CN108411040A - 猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法 - Google Patents

猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法；旨在提供一种灵敏度高，特异性强的SADS检测引物和方法，其技术方案包括由正向内引物SADS‑FIP、反向内引物SADS‑BIP、正向外引物SADS‑F3、反向外引物SADS‑B3、正向环引物SADS‑LF和反向环引物SADS‑LB组成；检测方法为：1)样品中提取病毒的RNA；2)以提取的RNA为模板，利用SADS的RT‑LAMP引物组合物，建立RT‑LAMP扩增体系，在60℃‑65℃恒温条件下进行逆转录环介导等温扩增；3)利用DEAOU‑308C恒温荧光检测仪检测；属于生物检测技术领域。

Description

猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法
技术领域
本发明公开了一种引物组合物，具体地说，是一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS)的RT-LAMP引物组合物，本发明还公开了检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒和方法；属于生物检测技术领域。
背景技术
2016年10月底，广东清远一种猪场暴发仔猪致死性疾病，发病仔猪表现为严重急性腹泻、呕吐、体重迅速下降，5日龄以下的仔猪死亡率高达90％。其他三个猪场随后也出现了疫情。截至2017年5月，共造成24693头仔猪死亡。根据临床症状，研究人员对病猪样本进行了猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒等已知猪腹泻相关病毒的检测。然而在疾病暴发高峰期，所有病毒检测结果均为阴性，表明该疾病是一种新发疾病。随后，对肠道样本的高通量测序结果、病毒分离和感染实验证实，该疾病的病原是一种冠状病毒，将其命名为猪急性腹泻综合征冠状病毒，简称SADS冠状病毒(swine acute diarrhea syndromecoronavirus,SADS-CoV)。
对SADS冠状病毒的基因组序列分析为寻找病毒的来源提供了线索：SADS病毒与2007年香港大学首次发现的蝙蝠冠状病毒HKU2基因组序列高度相似，全长序列一致性达95％，但囊膜蛋白(S蛋白)的氨基酸序列一致性只有86％。这表明HKU2虽不是SADS冠状病毒的直接祖先，但两者在遗传进化上关系相近，暗示SADS冠状病毒来源于蝙蝠。研究团队随即对2013-2016年期间在广东采集的591份蝙蝠样品进行了SADS冠状病毒特异性定量PCR检测，共有58份结果为阳性，阳性样品基本来自菊头蝠。其中一株在发生疫情猪场附近的蝙蝠洞穴中发现的冠状病毒与SADS病毒的全基因组序列一致性高达98.48％，其S蛋白氨基酸序列一致性在98％以上。结果进一步表明引起这次仔猪腹泻疫情的SADS冠状病毒来源于蝙蝠HKU2相关冠状病毒的跨种传播。根据对和病猪有密切接触的猪场工作人员的血清学调查结果，尚无证据显示SADS冠状病毒可进一步跨种感染人。SADS和2002-2003年暴发的严重急性呼吸综合征(SARS)具有诸多相似之处：两者均发生于广东，都由新发冠状病毒引起，源头都是菊头蝠。蝙蝠是多种冠状病毒的自然储存宿主。SADS冠状病毒的检测技术对应该病的疫病防控、保障畜牧业生产安全和流行病学调查具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物；本发明的第二个目的是提供一种灵敏度高的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，本发明的第三个目的是检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法。
为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，包括由正向内引物SADS-FIP、反向内引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向环引物SADS-LF和反向环引物SADS-LB组成；
引物SADS-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物SADS-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物SADS-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
引物SADS-LF核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
本发明的第二个技术方案是提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒含上述的RT-LAMP引物组合物。
本发明提供的后一个技术方案是一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，包括下述步骤：
1)从样品中提取病毒的RNA；
2)取步骤1)提取的RNA加入到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；
3)将SYTO-9加入步骤2)得到的扩增产物中，利用DEAOU-308C恒温荧光检测仪检测。
进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述RT-LAMP反应液为：总体积为25μL，反应缓冲液2.5μL；MgSO41.5μL；dNTP Mix 10mM 3.5μL；Primer mix 1μL；甜菜碱4μL；RNA 2.0μL；Bst 2.0DNA聚合酶1μL；逆转录酶0.5μL；SYTO-90.5μL。
进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述的MgSO4浓度为100mM，dNTP Mix浓度为10mM；甜菜碱浓度为5M；逆转录酶浓度为1U/μL；SYTO-9浓度为5mM。
进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述的所述的Primer mix体系中SADS-OF/SADS-OB、SADS-IF/SADS-IB、SADS-LF/SADS-LB的终浓度分别为：0.2mM、1.6mM、0.8mM。
进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述环介导等温扩增程序为63℃扩增1h。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明提供的技术方案采用逆转录环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal ampli-fication,RT-LAMP)技术，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且使靶序列呈环介导等温扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。
2、本发明提供的技术方案采用RT-LAMP扩增方式为环介导等温扩增，扩增效率高，由于RT-LAMP识别的是核酸上的6个特异性的位点，所以其特异性强。
3、本发明提供的技术方案RT-LAMP只在60℃-65℃进行恒温扩增，过程不需要昂贵的荧光定量PCR仪，因此非常简便、仪器成本低廉；且由于RT-LAMP是恒温扩增，不需要反转录步骤及PCR仪升降温的时间，所以扩增时间短。
4、本发明提供的技术方案RT-LAMP反应中加入荧光物质后，合成大量的DNA时，在荧光恒温扩增仪器上可以看到扩增曲线，扩增过程一目了然，且极大地提高了灵敏度。
5、本发明提供的技术方案设计特异性引物，多病毒验证此方法的特异性，检验了其重复性与稳定性，建立了适用于现场检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的快速检测方法。
附图说明
图1是RT-LAMP方法建立的曲线；
图2是特异性试验曲线；
图3是灵敏度试验试验曲线；
图4是重复性与稳定性试验曲线；
图5是临床样本试验曲线之一；
图6是临床样本试验曲线之一。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，对于本申请为详细披露的信息，均按照本领域常规技术手段进行。
实施例1
本发明提供的一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，包括由正向内引物SADS-FIP、反向内引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向环引物SADS-LF和反向环引物SADS-LB组成；
