CN107630109A

CN107630109A - 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒

Info

Publication number: CN107630109A
Application number: CN201711023628.3A
Authority: CN
Inventors: 马静云; 周玲; 孙媛
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2018-01-26

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS‑CoV）的荧光定量PCR引物及试剂盒。根据新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的保守序列核衣壳蛋白基因设计特异性引物和探针，其序列依次如SEQ ID NO：4～6所示；利用该引物和探针可特异性扩增出猪急性腹泻综合冠状病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中探针与PCR扩增片段特异性结合的情况，采集荧光数据，根据Cq值来鉴别SADS‑CoV。利用所述方法进行PCR扩增后即可快速鉴别SADS‑CoV，准确性高、特异性强、重复性好，可以准确、快速、高效地进行SADS‑CoV鉴定，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒。

背景技术

冠状病毒(Coronaviruses，CoV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Coronavirinae)，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，拥有已知RNA病毒中最大的基因组序列长度。目前，已知的猪冠状病毒有五种，包括猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus，PRCV)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)以及近年发现的猪丁型冠状病(porcine deltacoronavirus，PDCoV)。其中PEDV、TGEV、PDCoV能够引起猪的肠道疾病，导致腹泻、呕吐和脱水，发病率和死亡率可高达50％～100％，尤其是哺乳阶段仔猪发病最为严重。

最近，一种新型猪急性腹泻综合征冠状病毒在广东地区首次报道。报道显示，自2016年底至2017年初以来，广东地区某猪场中爆发了严重的仔猪腹泻疫情，造成严重的经济损失。已知腹泻病原检测结果皆呈阴性，从而表明导致仔猪腹泻的病原是一种新型猪冠状病毒，将其命名为猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndromecoronavirus，SADS-CoV)，该病毒基因组全长约为27kb。SADS-CoV引起的症状包括猪急性腹泻、失重，严重时死亡，与其他猪肠道病毒引发的腹泻症状极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，这就给该病的确诊带来一定难度，需要借助实验室诊断技术确诊，而传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的快速诊断治疗。

实时荧光定量PCR检测技术融合了PCR技术的核酸高效扩增、引物特异性高、光谱技术敏感性高和高精确定量的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量结果。Tagman探针法利用PCR反应中Taq酶5’端和3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使其报告荧光基团和淬灭荧光基团分离并发出荧光，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。随着PCR地进行，所检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。荧光定量PCR技术的出现，极大简化了定量检测的过程，结果判断更真实可靠，大大提高了工作效率。

目前还未见有通过实时荧光定量PCR检测SADS-CoV的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中新型猪急性腹泻综合征冠状病毒检测所存在的上述缺陷，提供一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量PCR引物和探针。

本发明的第二个目的是提供利用上述实时荧光定量PCR引物和探针来检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的TaqMan探针法。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量PCR引物和探针，所述PCR上下游引物和探针序列依次如SEQ ID NO：4～6所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

上游引物：5'-CTGACTGTTGTTGAGGTTAC-3'(SEQ ID NO：4)；

下游引物：5'-TCTGCCAAAGCTTGTTTAAC-3'(SEQ ID NO：5)；

探针：5'-FAM-TCACAGTCTCGTTCTCGCAATCA-TAMRA-3'(SEQ ID NO：6)；

本发明是根据新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的保守序列核衣壳蛋白(N蛋白)基因设计特异性荧光定量PCR引物和探针，所述新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的N蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。

因此，SEQ ID NO：1所示新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的N蛋白基因在检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒中的应用也在本发明保护范围内。

优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMAR。

同时，本发明上述荧光定量PCR引物和探针在检测或鉴别新型猪急性腹泻综合征冠状病毒和/或检测试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的TaqMan探针法，包括如下步骤：

S1.提取待测样品RNA，反转成cDNA；

S2.以S1所述cDNA为模板，以上述荧光定量PCR引物和探针进行荧光定量PCR反应；

S3.根据S2荧光定量PCR的Cq值和扩增曲线结果，判断待测样品中是否含有新型猪急性腹泻综合征冠状病毒。

优选地，S2所述荧光定量PCR反应体系为：2×Probe qPCR Premix Ex Taq 10μL，10μM上下游引物、探针各0.8μL，cDNA模板1.0μL，ddH₂O补充至20μL。

优选地，S2所述荧光定量PCR反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包上述荧光定量PCR引物和探针。

