中：变异系数(β)＝标准偏差(SD)/平均数(X)，结果见表1。
表1.荧光定量PCR检测方法的重复性
表1结果表明批内和批间变异系数均小于2％，说明本发明建立的荧光定量PCR检测方法具有较好的重复性，结果稳定可靠。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
＜110＞中国农业科学院上海兽医研究所
＜120＞荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
＜130＞ 3
＜170＞PatentIn version 3.1
＜210＞ 1
＜211＞ 23
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜400＞ 1
ccacctcctcagacaagaataac 23
＜210＞ 2
＜211＞ 21
＜212＞ DNA
＜213＞人工序列
＜400＞ 2
gcagagaggtcaatggagtt t 21
＜210＞ 3
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞人工序列
＜400＞ 3
cctcggaaggcaatgaaggtgtga 24

Claims (7)

1.一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列。
2.一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQID No:3所示的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的探针，其特征在于，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。
4.一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对、以及权利要求2或3所述的探针。
5.一种荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：以鼠的脑组织的cDNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量RT-PCR扩增，采集荧光信号。
6.根据权利要求5所述的荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq10μL、ROX Reference Dye II0.2μL、cDNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探针0.8μL、加灭菌蒸馏水至20μL。
7.根据权利要求5所述的荧光定量RT-PCR检测鼠脑心肌炎病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环。
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