CN108676922A

CN108676922A - 用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法

Info

Publication number: CN108676922A
Application number: CN201810792753.9A
Authority: CN
Inventors: 宋勤叶; 刘京; 李丽敏; 郭海勇; 陈立功
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2018-10-19

Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，具体公开一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法。所述引物和探针序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，其能特异性检测猪流行性腹泻病毒的野毒株。本发明TaqMan实时荧光定量PCR方法利用所述引物和探针对样品进行扩增，若Cq≤36，则判定为阳性，即样品为猪流行性腹泻病毒的野毒株。该方法特异性强，敏感性高，重复性好，临床检出率高，为PED的快速检测与防治提供重要技术手段。

Description

用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(PED virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，主要危害7～10日龄仔猪，引起腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。该病冬季多发，但近年来发病季节性不明显，一年四季均有发生。该病首先在英国暴发，而后遍及全球，我国于1976年首次对PED进行报道。2010年以来， PED在亚洲尤其是中国的流行相当严重，首先在我国华南地区暴发，随后遍及全国大部分省的猪场。此次PED暴发是由PEDV的变异株引起的，其临床症状、发病率和死亡率均比以前的PED严重。主要表现为流行范围广、初生仔猪发病率和死亡率高。

疫苗免疫是当前防控PED的重要措施，以CV777减毒株为代表的活疫苗临床应用普遍，导致常规实验室诊断方法不能快速区分野毒株与疫苗株。ORF3 基因是PEDV的辅助基因，其部分片段的缺失可导致PEDV毒力减弱，是鉴别 PEDV野毒株和疫苗弱毒株的重要靶标。PED的诊断方法有病原学、血清学和分子生物学等多种方法。实时荧光定量PCR技术是由常规PCR技术衍生而来的一种新的高特异性的核酸定量技术，并能够对目的核酸的扩增情况进行实时监测，该技术在病原检测和传染病诊断方面已得到广泛应用。但目前尚未见有根据PEDV野毒株和疫苗毒株ORF3基因序列的差异，鉴别检测PEDV野毒株实时荧光定量PCR技术的报道。

发明内容

针对以上技术现状，本发明提供一种基于ORF3基因序列的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法 (TaqMan FQ-PCR)。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其序列如下：

F引物：CGTTTTGCTGTCATTGTTCTT(SEQ ID NO:1)；

R引物：AGACTAAACAAAGCCTGCCAATA(SEQ ID NO:2)；

TaqMan探针：

ATTGCCCACTTTTATATTATTGTGGTGCATTTTTAGATG(SEQ ID NO:3)。

所述TaqMan探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

引物和探针的设计和筛选对TaqMan FQ-PCR方法的成功与否非常重要。本发明定位于PEDV的保守基因ORF3内部，根据强弱毒株的ORF3基因差异序列设计引物及探针，这样在鉴别PEDV疫苗株和野毒株的前提下保证了 TaqMan FQ-PCR方法的准确性和可靠性。

本发明还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其包含上述引物和探针。

优选地，所述试剂盒中还包含猪流行性腹泻病毒野毒株阳性参考品，所述阳性参考品为含有猪流行性腹泻病毒疫苗株RNA和野毒株RNA的质粒。

本发明还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品总RNA；

(2)对待检样品总RNA进行逆转录得cDNA；

(3)将上述引物和探针加入实时荧光定量PCR反应体系中，以逆转录获取的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；

(4)根据扩增结果进行判定，若Cq≤36，则判定为阳性，即待检样品中含有猪流行性腹泻病毒的野毒株；若Cq＞36，则判定为阴性，即待检样品中不含猪流行性腹泻病毒的野毒株。

优选地，所述PCR反应体系中F引物、R引物和TaqMan探针的浓度均为250nM。

优选地，所述PCR扩增的条件为：95℃30S进行预变性，共1个循环； 95℃反应5s，55℃反应30s，共45个循环；55℃时，采集荧光信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明基于PEDV ORF3设计的引物和探针可特异性鉴别检测猪流行性腹泻病毒的野毒株，对PEDV弱毒疫苗免疫后仍暴发PEDV野毒感染的研究具有临床意义，为PED的流行病学调查及遗传变异分析提供技术支持。

