CN112746135A - 基于raa技术检测i群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒 - Google Patents
基于raa技术检测i群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒，所述引物探针组合中的引物和探针是以I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因为目的基因进行设计获得，所述引物探针组合应用在基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中。本发明中引物探针组合的设计实现了I群4型禽腺病毒能够通过RAA技术进行快速、准确的检测，弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。
Description
技术领域
本发明涉及I群4型禽腺病毒检测技术领域，具体地说涉及一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒。
背景技术
禽腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病病原体。多数禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，在混合感染时，禽腺病毒可成为条件性病原。有时禽腺病毒作为原发病原，可引起火鸡出血性肠炎，鹌鹑支气管炎和产蛋下降综合征等。Ⅰ群禽腺病毒中有A、B、C、D、E 5个种，12个血清型。大多数Ⅰ群禽腺病毒的致病性还未完全明确，不同血清型的致病性有较大差异。较为清楚的是鸡包涵体肝炎（IBH）、心包积液综合征（HPS）和肌胃炎等，很多血清型的毒株都可以引起鸡包涵体肝炎，可是引起心包积液综合征的毒株主要是致病性相对较强的血清4型毒株。
心包积液综合征于1987年在巴基斯坦卡拉奇附近一个叫安卡拉的小镇发生和报道，因此该病被称作安卡拉病。在剖检中发现发生心包积液综合症的心脏很像剥皮后的荔枝，因此也叫做荔枝心脏病。之后，该病逐渐在巴基斯坦、印度、伊朗、伊拉克、阿富汗、土耳其等国家流行，随后又在欧洲、俄罗斯、朝鲜、韩国、日本，美国、秘鲁和智利也有报道和记载。2010年山东某肉鸡场发生了FADV-8b（IBH）引起的包涵体感染，随后在山东、江苏、北京、辽宁、黑龙江、吉林等省份的白羽肉鸡和父母代种鸡群陆续发现此病。2012年江苏省某蛋鸡场发生了FADV-4引起的心包积液综合症（HPS）。2013年后该病在全国十多个省市广泛流行，蛋鸡、麻鸡以心包积液综合症为主，白羽肉鸡和父母代种鸡以包涵体肝炎为主。2016年发病区域有扩散趋势。目前关于该病毒的研究主要围绕形态学、致病性、基因序列分析等，还没有一种准确、快速的检测方法。
针对上述问题，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合，引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中，探针的5′端第23位T碱基标记羧基荧光素，第24位碱基连接脱碱基位点四氢呋喃，第25位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。
优选的，引物探针组合中的引物和探针是以I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因为目的基因进行设计获得，其中，所述下游引物的核苷酸序列为对应I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因的第1091位碱基前后的核苷酸序列的反向互补序列，且下游引物的核苷酸序列中与I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因第1091位碱基对应的碱基设为简并碱基R。
优选的，所述引物探针组合应用在非疾病诊断目的的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中，且基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测方法包括如下步骤：
（1）配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，其中，RAA反应体系中所使用的引物探针组合为如上所述的引物探针组合；
（2）RAA反应体系扩增；
（3）根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒，待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒的判定方式为：
在阴性对照RAA反应体系经扩增反应后无扩增曲线，且阳性对照RAA反应体系经扩增反应后出现扩增曲线的前提下，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后具有扩增曲线，则样品为阳性，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后无扩增曲线，则样品为阴性。
一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的试剂盒，包括上述的引物探针组合。
优选的，还包括RAA反应的试剂。
有益效果：
1、本发明提供的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合应用在基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中具有较好的灵敏性和特异性，其能够配合RAA技术对待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒进行快速、准确的检测，实现了对I群4型禽腺病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测。
2、本发明中引物探针组合的设计实现了I群4型禽腺病毒能够通过RAA技术进行快速、准确的检测，弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间，非常适用于野外或养殖场现场检测。
3、本发明提供的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的试剂盒应用于检测I群4型禽腺病毒中，该试剂盒为I群4型禽腺病毒的检测提供了便利。
附图说明
图1为用于I群4型禽腺病毒检测的引物探针组合的优化结果图。
图2为引物探针组合的灵敏度检测结果图。
图3为引物探针组合的特异性检测结果图。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