优选地，所述荧光定量PCR上下游引物和探针的浓度均为10μM。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应所需试剂，荧光染料和阳性标准品。

优选地，所述PCR反应所需试剂为Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)，ddH₂O。

优选地，所述阳性标准品为重组质粒PMD19-T-N。

优选地，所述阳性标准品的扩增引物如SEQ ID NO：2～3所示。

优选地，所述试剂盒还包含提取新型猪急性腹泻综合征冠状病毒RNA，并反转成cDNA所需的试剂。

同时，本发明还提供利用上述试剂盒检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样品RNA，反转成cDNA；

S2.以S1所述cDNA为模板，以权利要求1所述PCR引物和探针进行荧光定量PCR反应；

具体地，S2所述荧光定量PCR反应体系为：2×Probe qPCR Premix Ex Taq 10μL，10μM上下游引物、探针各0.8μL，cDNA模板1.0μL，ddH₂O补充至20μL。

具体地，S2所述荧光定量PCR反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计并筛选得到一种新型猪急性腹泻综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述PCR上下游引物和探针的序列依次如SEQ ID NO：4～6所示；利用该引物和探针可特异性扩增出新型猪急性腹泻综合征冠状病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中探针与PCR扩增片段特异性结合的情况，采集荧光数据，根据Cq值来鉴别SADS-CoV；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别SADS-CoV，准确性高、灵敏度高、特异性强，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定SADS-CoV，有利于在临床实践中推广应用。

附图说明

图1为重组质粒标准品pMD19-T-N的PCR扩增结果。

图2为验证实时荧光定量PCR引物的扩增结果。

图3为实时荧光定量PCR的标准曲线。

图4为实时荧光定量PCR的灵敏性试验；其中1为3.08×10¹⁰copies/μL；2为3.08×10⁹copies/μL；3为3.08×10⁸copies/μL；4为3.08×10⁷copies/μL；5为3.08×10⁶copies/μL；6为3.08×10⁵copies/μL；7为3.08×10⁴copies/μL；8为3.08×10³copies/μL；9为3.08×10²copies/μL；10为3.08×10¹copies/μL；11为3.08×10⁰copies/μL；12为阴性对照。

图5为实时荧光定量PCR的特异性试验；其中1为SADS-CoV；2为FMDV；3为PEDV；4为SVDV；5为PCV3；6为PRRSV；7为SVA；8为PDCoV；9为PKV；10为PSV；11为CSFV；12为阴性对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1标准阳性模板的制备

1、病毒总RNA的抽提

按Invitrogen公司TRIZOL LS Reagent RNA提取试剂盒使用说明书进行。在1.5mLeppendorf管中加入250μL已分装好的阳性病料研磨液(来自广东某猪场)上清和750μLTRIZOL，充分混匀，室温放置10min；加入200μL的氯仿，剧烈摇动15sec，室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min；将上清转移到新的1.5mL eppendorf管中，加入500μL异戊醇，充分混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min；弃去上清液，沉淀用冰预冷的70％乙醇1000μL，轻轻混匀，洗涤一次，4℃，12000rpm离心10min；弃去上清液，风干；用20μL DEPC处理的三蒸水溶解RNA，-80℃保存或直接用于反转录。

2、引物设计

根据新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(SAD-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因序列(SEQ ID NO：1)，设计PCR阳性标准品引物：

上游引物P1：5'-CAGGTCTTGGTGTTCGCAATCG-3'(SEQ ID NO：2)；

下游引物P2：5'-ACCGTGCTGAACGAGGTCACT-3'(SEQ ID NO：3)；

荧光定量PCR引物：

上游引物P3：5'-CTGACTGTTGTTGAGGTTAC-3'(SEQ ID NO：4)；

下游引物P4：5'-TCTGCCAAAGCTTGTTTAAC-3'(SEQ ID NO：5)；

探针P5：5'-FAM-TCACAGTCTCGTTCTCGCAATCA-TAMRA-3'(SEQ ID NO：6)；

利用阳性标准品引物P1和P2扩增N基因，反应体系为：PremixTaq 25μL，10μM上下游引物P1/P2各1μL，模板DNA 2μL，最后用ddH₂O补足反应体系总体积为50μL。

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。

回收PCR产物(参照Omega公司Gel Extraction Kit的使用说明书)，进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定为正确的目标片段，用于后续的克隆。