本发明建立的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量 PCR方法具有以下优点：

(1)特异性强，当扩增的Cq值小于等于36个循环时，能特异性检测猪流行性腹泻病毒野毒株，与PEDV弱毒疫苗株(CV777)、猪瘟病毒 (CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)等无交叉反应。

(2)敏感性高，即使模板量很低，也可被检测到，最少可检测到7.96个 TCID₅₀，可检测到的最低拷贝数为3.7拷贝，比SYBR GreenⅠFQ-PCR方法和常规RT-PCR方法敏感10倍。

(3)重复性好，本发明则通过对特异性的批间重复试验进行分析，其变异系数值均在2.46％以内，小于10％，说明该方法稳定可靠，可以在临床推广应用。

(4)临床检出率高，与间接免疫荧光法相比，本发明方法检出率高20％左右，两种方法总符合率94.74％，阳性符合率83.33％，阴性符合率92.86％。

附图说明

图1A是本发明实施例中CV777与QY毒株ORF3基因的RT-PCR扩增图谱；其中三个条带分别为：1:100bp DNA Ladder；2:QYF4RT-PCR扩增产物； 3:CV777RT-PCR扩增产物。

图1B为本发明实施例中CV777与QY重组质粒RT-PCR鉴定图谱；其中三个条带分别为：1:100bp DNA Ladder；2:pET-28a-QY-ORF3重组质粒PCR 鉴定；3:pET-28a-CV777-ORF3重组质粒PCR鉴定。

图2是本发明实施例中PEDV-ORF3基因重组质粒的酶切鉴定图谱；其中， 1、DL10000DNA marker；2、pET-28a-QY-ORF3菌液PCR扩增产物；3、 pET-28a-CV777-ORF3菌液PCR扩增产物；4、pET-28a-QY-ORF3质粒酶切； 5、pET-28a-CV777-ORF3质粒酶切；6、pET-28a质粒酶切；7、pET-28a菌液 PCR。

图3为本发明实施例中不同浓度的QY的FQ-PCR扩增曲线，由左至右浓度依次为：10²拷贝/μL、10³拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、 10⁷拷贝/μL、10⁸拷贝/μL、10⁹拷贝/μL。

图4为本发明实施例中QY的FQ-PCR的浓度与Cq值的标准曲线。

图5为本发明实施例中不同病毒的扩增曲线，A：pET-28a-QY-ORF3；B： PEDV-QY；C：PRV、PCV2、RV、TGEV；D：PEDV-CV777、CSFV、 PRRSV、PPV、阴性对照。

图6为本发明实施例中敏感性检测试验结果。

图7为本发明TaqMan实时荧光定量PCR方法与SYBR GreenⅠFQ-PCR 方法的敏感性比较结果。

图8为常规PCR方法的敏感性结果，其中，1:100bp DNA Ladder；2～9 依次为:阳性质粒依次做10^-4～10^-11倍稀释，其内分别含有3.7×10⁶、3.7×10⁵、 3.7×10⁴、3.7×10³、3.7×10²、3.7×10¹、3.7和3.7×10^-1个拷贝数；10：空白对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株、菌株PEDV曲阳(HBQY)毒株(GenBank ID:MH244928)，由河北农业大学动物传染病实验室分离鉴定与保存；PEDV减毒株CV777、猪圆环病毒2型、传染性胃肠炎病毒和细小病毒以及pET-28a质粒及E.Coli DH5α感受态细胞，均由河北农业大学动物传染病实验室保存。

1.1.2主要试剂及仪器DNA及RNA提取试剂盒，购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；质粒提取试剂盒、100bp DNA ladder、RNA酶抑制剂和 dNTPs，购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖凝胶纯化试剂盒，购自 BIOMIGA公司；反转录酶M-MLV，为Promega公司产品；随机引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成；2×Taq Master Mix，购自北京康为生物科技有限公司；Green Real time PCR Master Mix、Premix Ex Taq^TMRR390A、限制性内切酶EcoR I和Xho I和T4 DNA Ligase购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR仪，购自Roche Diagnostics(Shanghai)Ltd；0.1mL qPCR 8联管，购自上海科进生物技术有限公司；Nano-Drop 2000超微量分光光度计，购自美国ThermoScientific公司。