重组酶介导扩增(recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与重组酶聚合酶扩增（Recombinase PolymeraseAmplification，RPA）不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1小时内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适大量样本的快速检测。
实施例1
本发明提供了一种检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合，该引物探针组合中的引物和探针是以I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因（Hexon基因序列如SEQ ID NO:6所示）为目的基因进行设计获得，引物探针组合应用在基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中，本发明中引物探针组合的设计实现了I群4型禽腺病毒能够通过RAA技术进行快速、准确的检测，弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。
引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中，所述下游引物的核苷酸序列为对应I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因的第1091位碱基前后的核苷酸序列的反向互补序列，且下游引物的核苷酸序列中与I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因第1091位碱基对应的碱基设为简并碱基R（在2636条Hexon基因序列中第1091位碱基对应的碱基有T和C两种，下游引物取参考序列的反向互补序列，对应A和G，因此引物序列中设计成简并碱基R），探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中，探针的5′端第23位T碱基标记羧基荧光素（carboxyfluorescein，FAM），第24位碱基连接脱碱基位点四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF），第25位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。
实施例2
本发明提供的检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合应用在基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中，且基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测方法包括如下步骤：
（1）配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，其中，RAA反应体系中所使用的引物探针组合为实施例1中的引物探针组合；
（2）RAA反应体系扩增；
（3）根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒，待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒的判定方式为：
在阴性对照RAA反应体系经扩增反应后无扩增曲线，且阳性对照RAA反应体系经扩增反应后出现扩增曲线的前提下，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后具有扩增曲线，则样品为阳性，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后无扩增曲线，则样品为阴性。
该检测方法配合本发明提供的引物探针组合应用于对I群4型禽腺病毒的检测中，弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统PCR法相比，RAA法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间。
实施例3
本具体实施例中提供了两条上游引物、两条下游引物及一条探针进行组合形成四组不同的引物探针组合，其中一种组合为实施例1中的引物探针组合。具体的，两条上游引物分别为FAdV-4-HF1和FAdV-4-HF2，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，其中，上游引物FAdV-4-HF1所在区域对应的Hexon基因序列第862位碱基，在2636条Hexon基因序列中对应第862位碱基的碱基有C和T两种，因此引物序列中设计成简并碱基Y。两条下游引物分别为FAdV-4-HR1和FAdV-4-HR2，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，修饰后探针为FAdV-4-P，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:1---- FAdV-4-HF1：GCATGCAGGYCCAACTACAT
SEQ ID NO:2---- FAdV-4-HF2：CTACATCGGCTTCCGAGACAAC
SEQ ID NO:3---- FAdV-4-HR1：GTTGTTGAAGRCGCGCAC
SEQ ID NO:4---- FAdV-4-HR2：CGTCGTGGTCGTACTGGTC
SEQ ID NO:5----FAdV-4-P: 5′-FAM-CGAGACAACTTTATCAAC
CTACTGTACCACG ACTCGGGCGTCTGACTC-BHQ1-3′
四组不同的引物探针组合的组合方式如下：
组合1：FAdV-4-HF1、FAdV-4-HR1和FAdV-4-P
组合2：FAdV-4-HF1、FAdV-4-HR2和FAdV-4-P
组合3（对应实施例1）：FAdV-4-HF2、FAdV-4-HR1和FAdV-4-P
组合4：FAdV-4-HF2、FAdV-4-HR2和FAdV-4-P
利用实施例2中提供的检测方法，筛选最佳的引物探针组合，基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测方法包括如下步骤：
1）配制RAA反应体系，本具体实施例采用杭州众测生物科技有限公司的分子检测试剂（RAA-荧光型）进行RAA反应，RAA反应体系具体为：
反应缓冲液 25μL；
上游引物 2.1μL；
下游引物 2.1μL；
探针 0.6μL；
去除RNA酶的水 15.7μL；
醋酸镁 2.5μL；
荧光基础反应单元；
待检测的样品DNA模板或I群4型禽腺病毒DNA模板或去除RNA酶的水 2μL；
总体积 50μL；
