CN113684313A - 一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用，属于生物工程技术领域，该引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1‑2所示的特异性引物对，其探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；本发明提供的试剂盒是恒温扩增反应，在39℃条件下即可实现靶基因的有效扩增，可在20min内实现禽腺病毒4型核酸的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μL。本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为禽腺病毒4型核酸的快速检测筛查提供有效的技术手段。

Description

一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用。

背景技术

血清4型I群禽腺病毒(Fowl Adenovirus serotype 4，FAV4)是一种引起家禽心包积水-肝炎综合征(Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)的家禽传染性疾病病原，又称为安卡拉病。安卡拉病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区被发现并命名，此病严重危害养禽生产。该病最初在肉鸡发现，临床特征为3～5周龄的肉鸡突然死亡，剖检主要变化为心包积水和出血性肝炎。该病感染率可高达90％以上，死亡率在20％～75％，最高可达80％。现在该病毒还可以感染蛋鸡、鸭和鹅并导致严重死亡，危害养禽业的健康发展。

血清4型I群禽腺病毒(FAV-4)，病毒粒子无囊膜，直径70～90nm，呈二十面体对称结构。病毒粒子具有252个壳粒，其中二十面体的顶角壳粒为12个五邻体(penton)，五邻体和纤突的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。二十面体上还有240个非顶角壳粒，称为六邻体(hexon)，携带的抗原决定簇是中和抗体的靶标。Hexon蛋白是最主要的衣壳蛋白，包括位于病毒里面的保守片断和突出在病毒表面的变异环，含有特异的中和抗原决定基，也是重要的中和抗体靶标。

重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。反应可在37～42℃下连续进行，反应时间只需5～20分钟，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，非常适用于临床快速诊断。

实时荧光RAA技术是RAA基础反应体系与荧光探针结合起来的一种联用技术，通过在反应体系中加入一个核酸外切酶Ⅲ和荧光探针对模板扩增实现实时监测。与实时定量PCR比较，两者具有相同的灵敏度与特异性，而Real-time RAA检测过程明显缩短，荧光强度信号实时检测可由荧光信号检测器或扫描仪完成，是目前RAA技术应用最为广泛的检测方法。

目前实验室诊断禽腺病毒4型的方法主要是直接/间接免疫荧光试验、动物接种试验、酶联免疫吸附试验、免疫电泳试验等，这些检测对质量控制、操作互检和人员的专业能力要求较高，且时间较长，无法实现普及应用，无法满足禽腺病毒4型快速检测的需求。恒温扩增技术操作简单，不需要专业较高的技术人员即可进行操作，但其引物的设计难度较大，导致缺少恒温扩增的试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该引物组可特异性、灵敏扩增禽腺病毒4型。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于检测禽腺病毒4型的恒温荧光扩增引物组，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示的特异性引物对。

本发明还提供一种用于检测禽腺病毒4型的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

进一步地，所述探针的第33-34位核苷酸之间连接有荧光基团FAM、四氢呋喃和淬灭基团BHQ1，所述探针的3′末端连接有block修饰C3-Spacer。

本发明还提供一种上述的恒温荧光扩增引物组、上述的探针在制备用于检测禽腺病毒4型的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测禽腺病毒4型的恒温荧光试剂盒，包括上述的恒温荧光扩增引物组、上述的探针。

进一步地，所述恒温荧光试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应体系还包括：阳性对照、阴性对照、水解缓冲液和醋酸镁。

进一步地，所述恒温荧光试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应程序为：39℃30秒40个循环。

进一步地，将40μmol/L上下游引物各1μL和20μmol/L探针1μL与反应所需的酶冻干制成荧光型干粉反应管。使用时，在荧光型干粉反应管中加入42.5μL水解缓冲液，阳性对照/阴性对照/待检核酸各5μL，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁，盖上管盖，瞬时离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。反应程序为：39℃30秒，40个循环，采集FAM荧光信号。

本发明还提供一种检测禽腺病毒4型的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用上述的引物组、上述的探针进行恒温荧光扩增；

(3)根据扩增结果，判定待检样品中是否含有禽腺病毒4型。

进一步地，在步骤(3)中，判定待检样品中是否含有禽腺病毒4型的方法，包括：

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，且出峰时间≤20min；

阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min，为有效结果；

阳性对照与阴性对照均成立为有效结果；

②被检样本：

a.阳性：待检样品出峰时间≤20min，有明显指数增长，判断为阳性；

c.阴性：若出峰时间≥20min，Ct值≥40，无扩增曲线出现，判断为阴性。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以FAV-4HNJZ毒株(genebank登录号：KX640904.1)hexon gene为参考模板序列，经过比对分析，筛选AAV-4的保守区域(0～543，660～780，1306～1898)，根据三个保守区域设计探针引物，设计特异性引物及探针建立FAV-4特异的荧光型RAA检测方法。本发明的FAV-4核酸恒温荧光检测试剂盒在整个检测过程中，从DNA提取到出现检测结果，只需20min，大大简化了手工操作，缩短了检测时间。且本发明一次可检测多个样品，特别适合于大批样品的现场快速检测。

