CN109563530A - 乳液中的RNase H突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在乳液中对样品进行核糖核酸酶(RNase)H2‑介导的裂解反应的方法和试剂盒。

Description

乳液中的RNase H突变体
发明简述
本发明涉及突变体RNase H2酶在乳液系统中的用途。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2016年8月9日提交的美国临时专利申请第 62/372,436号的权益。
以电子方式提交的材料的引用并入
通过整体引用并入本文的是与本文同时提交并且如下标识的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：2017年8月1日创建的名为“序列表更新_ST25-21486972v1.txt”的一个151,351字节的ASCII(文本)文件。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛使用的生物技术，其允许研究人员扩增单拷贝的DNA以产生大量的期望产物。与许多技术一样， PCR方法不断被修改以提高其功效。PCR的挑战之一是形成“引物二聚体”，其中反应中的引物无意地沿互补碱基彼此杂交。已经二聚化的引物不能与DNA上的靶序列杂交，从而阻止扩增。仔细设计引物降低了引物二聚体形成的可能性；然而，偶尔需要将引物定位在靶DNA 序列中的次优位置。
RNase H依赖性PCR(rhPCR)的开发部分是为了减少PCR中引物二聚体的形成。在rhPCR系统中，引物被“封闭”，在引物的3'末端包含不可延伸的基团，例如标记或C3间隔区。引物包括引物3'末端附近的一个或多个核糖核苷酸残基，并且如果引物和靶标之间存在完全互补，则RNase H用于在RNA碱基区域裂解引物。用RNase H裂解引物除去了封闭基团并允许用DNA聚合酶延伸。因此，RhPCR增强了引发/延伸的特异性，并减少了不需要的延伸产物，例如可能由引物二聚体产生的产物。
Walder等人描述了衍生自超嗜热古菌深海热球菌(Pyrococcus abyssi,P.a.)的RNase H 2酶的用途(参见，例如，国际专利申请公开 WO 2013/142364)。RNase H酶是内切核糖核酸酶，当属于RNA：DNA 双链体的一部分时，其能够裂解RNA链中的磷酸二酯键。P.a.RNase H2 在高温下具有活性，在较低温度下活性降低，允许PCR反应在室温下进行而不会过早裂解核糖核苷酸。RNase H2与大多数PCR缓冲液相容，并且当直接添加到PCR主混合物中时，核糖核苷酸残基的裂解通过 DNA聚合酶与PCR扩增无缝地发生(参见，例如，美国专利8,911,948)。
提高扩增靶标的灵敏度和准确定量是PCR技术的其它发展领域。特别地，数字PCR和基于乳液的技术的组合产生了高度灵敏和定量的 PCR平台。在数字PCR(也称为“单分子PCR”或“有限稀释PCR”) 中，将样品充分稀释并分配，使得每个分区平均含有单拷贝或更少的靶核酸；通过在反应中包括探针，可另外定量扩增的靶标(参见，例如，Vogelstein等人，《美国国家科学院院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)》，96：9236-9241(1999)和美国专利6,440,706)。在乳液PCR 中，通过建立油包水乳液产生分区，其中每个水滴平均含有单拷贝或更少的核酸和用于进行PCR的必需试剂。与常规的96-、384-或甚至 1536-孔反应相比，反应体积可显著降低。乳液PCR还允许扩增产物的高通量分析。
数字和乳液基PCR平台的组合已经产生数字液滴PCR，其允许核酸样品在乳液中被分成数万个液滴，在每个个体液滴中发生PCR扩增和所需靶标的定量。数字液滴PCR提供单个模板分子的灵敏和特异性检测。然而，与所有类型的PCR一样，数字液滴PCR也易于形成引物二聚体(参见Hindson等人，《分析化学(Anal Chem)》，83：8604-8610 (2011))。
rhPCR在液滴数字格式中的潜在用途是广泛的(参见，例如，美国专利申请公开2013/0310269)。然而仍然需要具有减少的副反应和增加的特异性的数字rhPCR方法。本发明提供了这样的方法。
发明内容