3、目的基因的克隆

(1)回收产物连接pMD19-T载体

参照19-T Vector试剂盒说明书，连接反应体系为：纯化的PCR产物4μL、pMD19-T vector 1μL、Solution I 5μL；最终连接反应体系的总体积为10μL。将上述反应体系混匀并稍作离心后，4℃连接过夜。

(2)连接产物转化

将(1)的连接产物5μL轻轻地加到50μL的大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；42℃热休克90s然后迅速转移到冰浴中冷却2min；加到200μL LB液体培养基中，37℃，160rpm振摇培养45min，使大肠杆菌复苏，抗性基因表达；将以上复苏的感受态细胞均匀涂布Amp⁺/LB固体培养基平皿，37℃培养过夜。

(3)重组子的PCR鉴定与筛选

从步骤(2)过夜培养的平板中挑取三个单菌落，分别接种于1mL含有100μg/mL Amp⁺的LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养6h以上(OD₆₀₀值0.3～0.4)；取菌液进行PCR鉴定，产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；取20μL鉴定阳性的菌液以1：100的比例接种到2mLAmp⁺的LB液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养过夜。

(4)重组质粒的提取与鉴定

参照Omega公司Plasmid Mini Kit I的说明书，对过夜培养菌液进行质粒抽提，用1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果。

将重组质粒抽提产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示，再将经鉴定阳性的重组pMD19-T质粒送北京奥科生物科技有限责任公司进行核苷酸序列测定。

(5)用于荧光定量PCR方法引物的验证

以构建成功的重组质粒抽提产物为模板，PCR验证荧光定量引物P3、P4的可行性，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，其电泳检测结果见图2所示，经鉴定PCR产物长度大小与预扩增片段长度相符。

实施例2荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线制作

经优化后荧光定量PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，10μM上下游引物、探针各0.8μL，cDNA模板1.0μL，ddH₂O补充至20μL。

最佳荧光定量PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

测定标准重组阳性质粒的OD_260nm和OD_280nm值及其比值，计算质粒浓度，并换算成拷贝数，以双蒸水10倍系列稀释成9个梯度(10⁹～10¹copies/μL)。以此为模板，建立20μL反应体系，根据优化后的PCR反应体系，在Bio-Rad荧光定量PCR仪上扩增，所得标准曲线见图3。结果，扩增曲线与Cq值之间的线性关系紧密，r²(相关系数)可达0.999，表明本发明的荧光定量PCR引物和方法灵准确性高。

实施例3实时荧光定量PCR的灵敏性试验

SADS-CoV阳性标准品10倍系列稀释作为模板进行实时荧光定量PCR(3.08×10⁰～3.08×10¹⁰copies/μL，共11个梯度，以确定它们的检出下限。结果，以PMD19-T-N标准品为模板，荧光定量PCR的检出下限为3.08×10¹copies/μL(如图4所示)，表明本发明的荧光定量PCR引物和方法灵敏度高。

实施例4实时荧光定量PCR的特异性试验

以SVA、FMDV、SVDV、CSFV、PRRSV、PCV3、PDCoV、PEDV、PKV、PSV和SADS-CoV的DNA或cDNA为模板，应用实施例1的荧光定量PCR引物和探针及实施例2优化的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR扩增，结果发现该PCR扩增反应只有SADS-CoV呈阳性(如图5所示)；表明本发明的荧光定量PCR引物和方法特异性强。

实施例5实时荧光定量PCR的重复性试验

将SADS-CoV的阳性标准品质粒进行10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/μL共6个梯度为模板，进行组内和组间重复性检验，每个梯度都要重复5次，共做3次反应。对SADS-CoV所建立起来的方法进行pMD19-T-N标准品质粒重复性检验。结果表1所示：组内和组间的变异系数(CV)均小于0.70％，表明本发明的荧光定量PCR引物和方法灵重复性好。

表1SADS-CoV实时荧光定量PCR扩增pMD19-T-N的重复性分析

实施例6一种检测

一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包含下列所示荧光定量PCR引物和探针。

荧光定量PCR引物：

上游引物P3：5'-CTGACTGTTGTTGAGGTTAC-3'(SEQ ID NO：4)；

下游引物P4：5'-TCTGCCAAAGCTTGTTTAAC-3'(SEQ ID NO：5)；

探针P5：5'-FAM-TCACAGTCTCGTTCTCGCAATCA-TAMRA-3'(SEQ ID NO：6)；

所述荧光定量PCR上下游引物和探针的浓度均为10μM。

所述试剂盒还包括PCR反应所需试剂Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)，ddH₂O，荧光染料和阳性标准品PMD19-T-N；同时该试剂盒还含有扩增阳性标准品的引物，其序列如SEQ ID NO：2～3所示。