本发明提供的试剂盒是恒温扩增反应，在39℃条件下即可实现靶基因的有效扩增，可在20min内实现型FAV-4核酸的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μL。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为FAV-4核酸的快速检测筛查提供有效的技术手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为第一次引物筛选示意图；

图2为第二次引物筛选示意图；

图3为第三次引物筛选示意图；

图4为第四次引物筛选示意图；

图5为本发明禽腺病毒4型恒温荧光试剂盒的灵敏度验证结果；

图6为本发明禽腺病毒4型恒温荧光试剂盒的特异性验证结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1FAV-4核酸恒温荧光检测试剂盒引物及探针的设计

(1)靶基因的筛选

通过GenBank基因序列数据库，共下载截止到2021年8月2日所公布的全部的45株I群禽腺病毒血清4型基因组序列。如表1所示，应用DNASTAR Lasergene软件进行hexon gene序列保守性分析，同时筛选GC含量在30％～70％、没有正向/反向重复序列、回文序列的保守区域作为靶基因的候选区域。通过比对分析，选择FAV-4HNJZ毒株(genebank登录号：KX640904.1)hexon gene的保守区域作为引物的设计区域，筛选AAV-4的保守区域(0～543，660～780，1306～1898)三个保守区域设计探针引物。

表1 FAV-4Hexon参考基因序列

(2)引物、探针的设计和初筛

RAA核酸扩增技术对于引物设计与常规PCR引物设计有一定的区别，RAA荧光扩增扩增子的通常长度为100～200bp，探针的长度为46～52bp，不与特异性引物识别位点重叠，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；选择FAV-4HNJZ毒株(genebank登录号：KX640904.1)hexon gene的保守区域作为引物的设计区域，筛选AAV-4的保守区域(0～543，660～780，1306～1898)三个保守区域设计探针引物。筛选出最佳扩增效率的区域。

进一步，为了筛选出能够以单分子灵敏度检测模板DNA，在第一轮筛选的基础上，确定出最佳扩增效率的靶序列区域。在选择的靶区域筛选引物，上、下游引物和选择5个引物，从而产生25种可能的引物组合，通过矩阵法评估和比较其引物对的相对性能，确定最佳引物组合(见表2)。

引物筛选示意图见图1-4。

第一轮筛选：筛选AAV-4的三个保守区域(0～543，660～780，1306～1898)，确定最佳扩增效率靶基因序列区域。

第二轮筛选：在选择的靶区域，以不同的引物组合测试靶标序列的侧翼引物。

第三轮筛选：将第一次筛选所得的最佳引物向前和向后以1个碱基的速度移动其在模板上的位置而得到一系列引物，并以不同的引物组合进行测试。

第四轮筛选：将第二次筛选所得的最佳引物从3′末端逐一增减碱基而得到一系列引物，并以不同的引物组合进行测试。

表2第一轮筛选

(3)引物的第二次筛选

筛选出最佳靶序列区域0～543，在探针FAV-P2两侧，以不同的引物组合测试靶标序列的侧翼引物(如表3)。

表3第二轮筛选

(4)引物的第三次筛选

修整步骤(3)中确定的最佳引物组合1F1/1R1/FAV-P1，保持所选引物的长度不变，以1个碱基的速度向前或向后移动其在模板上的位置，直至达到之前被否决的引物，上、下游引物各选择6个引物，从而产生25种可能的引物组合，通过矩阵法评估和比较其引物对的相对性能，确定最佳位置的引物组合(见表4)。

表4第三轮筛选

(5)引物的第四次筛选

根据第二次筛选的结果，通过将所选引物的3′末端添加和去掉碱基来作进一步改进，上、下游引物各选择5个引物，从而产生25种可能的引物组合，以通过再次筛选这些引物来提高扩增性能(见表5)。

表5第四轮筛选

最终确定上游引物序列为2F1-4，下游引物序列为2R1-5，探针FAV-P1；

引物探针序列如下：

2F1-4(SEQ ID No.1)：5′-CCCACCCGAAATGTCACGACAGAAAAGGCTCAA-3′；

2R1-5(SEQ ID No.2)：5′-ACCCAACCGTCGCCCACATTGATGTTGTACCGCA-3′；

FAV-P1(SEQ ID No.3)：5-ACGTCAACTTCCACATCCAAGTGCCCCAAAAAT[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TCGCCATCAAAAACC[C3-Spacer]；-3′。