其中，所述荧光基础反应单元为包含重组酶和聚合酶等的冻干粉，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10pmol/μL。
2）RAA反应体系扩增：扩增的条件为39℃下恒温扩增20min。
试验结果如图1所示，图中1、2、3、4分别对应组合3、组合1、组合4、组合2，实验结果表明，相同反应条件，组合3优于其他3个组合，因此将组合3的引物对和探针为最佳的引物探针组合。
实施例4 引物探针组合的检测灵敏度
参照DNA提取试剂盒说明书提取I群4型禽腺病毒DNA，测定所提取的DNA模板原始浓度，按照比例稀释至107拷贝/μL，再以10倍梯度稀释成106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL，分别取2μL作为反应模板，按照实施例3的检测方法检测组合3（对应实施例1）的引物探针组合的灵敏度。
结果如图2所示，图中1-6分别对应106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、10拷贝/μL，本发明设计的组合3的引物探针组合在I群4型禽腺病毒DNA模板浓度为106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL时出现扩增曲线，检测灵敏度为DNA终浓度为102拷贝/μL时能够保证检测时的灵敏性。
实施例5 引物探针的检测特异性
选取I群4型禽腺病毒以及其他鸡群常见病原的DNA作为组合3（对应实施例1）的引物探针的检测特异性的模板，其他鸡群常见病包括减蛋综合征病毒（EDSV）、鸡新城疫病毒（NDV）、禽流感（H9亚型）病毒（AIV）、禽呼肠弧病毒（ARV）、传染性法氏囊病毒（IBDV），分别提取I群4型禽腺病毒、减蛋综合征病毒的DNA以及其他鸡群常见病原RNA反转录形成的DNA作为引物探针的检测特异性的模板，按照实施例3的检测方法检测组合3（对应实施例1）中的引物探针的特异性。
结果如图3显示，图中出现扩增曲线的为I群4型禽腺病毒的检测样品，其他鸡群常见病原的样品和阴性对照曲线重合于水平线位置，结果表明，I群4型禽腺病毒DNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对I群4型禽腺病毒的特异性检测，不与其他鸡群常见病原发生交叉反应。
本具体实施例与实施例4的结合表明，实施例3中最终确定的组合3（对应实施例1）的引物和探针具有较好的灵敏性和特异性。
实施例6 临床样品的检测应用
1.样品采集：
采集鸡场病鸡肝脏样品共32份。采用PBS液（pH5.0～7.4，0.01mol/L）作为保存液（含青霉素2000 IU/mL、链霉素2000 IU/mL、制霉菌素1000 IU/mL，BSA 5 mg/mL）。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24小时内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。
2.样品制备
按1∶5（w/v）比例加无菌PBS匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22μm滤器过滤除菌后进行核酸提取。
3.核酸提取
参照DNA提取试剂盒说明书提取待检的32份临床样品、阳性对照和阴性对照DNA。若长时间保存，须置于-70℃条件下。
4. 鉴定
4.1 对比方法：常规PCR方法，作为对比方法。
PCR选用的引物序列为
SEQ ID NO:7-上游引物：AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG；
SEQ ID NO:8-下游引物:TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC
预期扩增长度为500bp。
PCR反应体系50μＬ：
rTaq 0.5 μＬ，
10×PCR Buffer 5μＬ，
10mmol/L dNTP 4μＬ，
25mmol/L MgCl2 4μＬ，
上、下游引物各2μＬ，
DNA 5μＬ，
ddH2O 27.5μＬ。
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳30min，观察结果。
4.2 样品检测
采用常规PCR方法和实施例3中提供的检测方法同时检测此临床样品，其中实施例3的检测方法中所使用的引物探针组合为实施例3最终确定的最优的引物探针组合。
4.3 检测结果
结果如表1所示，结果显示，采用常规PCR方法鉴定结果为有18份临床样品在预期的I群4型禽腺病毒显示区具有明显的条带出现，判定为I群4型禽腺病毒阳性，其余样品在预期的I群4型禽腺病毒显示区无条带出现，判定为I群4型禽腺病毒阴性；采用本发明中的方法鉴定结果为有18份临床样品有荧光信号，形成扩增曲线，判定为I群4型禽腺病毒阳性，其余样品均没有荧光信号，判定为I群4型禽腺病毒阴性；采用本发明中的方法鉴定为阳性的样品与采用常规PCR方法鉴定为阳性的样品一一对应，即采用常规PCR方法鉴定为阳性的样品，采用本发明中的方法鉴定也为阳性；阴性对照组在两种方法中均呈现为阴性，且阳性对照组在两种方法中均呈现为阳性，结果准确可信。
综上所述，采用本发明所提供的方法对32份临床样品进行检测的结果与常规PCR方法对32份临床样品进行检测的结果一致，结果均有18份样品判定为I群4型禽腺病毒阳性，其余样品均为阴性，所以说本发明提供的引物探针组合可以应用到RAA技术中并且采用RAA技术结合本发明提供的引物探针组合来检测I群4型禽腺病毒的检测方法是准确可行的，其可以应用于对I群4型禽腺病毒的检测中。本发明提供的引物探针组合可以应用到RAA技术中并结合RAA技术对待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒进行快速、准确的检测，实现了对I群4型禽腺病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测，满足了当前对于I群4型禽腺病毒检测的需求；且该检测方法是一种恒温检测方法，操作简单、用时短，非常适用于野外现场检测，为I群4型禽腺病毒的疫病防控提供助力。
表1 两种检测的方法检测临床样品的结果表
| 样品 | 本发明的方法 | 常规方法 |
| 阴性对照 | - | - |
| 阳性对照 | + | + |
| 1 | + | + |
| 2 | + | + |
| 3 | + | + |
| 4 | + | + |
| 5 | - | - |
| 6 | + | + |
| 7 | - | - |
| 8 | - | - |
| 9 | + | + |
| 10 | - | - |
| 11 | - | - |
| 12 | - | - |
| 13 | - | - |
| 14 | + | + |
| 15 | - | - |
| 16 | + | + |
| 17 | + | + |