上游引物P1：5'-CAGGTCTTGGTGTTCGCAATCG-3'(SEQ ID NO：2)；

下游引物P2：5'-ACCGTGCTGAACGAGGTCACT-3'(SEQ ID NO：3)；

该试剂盒的一种反应体系可以为：Premix Ex Taq(ProbeqPCR)(2×)10μL、10μM，0.8μL引物P3、10μM，0.8μL引物P4、10μM，0.8μL探针、DNA模板1.0μL、ddH₂O 6.6μL，反应总体积为20μL。

利用该试剂盒进行实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，40个循环。

利用上述试剂盒检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的具体方法为：

S1.提取待测样品RNA，反转成cDNA；

S2.以S1所述cDNA为模板，以上述PCR引物和探针进行荧光定量PCR反应；

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒

<130> 1713755ZBSH042

<141> 2017-10-27

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea Syndrome coronavirus)

<400> 1

atggccactg ttaattgggg tgacgctgtt gaacaggcgg aatctcgtgg tcgtaaaaga 60

attccattgt cactctttgc gcctttgcgt gttacagatg gcaaaaactt ttggaatgtc 120

atgcctagaa atggagttcc aacaggcaga ggcaatccag atcaacagat tggttattgg 180

gttgaacaaa aacgctggcg aatgcaaaaa ggccaacgta aagatcagcc ttctaactgg 240

catttttatt accttggtac tggtcctcac gcagatgctc ctttcaggaa acggattcag 300

ggtgtgcatt gggttgctgt tgatggtgct aaaactagcc ccacaggtct tggtgttcgc 360

aatcgtaata aagaacctgc tacacctcag tttgggtttc aattaccagc tgacgtaact 420

gttgttgagg ctacttctag aagtgcttca cgttcacagt ctcgttctcg caatcaaagc 480

caaagccgca gcggtgctca gacacctcgt gttcaacaat cgtctcaggc tgttgacatc 540

gtagctgcag ttaaacaagc tttggcagac ttgggcatag cttctagcca gtccaagtcg 600

cagagcggta agaatacacc caaaccaaga agcagagctg tttctcctgc accagcccct 660

aaaccggctc gtaagcagat ggataaacct gaatggaagc gcgttcctaa ttctgaagag 720

gacgtgcgta agtgctttgg tcctcgatca gcttctagaa attttggtga cagtgatctt 780

gttcagcatg gtgttgaagc taagcatttt ccaacaattg cggagctgct tcctactcag 840

gctgcattag cctttggtag tgaaattacc accaaagaag ctggtgattt tgttgaagtc 900

acctatcatt atgtaatgaa ggtttctaag actgataaaa atctacctag atttcttgag 960

caagttgctg cttactctaa acctagccag attaggaggt cccaatctca acaggatttg 1020

aatgttgatg cgcctgcgtt caccccagca cccccagcta ctccagtttc ccgaaatcct 1080

gattttcctg aggaagaggt tgagatggtg gatgagatta ttaattag 1128

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<400> 2

caggtcttgg tgttcgcaat cg 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<400> 3

accgtgctga acgaggtcac t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<400> 4

ctgactgttg ttgaggttac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<400> 5

tctgccaaag cttgtttaac 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<400> 6

tcacagtctc gttctcgcaa tca 23

Claims

1.一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，PCR上下游引物和探针序列依次如SEQ ID NO：4～6所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMAR。

3.权利要求1或2所述荧光定量PCR引物和探针在检测或鉴别新型猪急性腹泻综合征冠状病毒和/或检测试剂盒中的应用。

4.一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的TaqMan探针法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品RNA，反转成cDNA；

5. 根据权利要求4所述的TaqMan探针法，其特征在于，S2所述荧光定量PCR反应体系为：2× Probe qPCR Premix Ex Taq 10 μL，10 μM上下游引物、探针各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH₂O补充至20 μL。

6. 根据权利要求4所述的TaqMan探针法，其特征在于，S2所述荧光定量PCR反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。

7.一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述荧光定量PCR引物和探针。

8.根据权利要去7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应所需试剂，荧光染料和阳性标准品。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为重组质粒PMD19-T-N。

10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的扩增引物如SEQ IDNO：2～3所示。