本公开提供了用于对一个或多个目标核酸序列进行RNase H2-介导的裂解的方法，其包括提供包含一个或多个目标核酸序列的样品；对一个或多个核酸序列进行RNaseH2-介导的裂解反应，其中RNase H2-介导的裂解反应包括：(i)突变体深海热球菌(P.a.)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、 SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和 SEQ ID NO:165；(ii)突变体强烈火球菌(Pyrococcus furiosis，P.fur) RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130；(iii) 突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNaseH2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133；(iv) 突变体柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136；或(v) 突变体嗜热高温球菌(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或 SEQ ID NO:138的氨基酸序列；于是，裂解一个或多个目标核酸序列。
本公开还提供了用于裂解一个或多个目标核酸序列的试剂盒，其包含(a)一种或多种试剂，用于对包含一个或多个目标核酸序列的样品在乳液中进行RNase H2-介导的裂解反应，(b)一个或多个选自以下的突变体RNase H2酶：(i)突变体深海热球菌(P.a.)RNaseH2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO:82、SEQID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、 SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和 SEQ ID NO:165；(ii)突变体强烈火球菌(Pyrococcus furiosis，P.fur)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130；(iii) 突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133；(iv) 突变体柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136；和(v) 突变体嗜热高温球菌(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或 SEQ ID NO:138的氨基酸序列，和(c)进行RNase H2-介导的裂解反应的说明书。
本公开还提供选自以下的突变体RNase H2酶：(a)突变体深海热球菌(P.a.)RNaseH2酶，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:21、或SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:70、SEQID NO: 71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、 SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQ IDNO: 165的氨基酸序列；(b)突变体强烈火球菌(Pyrococcus furiosis，P.fur) RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130的氨基酸序列；(c)突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133的氨基酸序列；(d)突变体柯达砂热球菌 (T.kod)RNaseH2酶，其包含SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135或 SEQ ID NO:136的氨基酸序列；和(e)突变体嗜热高温球菌(T.lit) RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
本公开还提供了包含以下之一的突变体RNase H2酶：(a)包含 SEQ ID NO:95的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个： A9S、R11K、P13S、E48R、M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、 E199Y、E199G和/或F220L；(b)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、Q48R、 M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、E199Y、E199G和/或F218L； (c)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、A107V、P171G、S172I、D173E、K199Y、 K199G、K199E和/或Y224L；或(d)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、M80L、 A107V、P171G、S172I、D173E、K199Y、K199G、K199E和/或F220L。