1.1.3引物根据GenBank中PEDV减毒株(CV777，ID:KT323979)与野毒株MC2012(ID:JX163296)的ORF3基因序列的差异，设计扩增ORF3全基因引物(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)、鉴别引物及探针，如表1所示。

表1扩增PEDV-ORF3基因的引物与PCR条件

1.2方法

1.2.1阳性标准质粒的构建

1.2.1.1病毒RNA提取及PCR扩增取经典毒株CV777和野毒株QY细胞毒各250μL，提取总RNA，反转录为cDNA后进行PCR。PCR反应体系为： cDNA模板4μL，2×Taq Master Mix 25μL，上、下游引物各1μL，无菌三蒸水19μL；反应程序为：预变性94℃3min，94℃1min，退火55℃1min，延伸72℃1min，共35个循环；最后72℃终延伸10min。经1.0％的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物并对其进行纯化回收。

1.2.1.2 PCR产物的克隆与分析将纯化的胶回收产物与pET-28a质粒分别进行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，酶切后将胶回收产物克隆至pET-28a载体中，将重组质粒转化至DH5α感受态细胞，涂布于Kana⁺/LB培养基中，筛选阳性菌落，提取重组质粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3进行PCR鉴定、酶切鉴定以及序列测定分析。测序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。鉴定为阳性的重组质粒即可作为TaqMan FQ-PCR的标准品。用Nano-Drop 2000超微量分光光度计进行浓度测定并计算出拷贝数，用高压灭菌的三蒸水将重组质粒稀释成含有10²～10⁹拷贝/μL的8个倍比稀释梯度，置于-20℃备用。

1.2.2 TaqMan FQ-PCR方法的建立

1.2.2.1反应条件的优化采用Premix Ex Taq^TM推荐的20μL反应体系进行实时FQ-PCR扩增。对引物和探针浓度、退火温度(55℃～62℃)以及读板条件进行优化筛选，在模板相同条件下，以出现最小的Cq值、最高的荧光值为指标，同时设立空白对照(NTC)。

1.2.2.2标准曲线的建立反应条件优化后，用以上制备好的8个稀释梯度的重组质粒DNA作为模板，进行实时FQ-PCR扩增，制作Real-time FQ-PCR 的标准曲线。

1.2.2.3特异性检测根据1.2.2.1确立的最佳条件，以倍比稀释的阳性质粒、PEDV-QY株以及PEDV减毒株CV777为对照，分别检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、轮状病毒 (RV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪细小病毒 (PPV)，每个病毒模板重复2孔，进行PCR扩增，同时设阴性对照，以检测该方法的特异性。

1.2.2.4判定标准的确定以倍比稀释的阳性质粒、PEDV-QY野毒株、 PEDV-CV777减毒株、TGEV、CSFV、PRRSV、PCV、RV、PRV、PPV核酸为模板，用建立的TaqMan FQ-PCR扩增，重复3次试验。当以TGEV、CSFV、 PRRSV、PCV2、RV、PRV、PPV病毒核酸为模板时，以不出现非特异性扩增的最大Cq值、同时电泳检测未见目的条带的循环数确定为阴、阳性临界值。

1.2.2.5敏感性测定根据建立的标准曲线，将pET-28a-QY-ORF3重组质粒 DNA按1:10ⁿ进行倍比稀释，从10^-4稀释到到10^-11，并以此为模板，进行 TaqMan FQ-PCR扩增，每个稀释梯度的模板重复2孔，计算出最低可检测到的核酸拷贝数。同时，取已知TCID₅₀＝10^5.6/mL的PEDV QY野毒株，提取核酸后以1:10ⁿ进行倍比稀释，从10^-1稀释到到10^-5，并以此为模板进行TaqMan FQ-PCR扩增，每个模板重复2孔，计算其最低可检测到的病毒滴度，以检测该方法的灵敏性。