引物SADS-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物SADS-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物SADS-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
引物SADS-LF核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
实施例2
本发明的一种SADS的RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒含实施例1的RT-LAMP引物组合物。
实施例3
本发明提供的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所使用的材料如下：
DNA/RNA核酸抽提试剂盒TGUide Virus DNA/RNA Kit试剂盒(货号#Q5724天根生化科技有限公司)
核酸自动提取仪T-Guide OSE-M48(天根生化科技有限公司)
恒温荧光检测仪DEAOU-308C(广州迪澳生物科技有限公司)
Bst2.0聚合酶Bst 2.0(WarmStart DNA Polymerase货号#M5038L NEW ENGLANGBioLaBs公司)
100mM的硫酸镁溶液100mM(MgSO4solution货号#B1003S NEW ENGLANG BioLaBs公司)
10×反应缓冲液Isothermal Amplification Buffer(货号#B0537S NEW ENGLANGBioLaBs公司)，组分：20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，50mM KCl，0.1％Tween20，pH 8.8@25℃。
dNTP Mix(货号D7373碧云天生物技术公司)
甜菜碱(货号BCBS087V SIGMA公司)
AMV反转录酶(AMV Rerverse Transcriptase，货号M510A Promega公司)
SYTO 9SYTO-9(SYTOTM9green fluorescent nucleic acid stain，货号S34854invitrogen公司)
一步法荧光定量PCR试剂盒One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect RealTime)试剂盒(货号#RR064A TAKARA公司)
pGEM-T Easy Vector Systems I试剂盒(货号A1360Promega公司)
RiboMAXTM Large Scale RNA Production System—T7(货号P1300Progega公司)其中：RNA病毒
其中：RNA使用总核酸提取试剂盒(TGuide virusDNA/RNA Kit)，利用全自动核酸抽取机对接了SADS病毒的细胞上清液，CSFV、PRRSV、TGEV、FMDV、PEDV、SIV H1N1的商品化疫苗进行核酸抽取，抽取完放-80℃保存。
RT-LAMP检测方法包括下述步骤：
1)设计引物
从NCBI公布的SADS(Sequence ID:MF167434.1与Sequence ID:MF370205.1)的N基因序列用RT-LAMP引物设计在线网站：http://primerexplorer.jp/e/设计引物。
2)取步骤1)提取的RNA加入到RT-AMP反应液中混合，建立扩增体系，在63℃恒
SADS-F3 CAGCCTTCTAACTGGCACTT SEQ ID NO：1
SADS-B3 ACAGTCAGGTCTGGTGGTAA SEQ ID NO：2
SADS-FIP CGTCAACAGCGACCCAATGCA-TCCTCACGCAGATGCTCC SEQ ID NO：3
SADS-BIP AACTAGCCCCACAGGTCTTGGT-AACCCAAACTGAGGTGTAGC SEQ ID NO：4
SADS-LB TCGCAATCGTAACAAAGAACCT SEQ ID NO：5
SADS-LF CACCCTGAATCCGTTTCCTG SEQ ID NO：6
温条件下进行环介导等温扩增，扩增结束后在80℃灭活酶活性20min；
所述的RT-LAMP反应液为：
3)利用DEAOU-308C恒温荧光检测仪检测，参数设置：时间60min检测间隔30s温度63℃阀值设置3-6min方差倍数10。
1.2.4.RT-LAMP反应结果分析
结果判定可使用1.5％～2％琼脂糖凝胶进行电泳，若结果为阳性，则会出现“梯状”的电泳结果；若为阴性，则在引物二聚体形成带附近会有很亮的条带。此方法在跑电泳过程中容易造成相互交叉污染。SYTO-9实时荧光值检测：在反应体系中加入终浓度为0.1mM的SYTO-9饱和染料，其会与核酸结合，在激发光的作用下会发出荧光。此方法不需要开盖就能完成结果的判定，减少污染的可能。
1.2.5.RT-LAMP特异性
利用所建立的方法进行特异性试验，用CSFV、PRRSV、TGEV、FMDV、PEDV、H1N1做阴性核酸对照，ddH2O做空白对照，做一个重复，结果如图2，除了SADS扩增外，其他阴性核酸和空白对照没有出现扩增，证明该方法特异性良好。
1.2.6.灵敏性
用SADS RT-LAMP外引物进行PCR扩增，对200bp左右的条带胶回收，连接PGEM-T载体，转化DH5a涂板过夜；挑取单菌落进行扩大培养后PCR扩增，送测序。提取质粒用Sac II酶酶切，用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System—T7试剂盒进行体外转录。测出浓度为2773.25ng/μL，换算为1.265*1013copies/μL。对其进行十倍倍比稀释。
用1.265*107copies/μL、1.265*106copies/μL、1.265*105copies/μL、1.265*104copies/μL、1.265*103copies/μL、1.265*102copies/μL、1.265*10copies/μL、ddH2O做空白对照做灵敏度试验，结果如图3，可知该方法可以检测到1.265*102copies/μL浓度的RNA。
1.2.7RT-LAMP重复性和稳定性
利用所建立的方法对1.265*1010copies/μL、1.265*109copies/μL、1.265*108copies/μL三个稀释度做重复性与稳定性试验，每个稀释度做三个重复，并设空白对照。结果如图4，每个稀释度可扩增，且扩增起始时间一样，荧光值相差不大，可证明该方法具有可靠的重复性与稳定性。
1.2.8.T-RT-LAMP临床实验
用所建立RT-LAMP方法检测已知20份阳性临床样品核酸，并做用8份阴性对照和4份空白对照(共4组，每组里含有5个阳性核酸、2个阴性核酸、一个空白对照)，结果如下图5和图6所示。检测结果可知20份阳性临床样品核酸出现了扩增，8份阴性对照和4份空白对照没有出现扩增情况，证明该方法可用于临床样品的检测。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
广东省实验动物监测所
<120> 猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine influenza virus)
<400> 1
cagccttcta actggcactt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine influenza virus)
<400> 2
acagtcaggt ctggtggtaa 20
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine influenza virus)
<400> 3
cgtcaacagc gacccaatgc atcctcacgc agatgctcc 39
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine influenza virus)
<400> 4
aactagcccc acaggtcttg gtaacccaaa ctgaggtgta gc 42
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine influenza virus)
<400> 5
tcgcaatcgt aacaaagaac ct 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine influenza virus)
<400> 6
caccctgaat ccgtttcctg 20