本公开还提供了用于裂解一个或多个目标核酸序列的试剂盒，其包含 (a)一种或多种试剂，用于对包含一个或多个目标核酸序列的样品在乳液中进行RNase H2-介导的裂解反应，(b)一个或多个上述突变体 RNase H2酶，和(c)进行RNase H-介导的裂解反应的说明书。
本公开还提供了对一个或多个目标核酸序列进行RNase H2-介导的裂解的方法，包括(a)提供包含一个或多个目标核酸序列的样品，和(b)对一个或多个核酸序列进行RNase H2-介导的裂解反应，其中RNase H2-介导的裂解反应包括包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，于是裂解一个或多个目标核酸序列。
附图说明
图1是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了在液滴数字rhPCR系统中的野生型深海热球菌(P.a.)RNase H2滴定。使用未封闭的(U)引物或封闭的(B)rh 引物与4200、3150、2100或420fmol的野生型P.a.RNase H2运行RNase P(RNP)测定。绘制每个液滴的荧光强度(Y轴)(事件编号，X轴)。
图2是显示使用QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐公司)的数字液滴rhPCR系统中的野生型(WT)和突变体RNase H2 酶活性的图。使用未封闭或封闭的rh引物和420fmol(21nM)的各个 RNase H2酶运行RNase P(RNP)测定。对于未封闭的引物(WT-U)，仅显示了野生型酶的结果。对于野生型(WT-B)和突变体酶(编号泳道)均显示了封闭的rh引物的结果。
图3是显示数字液滴rhPCR系统中P13S突变体RNase H2滴定的图。将RNase H2酶P13S从420fmol滴定至26fmol，并通过RNase P (RNP)测定用标准未封闭的(U)引物或封闭的(B)rh引物进行评估。
图4比较了使用QX-200TM液滴读数器(伯乐公司)的微滴式数字 PCR系统中的野生型RNase H2和基于乳液的进化衍生的突变体RNase H2酶。使用标准未封闭的(U)引物或封闭的(B)rh引物与420fmol 的各突变体运行RNase P(RNP)测定。具有野生型突变体的未封闭样品显示为参照。
图5是来自强烈火球菌、深海热球菌、掘越氏热球菌、柯达砂热球菌和嗜热高温球菌的野生型RNase H2氨基酸序列的比对。P.a.中确定的目标突变列在序列上方。在柯达砂热球菌和嗜热高温球菌中这些突变的自然发生以粗体和下划线表示
图6是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了从深海热球菌、柯达砂热球菌、掘越氏热球菌、嗜热高温球菌和强烈火球菌分离的野生型RNase H2的比较。使用标准的未封闭的引物(U)或封闭的(B)rh引物与420fmol(相当于200mU野生型P.a.)的所示野生型RNase H2运行RNase P测定。
图7是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了P.a. 和T.kod野生型RNase H2滴定的比较。使用标准未封闭的引物(U) 或封闭的(B)rh引物运行RNase P测定。将野生型P.a.RNase H2酶从840fmol滴定至210fmol(400mU至100mU)，并将野生型T.kod. 从840fmol滴定至52.5fmol(相当于400mU至25mU的野生型P.a.)。
图8是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了来自嗜热高温球菌的野生型和突变体RNase H2酶的比较。使用标准未封闭的引物(U)或封闭的(B)rh引物和420fmol(相当于200mU野生型P.a.)的所示突变体嗜热高温球菌RNase H2酶运行RNase P测定。
图9是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了来自强烈火球菌的野生型和突变体RNase H2酶的比较。使用标准的未封闭的引物(U)或封闭的(B)rh引物和420fmol(相当于200mU野生型P.a.)的所示突变体强烈火球菌RNase H2酶运行RNase P测定。