1.2.2.6敏感性比较将重组质粒以1:10ⁿ进行倍比稀释，从10^-4稀释到10^-11，并以此为模板，用建立的TaqMan FQ-PCR与SYBR GreenⅠFQ-PCR和常规 RT-PCR同时扩增，比较三种方法的敏感性。

1.2.2.7重复性评估将倍比稀释的阳性质粒、PEDV-QY株、PEDV-CV777 弱毒株、TGEV、CSFV、PRRSV、PCV2、RV、PRV、PPV的核酸为模板，于-20℃冰箱保存，每隔一周用建立方法重检一次，共检测3次，计算其组间变异系数(CV)，评估其重复性。

1.2.2.8临床应用选取保定地区腹泻仔猪的小肠、肠内容物、肛拭子或肠系膜淋巴结共38份病料，用PBS做3～5倍稀释后进行研磨，反复冻融3次， 8000r/min离心20min后取上清，每毫升加入青、链霉素各1000U，于4℃作用过夜。

将Vero细胞平铺于6孔板中，每孔中的细胞数为1.2×10⁶个，37℃培养 24h，待细胞长满单层后，将处理好的待检样品接种到Vero细胞中，每孔500 μL，37℃吸附1h，之后加入2mL细胞维持液(含有抗生素的1×MEM)，置于37℃孵育72h，收获分离培养物。将收获的分离培养物反复冻融3次， 1500r/min，离心10min，收取上清。连续盲传3代后，收取培养物，提取 RNA，反转录为cDNA后，用建立的实时荧光探针定量PCR方法进行检测。同时，用间接免疫荧光技术检测同一代次病毒。计算实时荧光探针定量PCR 与间接免疫荧光两种方法对临床样品检测结果的阴、阳性符合率和总符合率。

间接免疫荧光试验的具体操作步骤如下：

将生长良好的Vero细胞消化后，计数铺于96孔细胞培养板，每孔 1.6×10⁴个细胞/200μL。待细胞单层90％汇合时，弃去营养液，用PBS轻洗1 次，100μL/孔，每孔加入病毒液100μL，同时设立未接毒阴性对照，将培养板至于37℃5％CO₂培养1h；弃去病毒液，加入细胞维持液，100μL/孔，置于37℃5％CO₂培养箱，在接毒后的48h做IFA；取出培养板，加入冰冷的无水甲醇固定细胞，50μL/孔，将细胞培养板置于-20℃孵育10min；用PBS 轻洗细胞培养板1次，每孔加入280μL PBS；加入1:50倍稀释的鼠抗PEDV- N单克隆抗体，50μL/孔37℃孵育1h，PBS轻洗2次280μL/孔；每孔加入 1:250倍稀释的FITC-山羊抗小鼠IgG，50μL/孔37℃45min，PBS轻洗2次；荧光显微镜观察结果。当呈现绿色荧光时，结果为阳性；当无荧光时，结果为阴性。

实时荧光TaqMan探针定量PCR与间接免疫荧光试验两种检测方法的阴、阳性符合率计算公式如下：

阳性符合率＝真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100％；

阴性符合率＝真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100％；

总符合率＝(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100％

2结果

2.1重组质粒的鉴定

从QY细胞毒和致弱的CV777细胞毒中扩增到了预期大小(QY，675bp； CV777，626bp)PEDV ORF3蛋白基因片段。分别纯化回收扩增片段，构建重组质粒(分别命名为pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3)。对重组质粒进行RT-PCR鉴定，扩增到目的基因(QY，675bp；致弱的CV777， 626bp)。用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，从重组质粒中可切下的目的条带与细胞毒中所扩增的PCR产物相等，如图1和图2所示。序列测定结果表明，插入到质粒中的核苷酸序列分别与QY毒株核苷酸序列与致弱CV777毒株的相应ORF3基因序列同一性达100％。上述结果表明，成功构建了携带有目的片段的重组质粒。