| 18 | + | + |
| 19 | - | - |
| 20 | + | + |
| 21 | + | + |
| 22 | - | - |
| 23 | + | + |
| 24 | + | + |
| 25 | - | - |
| 26 | - | - |
| 27 | + | + |
| 28 | + | + |
| 29 | + | + |
| 30 | + | + |
| 31 | - | - |
| 32 | - | - |
注：表中“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
实施例7
本具体实施例提供了一种检测I群4型禽腺病毒的试剂盒，该试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的探针以及RAA反应的试剂，其中，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10pmol/μL。
上述检测I群4型禽腺病毒的试剂盒应用于检测I群4型禽腺病毒中，该试剂盒为I群4型禽腺病毒的检测提供了便利。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化均囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 山东信达基因科技有限公司
山东信得科技股份有限公司
<120> 基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合及试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgcaggy ccaactacat 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacatcggc ttccgagaca ac 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgttgaag rcgcgcac 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcgtggtc gtactggtc 19
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagacaact ttatcaacct actgtaccac gactcgggcg tctgactc 48
<210> 6
<211> 2829
<212> DNA
<213> 禽腺病毒(fowl adenovirus)
<400> 6
atgactgcgc ttactcccga cctgaccacg gcgacgccgc ggctgcagta ctttcatatc 60
gcgggccctg gcacccgaga gtatctatcc gaggatctcc agcagtttat ctcggccacg 120
gggagctact ttgacttgaa aaacaaattc aggcagacgg tcgtagctcc cactcgcaat 180
gtcaccaccg aaaaggcaca acgtctgcag atcagattct acccgatcca gacggatgac 240
acgccaaaca gctatcgcgt gcgctacagc gtcaacgttg gggacagctg ggtgttggac 300
atgggggcga cctacttcga cataaagggt gtgctggacc gcggaccttc cttcaagccg 360
tacggcggaa cggcttataa tccccttgcg ccaagagaag ctattttcaa cacctgggtg 420
gagagcactg gtcctcagac caatgtggtg ggacagatga ccaacgtgta cacaaatcag 480
accaggaacg acaagacggc cacgcttcag caggtcaata gcatctccgg ggtggttccc 540
aacgtcaacc tgggacccgg cctcagtcaa ctagcatccc gggccgacgt ggataatatt 600
ggcgtggtgg gacgtttcgc caaggtagac tcagcgggcg tgaagcaggc gtacggagcc 660
tatgtcaagc ccgtgaagga cgacgggtct cagtctctga accagaccgc gtactggctg 720
atggacaacg gaggtaccaa ctatctgggt gccctggctg tggaagacta cactcagacc 780
ctgagttacc ccgataccgt gctcgtgacc cctcccaccg cttaccagca agtcaactcc 840
ggcaccatgc gggcatgcag gcccaactac atcggcttcc gagacaactt tatcaaccta 900
ctgtaccacg actcgggcgt ctgcagcgga acgctcaact ccgagcgctc cggcatgaac 960
gtggtcgtgg aactccagga cagaaacaca gaactgagtt accagtacat gctggcggac 1020
atgatgtccc gtcatcacta cttcgcgctg tggaaccagg ccgtcgacca gtacgaccac 1080
gacgtgcgcg tcttcaacaa cgacggctac gaagagggcg tgcctactta cgccttcctg 1140
cccgacgggc acggggcggg cgaagacaac ggtcccgacc tcagcaatgt caaaatttac 1200
accaacggac agcaagataa gggcaacgtg gtggccggaa cggtttccac acagctcaat 1260
ttcggtacca ttccctccta cgagatcgac attgctgctg ccaccaggcg caacttcatc 1320
atgagcaaca ttgccgacta cctgcccgac aaatacaagt ttagcattcg cggtttcgac 1380
cctgttacag acaacatcga ccctaccacc tacttttaca tgaatcgcag ggttcccttg 1440
accaacgtgg tagacctgtt taccaacatt ggtgccagat ggtccgtgga ccagatggac 1500
aacgtcaatc ccttcaacca ccaccgtaac tgggggttga agtacaggtc tcagctgctc 1560