图10是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了来自掘越氏热球菌的野生型和突变体RNase H2酶的比较。使用标准未封闭的引物(U)或封闭的(B)rh引物和420fmol(相当于200mU野生型P.a.)的所示突变体掘越氏热球菌RNase H2酶运行RNase P测定。
图11是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了来自柯达砂热球菌的野生型和突变体RNase H2酶的比较。使用标准未封闭的引物(U)或封闭的(B)rh因为和4.2fmol(相当于2mU野生型P.a.)的所示突变体柯达砂热球菌RNase H2酶运行RNase P测定。
图12是来自QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)的图，显示了野生型P.a.和P13S Q48R M80L A107V突变体P.a.RNase H2滴定的比较。使用标准未封闭的引物(U)或封闭的(B)rh引物和4200fmol或420 fmol(2000mU至200mU)的野生型P.a.RNase H2酶或从4200fmol 滴定至4.2fmol(相当于2000mU至2mU的野生型P.a.)的P.a.P13S Q48R M80L A107V突变体RNase H2酶运行RNaseP测定。
具体实施方式
在详细解释本发明的任何实施例之前，应理解，本发明的应用不限于以下描述中阐述的或在以下附图中示出的构造细节和部件布置。本发明能够具有其它实施例并且能够以各种方式实践或实施。
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如有冲突，以本文件(包括定义)为准。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，但优选的方法和材料如下所述。
如本文所用的“互补”或“互补的”是指核酸，并且可以指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。
“荧光团”或“荧光标记”是指荧光发射最大值在约350至900nm 的化合物。
如本文所用的“杂交”是指由于互补碱基配对而由两个单链核酸形成双链体结构。杂交可以发生在完全互补的核酸链之间或含有较小的错配区域的“基本上互补的”核酸链之间。“引物二聚体”是指两个寡核苷酸引物的杂交。如本文所用的“严格杂交条件”是指强烈优选完全互补核酸链杂交的条件。在严格杂交条件下，第一核酸序列(例如，引物)将与第二核酸序列(例如，靶序列)杂交，例如在核酸的复杂混合物中杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。严格条件可选择为在规定的离子强度pH下比具体序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是50％与靶标互补的寡核苷酸在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡时被占用)的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是下述条件：其中盐浓度小于约1.0M钠离子，例如在pH7.0 至8.3下约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，以及对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)，温度为至少约60℃。加入去稳定剂如甲酰胺也可以达到严格的条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，于42℃下温育，或5x SSC，1％SDS，于 65℃下温育，在0.2x SSC和0.1％SDS中于65℃下洗涤。
如本文所用的术语“核酸”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸还包括所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本上相同的核酸及其互补物。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可以含有双链和单链序列二者的部分。核酸可以是DNA，基因组和cDNA二者，RNA或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得，并且可以含有非核苷酸修饰，例如间隔子或标记。特定核酸序列可包括其保守修饰的变体(例如，密码子替代)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。