2.2反应条件的确立

以QY野毒株ORF3基因的重组质粒为模板，对RT-PCR反应条件和程序进行优化，最终确立20μL最佳反应体系：2×premix Ex Taq^TM(2×)10μL；PEDV-ORF3-FP2(10μM)0.5μL；PEDV-ORF3-RP2(10μM)0.5μL；Probe (10μM)0.5μL；质粒DNA模板2μL，灭菌三蒸水6.5μL。最适反应程序为： 95℃30S(预变性)，共1个循环；95℃反应5s，55℃反应30s，共45个循环；55℃时，采集荧光信号。

2.3 TaqMan探针标准曲线

用高压灭菌的三蒸水将重组质粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777- ORF3分别稀释成含有10²～10⁹拷贝/μL的8个倍比稀释梯度，进行TaqMan FQ-PCR扩增，获得了PEDV野毒株QY的FQ-PCR标准曲线和直线回归方程 (如图3和图4所示)。由于致弱CV777毒株的ORF3基因部分碱基缺失，所以未能扩增出CV777的标准曲线，这与预期结果相符。

PEDV野毒株QY的标准曲线以循环阈值(Cq值)为横坐标，以扩增的荧光值为纵坐标。直线回归方程以拷贝数的对数为横坐标，以Cq值为纵坐标，两者呈线性反比关系。分析结果表明，pET-28a-QY-ORF3所获得标准曲线斜率为-2.897，Y轴截距为16.69，扩增效率为100％；QY标准曲线的线性回归分析存在一个较高的反应系数(R＞0.99)，大于0.99表明不同浓度的目的基因扩增与Cq值存在良好的线性关系，所以该反应条件和标准曲线均可以用于相应基因的定量分析。

2.4特异性与阴阳性临界值

用建立的TaqMan FQ-PCR方法分别检测CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV2、TGEV和RV病毒核酸，同时设立pET-28a-QY-ORF3阳性质粒、PEDV QY和致弱CV777毒株对照。结果如表2所示，荧光探针能特异性扩增pET- 28a-QY-ORF3阳性质粒及PEDV-QYF4毒株，没有扩增到CV777弱毒株核酸，说明该方法能够鉴别PEDV弱毒株与野毒株。同时未检测到CSFV、PRRSV和PPV核酸，对PRV、PCV2、TGEV、RV等4种病毒核酸，其扩增的Cq值均大于37循环(如图5所示)。以不出现非特异性扩增的最大Cq值为阴、阳性临界值；即将Cq判定标准定于36循环，若Cq≤36，则判定为阳性；若Cq ＞36，则判定为阴性。

表2 TaqMan FQ-PCR不同病毒的Cq值

2.5敏感性

用建立的荧光探针PCR方法检测1:10⁴-1:10¹¹倍比稀释pET-28a-QY- ORF3阳性质粒，当样品稀释到1:10¹¹时，未检测到扩增曲线，未出现Cq值。所以该方法最低可检测出1:10¹⁰倍稀释的阳性质粒，此时可检测出的最低拷贝数为3.7拷贝。同时，用该方法检测1:10-1:10⁵倍比稀释的QY毒株，可检测到的最低稀释倍数为1:10²，即可检测到的病毒滴度最低为7.96个TCID₅₀(如图6所示)。

2.6敏感性比较

以倍比稀释的pET-28a-QY-ORF3阳性质粒为模板，用TaqMan荧光探针 FQ-PCR检测，最低可检测到3.7个拷贝的病毒核酸。用SYBR GreenⅠFQ- PCR方法和常规PCR方法最低均可检测到37个拷贝。因此，TaqMan FQ-PCR 方法比SYBR GreenⅠFQ-PCR方法和常规PCR方法更加敏感(如图7和图8 所示)。

2.7重复性

以pET-28a-QY-ORF3阳性质粒、PEDV野毒株QY、PEDV致弱毒株 CV777、TGEV、CSFV、PRRSV、PCV、RV、PRV、PPV的核酸为模板，每隔一周进行用建立的方法检测一次，共检测3次，计算三次扩增Cq值间的变异系数，评估检测结果的重复性。结果表明：不同批次间相同模板的变异系数均在2.46％以内，说明该方法稳定、可靠。建立的荧光探针定量PCR的重复性检测结果见表3。