实施例2FAV-4核酸恒温荧光检测试剂盒重组载体的构建

人工合成FAV-4HNJZ毒株(genebank登录号：KX640904.1)hexon gene基因全长，克隆到pUC57载体上，得到pUC57-hexon重组质粒，作为阳性对照。

实施例3FAV-4核酸恒温荧光检测试剂反应体系的建立

将实施例2中构建的含有FAV-4hexon gene靶基因片段的pUC57-hexon重组质粒作为模板进行恒温扩增反应。筛选多组引物探针组合，最终将实施例1中描述的引物探针组合作为最佳组合。

试验阶段反应体系为：在荧光型干粉反应管中加入40μL水解缓冲液，加入40μmol/L上下游引物各1μL，20μmol/L探针1μL，然后加入5μL pUC57-hexon重组质粒DNA作为模板，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁(280mM)启动反应，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。

反应程序为：39℃30秒40个循环，此处采集FAM荧光信号。

实施例4FAV-4核酸恒温荧光检测试剂盒检测方法的建立

(1)在实施例2的基础上，将所选引物和探针与酶混合制成冻干粉组成荧光型干粉反应管。

试剂盒的检测方法为：在荧光型干粉反应管中加入42.5μL水解缓冲液，5μL阳性对照/阴性对照/待检核酸(也即三种试剂各5μL)，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁(280mM)，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。

反应程序为：39℃30秒40个循环，此处采集FAM荧光信号。

(2)结果判定

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤20min；阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min，为有效结果；均成立为有效结果；

②被检样本：

a.阳性：被检样本出峰时间≤20min，有明显指数增长，判断为阳性；

c.阴性：若出峰时间≥20min(Ct值≥40)，无扩增曲线，判断为阴性。

实施例5试剂盒灵敏度的验证

用紫外吸收法测重组质粒pUC57-hexon的浓度，调整浓度至10⁵copies/μL，用无核酶水对阳性质粒进行10倍倍比稀释，稀释范围为10^-1～10^-5，分别作为模板进行检测。按试剂盒的反应体系配制试剂和设置反应程序。

结果如图5所示，结果显示，本试剂盒的最低检出限为10copies/μL。

实施例5试剂盒特异性的验证

分别提取Ⅱ群禽腺病毒、Ⅲ群禽腺病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、马立克病毒核酸作为模板进行恒温扩增检测，按试剂盒体系配制试剂和设置反应程序。同时设立禽腺病毒4型核酸作为模板进行反应，作为阳性对照。

结果显示，禽腺病毒4型检测为阳性，其他病毒检测均为阴性，结果如图6。结果表明，本试剂盒特异性良好。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

郑州中道生物技术有限公司

<120> 一种禽腺病毒4型恒温荧光扩增引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccacccgaa atgtcacgac agaaaaggct caa 33

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acccaaccgt cgcccacatt gatgttgtac cgca 34

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgtcaactt ccacatccaa gtgccccaaa aattcgccat caaaaacc 48

Claims (9)

1.一种用于检测禽腺病毒4型的恒温荧光扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示的特异性引物对。

2.一种用于检测禽腺病毒4型的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的第33-34位核苷酸之间连接有荧光基团FAM、四氢呋喃和淬灭基团BHQ1，所述探针的3′末端连接有block修饰C3-Spacer。

4.一种权利要求1所述的恒温荧光扩增引物组、权利要求2或3所述的探针在制备用于检测禽腺病毒4型的试剂盒中的应用。

5.一种检测禽腺病毒4型的恒温荧光试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的恒温荧光扩增引物组、权利要求2或3所述的探针。

6.根据权利要求5所述的恒温荧光试剂盒，其特征在于，所述恒温荧光试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应体系还包括：阳性对照、阴性对照、水解缓冲液和醋酸镁。

7.根据权利要求5所述的恒温荧光试剂盒，其特征在于，所述恒温荧光试剂盒在用于实时荧光RNA恒温快速扩增时的反应程序为：39℃30秒40个循环。

8.一种检测禽腺病毒4型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用权利要求1所述的引物组、权利要求2或3所述的探针进行恒温荧光扩增；

(3)根据扩增结果，判定待检样品中是否含有禽腺病毒4型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，判定待检样品中是否含有禽腺病毒4型的方法，包括：

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，且出峰时间≤20min；

阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min，为有效结果；

阳性对照与阴性对照均成立为有效结果；

②被检样本：

a.阳性：待检样品出峰时间≤20min，有明显指数增长，判断为阳性；

c.阴性：若出峰时间≥20min，Ct值≥40，无扩增曲线出现，判断为阴性。

Images