“聚合酶链反应(PCR)”是指酶促反应，其中DNA片段在体外由底物DNA合成并扩增。该反应通常涉及使用两个合成的寡核苷酸引物，其与底物DNA中的核苷酸序列互补，所述底物DNA被短距离的数百至数千碱基对隔开，并使用热稳定DNA聚合酶。链式反应由一系列10至40个循环组成。在每个循环中，底物DNA首先在高温下变性。冷却后，大量过量存在的合成引物与底物DNA杂交，以沿互补核苷酸序列形成双链结构。然后引物-底物DNA复合物将作为DNA聚合酶催化的DNA合成反应的起始位点，从而合成与底物DNA链互补的新 DNA链。每个额外的循环重复合成过程，产生底物DNA的扩增产物。
“循环探针(cycling probe)”反应或“循环探针技术(cycling probetechnology)(CPT)”是用于检测具体靶DNA序列的等温信号放大方法。嵌合探针DNA-RNA-DNA和热稳定RNase H酶是该测定的两个主要组成部分。在靶序列的存在下，形成DNA/RNA杂合体，并且RNase H特异性地催化杂交体的RNA部分的裂解。由于裂解的片段较小，它们在反应温度下自发地从靶序列解离。然后将靶标再循环并可用于与另一探针杂交；该反应本身是循环的，无需外部操作(参见，例如，美国专利5,403,711，Warnon等人，《生物技术(BioTechniques)》， 28：1152-1160(2000)；和Duck等人，《生物技术(BioTechniques)》， 9：142-147(1990))。与PCR不同，产品以线性方式积累。
与PCR相比，“环介导等温扩增”或“LAMP”是在恒定温度下进行并且不需要热循环仪的等温核酸扩增方法。在LAMP中，合成大量DNA，产生大的焦磷酸根离子副产物。焦磷酸根离子与二价金属离子结合形成不溶性盐。向反应溶液中加入亚锰离子和钙黄绿素(一种荧光金属指示剂)允许在一步扩增反应期间显示荧光的基本变化，这大约需要30-60分钟(参见，例如，Tomita等人，《自然协议(Nature Protocols)》，3：877-882(2008))。
如本文所用的“引物”是指能够在合适条件下充当DNA合成的起始点的寡核苷酸。合适的条件包括其中发生寡核苷酸与模板核酸的杂交，并且在四个不同的核苷三磷酸和用于延伸的试剂(例如，DNA聚合酶)的存在下在合适的缓冲液和合适的温度下发生靶序列的合成或扩增的那些。
“探针”和“荧光生成探针”是同义的，并且是指a)具有附着的荧光团和/或猝灭剂的序列特异性寡核苷酸，和任选的小沟结合剂或b) DNA结合试剂，例如但不限于Green染料。
“猝灭剂”是指化合物的分子或部分，其在附着于供体或接近供体时能够减少荧光供体的发射。猝灭可以通过几种机制中的任何一种发生，包括荧光共振能量转移、光诱导电子转移、系统间交叉的顺磁增强、Dexter交换耦合和激子耦合，例如暗复合物的形成。
2.RNaseH2裂解反应
本文描述了用于对一个或多个目标核酸序列进行RNase介导的裂解的方法，其包括提供包含一个或多个目标核酸序列的样品；并对一个或多个核酸序列进行RNase-介导的裂解反应。术语“RNase-介导的裂解反应”是指其中RNase酶催化形成RNA的糖-磷酸主链的至少一个共价糖-磷酸连接的断裂的反应。RNase-介导的裂解反应可以作为需要RNase-介导的核酸裂解的任一方法的一部分进行，例如，RNase H 依赖性PCR(rhPCR)反应、环介导等温扩增(LAMP)反应、循环探针技术(CPT)或任何基于乳液的测定。RNase-介导的裂解反应也可用于检测RNase H依赖性PCR反应中双链DNA断裂(例如，作为靶向核酸内切酶活性的结果)的同源定向修复(HDR)。
3.数字PCR系统
在一个实施例中，RNase H2-介导的裂解反应作为用于扩增一个或多个目标核酸的方法的一部分进行，所述方法包括在数字PCR系统中对含有一个或多个目标核酸的样品进行RNase H依赖性PCR(rhPCR) 反应。待扩增的一个或多个目标核酸序列也可以称为“靶标”、“靶序列”、“靶区域”或“靶核酸”，所有这些都是同义词并且是指待扩增、测序或检测的核酸区域或序列。
术语“RNase H PCR(rhPCR)”是指利用“封闭的”寡核苷酸引物和RNase H酶的PCR反应。“封闭的”引物含有阻止引物通过聚合酶延伸的封闭基团，并且封闭的引物在引物或者其它寡核苷酸内含有至少一个化学部分(例如但不限于核糖核酸残基或2'氟代碱基)，使得当封闭的引物与模板或靶核酸杂交时，通过在化学部分识别和裂解的RNase H酶裂解来除去封闭基团。在RNase H裂解后，可发生靶DNA 的扩增。
在一个实施例中，封闭引物的3'末端可包含封闭基团rDDDDMx，其中相对于靶核酸序列，“r”是RNA残基，“D”是互补DNA残基，“M”是不匹配的DNA残基和“x”是C3间隔子。C3间隔子是与寡核苷酸的末端3'羟基连接的短的3-碳链，其在裂解RNA残基之前进一步抑制DNA聚合酶的结合。