ggaaacagca gatactgccg tttccatatt caggtgccgc agaaatactt tgccatcaag 1620
aatctgctcc tgttgcccgg cacctacact tacgagtggg tcctcagaaa ggatcccaac 1680
atgattctgc agtccagcct tggcaacgac ttgcgcgcgg acggcgcgca gatcgtgtat 1740
accgaggtga accttatggc caatttcatg cccatggacc acaataccag caaccagctg 1800
gagctgatgt tgcgcaacgc taccaacgac cagaccttcg cggactactt gggcgccaag 1860
aacgctctct acaacgttcc ggccggctcc acgctgctga ccatcaatat tcccgccaga 1920
acatgggagg gtatgcgggg ctggtctttt acccgcctca aggcctcgga gacgccccag 1980
ctgggcgctc agtacgacgt cggtttcaag tattcaggct ccattcccta ttcggatggc 2040
accttttacc tgtcccacac gttccgcagt atgagcgtgt tgtttgatac ctctatcaac 2100
tggcctggca acgaccgtct gctcacacct aacctgttcg agatcaagag gccagtggcc 2160
accgacagcg aaggcttcac tatgtcgcag tgcgacatga ccaaggactg gttcctcgtg 2220
cagatggcca ccaactacaa ctacgtgtac aacggttata ggttctggcc tgacagacac 2280
tacttccact atgacttcct acgcaacttc gaccccatgt cgcgtcaggg ccccaacttc 2340
ctggacacca cgctgtacga cctggtgtcc agcactcccg ttgttaacga caccggctca 2400
cagccgtctc aggacaacgt gcgtaacaac tccggcttta tcgcccctcg cagctggccc 2460
gtatggaccg cacagcaggg cgaagcctgg cccgctaact ggccgtaccc gctgatcggg 2520
aacgacgcca tcagttccaa ccaaaccgtc aactacaaga agttcctgtg cgataactac 2580
ctctggaccg tgccgttcag ctcggacttt atgtatatgg gagagctgac cgatctgggt 2640
cagaacccca tgtacacaaa caactcccat agcatggtta tcaactttga gttggacccc 2700
atggatgaga atacttacgt gtacatgctg tacggggtat ttgataccgt tcgcgtgaac 2760
cagcccgagc gtaacgtgct agccatggct tacttccgta cgcctttcgc cacaggcaac 2820
gctgtgtaa 2829
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatttcgacc ccatgacgcg ccagg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggcgaaagg cgtacggaag taagc 25
Claims (5)
1.一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合，引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中，探针的5′端第23位T碱基标记羧基荧光素，第24位碱基连接脱碱基位点四氢呋喃，第25位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。
2.根据权利要求1所述的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合，其特征在于，引物探针组合中的引物和探针是以I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因为目的基因进行设计获得，其中，所述下游引物的核苷酸序列为对应I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因的第1091位碱基前后的核苷酸序列的反向互补序列，且下游引物的核苷酸序列中与I群4型禽腺病毒特异性Hexon基因第1091位碱基对应的碱基设为简并碱基R。
3.根据权利要求1所述的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合应用在非疾病诊断目的的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测中，且基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的检测方法包括如下步骤：
（1）配置阴性对照、阳性对照以及待检测样品的RAA反应体系，其中，RAA反应体系中所使用的引物探针组合为权利要求1所述的引物探针组合；
（2）RAA反应体系扩增；
（3）根据RAA反应体系的扩增曲线判定待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒，待测样品中是否含有I群4型禽腺病毒的判定方式为：
在阴性对照RAA反应体系经扩增反应后无扩增曲线，且阳性对照RAA反应体系经扩增反应后出现扩增曲线的前提下，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后具有扩增曲线，则样品为阳性，待检测样品的RAA反应体系扩增反应后无扩增曲线，则样品为阴性。
4.一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的试剂盒，其特征在于，还包括RAA反应的试剂。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113684313A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-11-23 | 河南农业大学 | 一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用 |
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