Claims (7)

1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，其特征在于，包括由正向内引物SADS-FIP、反向内引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向环引物SADS-LF和反向环引物SADS-LB组成；各引物核苷酸序列如下所示：
引物SADS-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物SADS-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物SADS-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
引物SADS-LF核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含权利要求1所述的RT-LAMP引物组合物。
3.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)从样品中提取病毒的RNA；
2)以提取的RNA为模板，利用权利要求1)中所述的SADS的RT-LAMP引物组合物，建立RT-LAMP扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；
3)利用DEAOU-308C恒温荧光检测仪进行闭管检测。
4.根据权利要求3所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，其特征在于，所述RT-LAMP反应液为：总体积为25μL，反应缓冲液2.5μL；MgSO4 1.5μL；dNTP Mix 3.5μL；Primer mix 1μL；甜菜碱4μL；RNA 2.0μL；Bst 2.0DNA聚合酶1μL；逆转录酶0.5μL；SYTO-90.5μL。
5.根据权利要求4所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，其特征在于，所述的MgSO4浓度为100mM，dNTP Mix浓度为10mM；甜菜碱浓度为5M；逆转录酶浓度为1U/μL；SYTO-9浓度为5mM。
6.根据权利要求4所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，其特征在于，所述的Primer mix体系中SADS-OF/SADS-OB、SADS-IF/SADS-IB、SADS-LB的终浓度分别为：0.2mM、1.6mM、0.8mM。
7.根据权利要求3所述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增程序为63℃扩增1h。
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