本文描述的方法可以使用衍生自或获自任何生物体的任何合适的 RNase H酶来进行。通常，使用获自或衍生自超嗜热古菌深海热球菌 (P.a.)的RNase H酶(例如RNaseH2)进行RNase H依赖性PCR反应。因此，在一个实施例中，本文所述方法中使用的RNase H酶期望地获自或衍生自深海热球菌，优选为获自或衍生自深海热球菌的RNase H2。在其它实施例中，本文所述方法中使用的RNase H酶可以获自或衍生自其它物种，例如，强烈火球菌、掘越氏热球菌、柯达砂热球菌或嗜热高温球菌。
在一个实施例中，RNase H依赖性PCR反应在数字PCR系统(即数字rhPCR)中进行。“数字PCR”是指在单个选择的起始模板上进行的PCR反应，其中多个个体模板各自分离到单独的反应区域中(参见，例如，Vogelstein等人，《美国科学院院报(PNAS)》，96：9236-9241(1999)和美国专利6,440,706)。因此，数字PCR允许检测和精确量化例如低水平病原体，稀有基因序列，量化变体拷贝数和稀有突变(参见，例如，Manoj，P.，《线粒体DNA(Mitochondrial DNA)》，27 (1)：742-6(2016))。在数字PCR中，反应区域可以是例如孔、腔室、珠或油包水乳液。如果不存在起始分子，则数字PCR反应将产生阴性结果，或者如果存在靶向起始模板，则数字PCR反应将产生阳性结果。分析阳性反应的数量允许量化起始模板。因此，大量反应区域可用于单个数字PCR实验。任何合适的数字PCR系统都可以用于本发明的方法中，其中许多是本领域已知的并且可以从诸如QX200TM液滴数字TM PCR系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)、RAINDROPTM数字PCR系统(飞雨技术有限公司 (Raindance Technologies，Inc.)，比勒利卡，马萨诸塞州)、3D数字PCR系统(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)和数字芯片TM集成流体回路(IFC) 系统(Fluidigm Corporation，南旧金山，加利福尼亚州)商购获得。
在一个实施例中，数字PCR系统可以是液滴数字PCR系统。术语“液滴数字PCR”是指数字PCR系统，其中反应区域是孔中的水滴。优选地，数字PCR系统是乳液液滴数字PCR系统。术语“乳液液滴数字PCR”是指数字PCR系统，其中反应区域是在水-油乳液中形成的液滴。用于进行液滴数字PCR和乳液液滴数字PCR的技术是本领域已知的，包括但不限于Hindson等人，《分析化学(Anal Chem)》，83： 8604-8610(2011)；Pinheiro等人，《分析化学(AnalChem)》，84： 1003-1011(2012)；和Jones等人，《病毒学方法杂志(J.VirologicalMethods)》，202：46-53(2014)中描述的那些。液滴数字PCR系统和乳液液滴数字PCR系统也可从诸如QX200TM液滴数字TM PCR系统 (伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)商购获得。
本文所述的RNase H依赖性PCR反应可以使用引物和探针寡核苷酸序列的任何合适组合进行，其选择将取决于待扩增的靶核酸的序列。在一个实施例中，使用一组封闭的引物和一组未封闭的引物进行RNase H依赖性PCR反应。合适的探针包括，例如，双标记探针、多荧光团或多猝灭剂(或其组合)，如双猝灭剂ZEN探针(集成DNA技术有限公司(IntegratedDNA Technologies,Inc.))、MGB TaqMan探针和双标记非-MGB TaqMan探针(参见Hindson等人，《分析化学(Anal Chem.)》，83：8604-8610(2011))和分子信标探针(参见美国专利6,440,706)。双标记探针被具有5'-外切核酸酶活性的聚合酶裂解。虽然上述探针通常长于16个核苷酸，但与本发明方法结合使用的探针可具有任何合适的大小。例如，探针长度可为约25-30个核苷酸，长度可为约50-80个核苷酸，或长度可为约100-150个核苷酸。可用于本发明方法的特异性引物和探针序列的实例在下文的实例中列出。
在一个实施例中，当通过本发明方法扩增两个或更多个靶核酸序列时，可以使用两个或更多个探针的组合。例如，两个探针可用于识别液滴中的两个靶标，使得特定PCR反应中可存在四个群体：不存在靶标(探针1-/探针2-)，存在两个靶标之一(探针1+/探针2-或探针 1-/探针2+)，或存在两个靶标(探针1+/探针2+)。对靶核酸序列的特定组合具有特异性的探针的适当组合的选择完全在本领域技术范围内，并且可以使用本领域已知的常规方法设计并生产这种探针。