表3 TaqMan FQ-PCR的批间重复试验

2.9临床应用

用TaqMan FQ-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)同时检测38份来自腹泻仔猪的样品，结果如表4所示，TaqMan FQ-PCR与间接免疫荧光试验对阳性样品的检出率分别为31.58％(12/38)和26.32％(10/38)。二者的阳性符合率为83.33％，阴性符合率为92.86％，总符合率为94.74％。该结果表明 TaqMan荧光探针FQ-PCR的敏感性高于间接免疫荧光试验。

表4 TaqMan FQ-PCR与IFA对临床样品的检测

3总结

PEDV强、弱毒株之间的同源性较高，鉴别困难，本发明采用TaqMan探针法实现了对强毒株的特异性检测。TaqMan实时荧光定量PCR的引物和探针对靶序列的要求较高，引物和探针的设计与筛选对TaqMan FQ-PCR方法的成功与否非常重要。本发明定位于PEDV的保守基因ORF3内部，根据强、弱毒株的ORF3基因差异序列设计引物及探针，这样在检测野毒株的前提下保证了 TaqMan FQ-PCR方法的准确性和可靠性。

本发明TaqMan FQ-PCR方法标准曲线的直线回归分析存在较高反应系数， R＞0.99表明不同拷贝数的对数和循环阈值之间有良好的线性关系，可应用于相应基因的定量分析。

在建立标准曲线之前，需对引物和探针进行反应条件和反应程序的优化，包括对引物和探针的浓度、退火温度以及读板时间的优化，最终确立最适引物和探针浓度为250nM；最优退火温度55℃；延伸时间30s收集荧光信号，绘制荧光曲线。

TaqMan FQ-PCR方法建立成功的关键因素在于特异性、敏感性和重复性。为了证实此方法的特异性，将pET-28a-QY-ORF3重组质粒和PEDV野毒株做阳性对照，分别取CV777减毒株、PRRSV、CSFV、PRV、PCV₂、TGEV、 PPV、RV核酸进行交叉试验，该结果显示当Cq≤36时，本方法对其他病毒不出现非特异扩增。因此，本试验设定建立方法的阴阳性临界值为36循环，当 Cq＞36循环，可判定为阴性。本发明将重组质粒倍比稀释用于敏感性检测，最少可检测到7.96个TCID₅₀，可检测到的最低拷贝数为3.7拷贝，比SYBR GreenⅠFQ-PCR方法和常规RT-PCR方法敏感10倍。任意检测方法若要推广应用则必需确保其反应的稳定性，本实验则通过对特异性的批间重复试验进行分析，其变异系数值均在2.46％以内，小于10％，说明该方法稳定可靠可以在临床推广应用。

本发明TaqMan FQ-PCR方法检出率高于病毒盲传后的间接免疫荧光方法，两者的总符合率达94.74％，阳性符合率为83.33％，阴性符合率为92.86％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法

<130> 2018.7.11

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgttttgctg tcattgttct t 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agactaaaca aagcctgcca ata 23

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

attgcccact tttatattat tgtggtgcat ttttagata 39

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gccgaattca tgtttcttgg actttttcaa 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acgctcgagt cattcactaa ttgtagctat 30

Claims

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其特征在于：

F引物：序列如SEQ ID NO:1所示；

R引物：序列如SEQ ID NO:2所示；

TaqMan探针：序列如SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1所述的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其特征在于：所述TaqMan探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

3.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的引物和探针。

4.如权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其特征在于：还包含猪流行性腹泻病毒野毒株阳性参考品，所述阳性参考品为含有猪流行性腹泻病毒野毒株RNA的质粒。

5.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取待检样品中的总RNA；

(2)对待检样品中总RNA进行逆转录得cDNA；

(3)将权利要求1或2所述的引物和探针加入实时荧光定量PCR反应体系中，以逆转录获取的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR反应体系中F引物、R引物和TaqMan探针的浓度均为250nM。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：95℃30S进行预变性，共1个循环；95℃反应5s，55℃反应30s，共45个循环；55℃时，采集荧光信号。