如上所讨论的，技术人员将理解，探针寡核苷酸可包含附着于其上的荧光团和/或猝灭剂。用于本发明方法的探针可包含与其连接的任何合适的荧光团和/或猝灭剂。合适的荧光团包括，例如，5-FAM(也称为5-羧基荧光素，也称为螺(异苯并呋喃-1(3H),9'-(9H)氧杂蒽)-5-甲酸,3',6'-二羟基-3-氧代-6-羧基荧光素)、5-六氯-荧光素([4,7,2’,4’,5’,7’- 六氯-(3’,6’-二新戊酰基-荧光素基)-6-甲酸])、6-六氯-荧光素 ([4,7,2’,4’,5’,7’-六氯-(3’,6’-二新戊酰基荧光素基)-5-甲酸])、5-四氯荧光素([4,7,2’,7’-四氯-(3’,6’-二新戊酰基荧光素基)-5-甲酸])、6-四氯 -荧光素([4,7,2’,7’-四氯-(3’,6’-二新戊酰基荧光素基)-6-甲酸])、 5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；吡罗红，9-(2,4-二羧基苯基)-3,6- 双(二甲基-氨基)、6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)、9-(2,5-二羧基苯基)-3,6-双(二甲基氨基)、EDANS(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)、 1,5-IAEDANS(5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸)、Cy5(碘二碳花青-5)；Cy3(碘-二碳花青-3)和BODIPYFL(2,6-二溴-4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸)、-670 染料(生物研究技术公司(Biosearch Technologies))，CalOrange染料(生物研究技术公司)、ATTO染料(Atto-Tec GmbH)、Rox染料、Max染料(集成DNA技术有限公司)及其衍生物。
在扩增靶核酸之前，猝灭剂阻止检测荧光团信号。任何合适的猝灭剂均可用于本发明，例如DABCYL、BLACK HOLETM猝灭剂(如 BHQ-BHQ-和BHQ-)、IOWAFQ和IOWA RQ，所有这些都可从各种来源商购获得。在通过DNA聚合酶扩增靶核酸期间，可以裂解并分离荧光团和/或猝灭剂，从而允许检测荧光团信号。荧光强度与扩增产物的量成比例，并允许定量靶核酸。
4.突变体RNase H酶
本文描述的方法涉及RNase H2依赖性裂解反应，其包含突变体 RNase H酶，例如获自或衍生自深海热球菌(P.a.)、强烈火球菌(P.fur.)、掘越氏热球菌(P.hori),柯达砂热球菌(T.kod)或嗜热高温球菌(T. lit)的突变体RNase H2酶。“突变体”是指与野生型或天然存在的 RNase H2氨基酸序列相比，本文所述的RNase H2的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸残基的缺失、插入或替代。突变体酶可以通过本领域已知的合适技术设计，例如通过标准定点诱变方法(也称为位点特异性诱变或寡核苷酸定点诱变)(参见，例如，Weiner M.等人，《基因(Gene)》，151：119-123(1994))。可以使用一个或多个寡核苷酸引物进行定点诱变，每个引物相对于野生型RNase H2序列带有至少一个突变的核酸残基。在一个实施例中，用于位点特异性诱变的每个引物可含有至少三个核酸突变。在另一个实施例中，突变发生在连续的核酸残基处。突变体酶可以在合适的宿主例如细菌中表达，并通过本领域已知的任何合适的技术纯化，例如描述于例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)》，第4版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(2012)；和Ausubel等人，《目前的分子生物学协议(Current Protocols in Molecular Biology)》，约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons)，纽约(2016)中的那些。在一个实施例中，例如，编码通过位点特异性诱变产生的突变体RNase H酶的核酸序列可以在大肠杆菌(E.coli)中表达，通过NiNTA色谱法纯化，并重悬于缓冲液F (20mM Tris-HCl pH 8.4，100mM KCl，0.1M EDTA，0.1％TRITON X-100TM和50％甘油)中，例如美国专利8,911,948中所述。
可以基于RNase H2依赖性PCR反应(rhPCR)中已知的模板起始量的扩增效率来评估突变体RNase H酶的活性。在一个实施例中，例如，起始模板可以是人RNASE P基因，并且可以使用RNase P(RNP) 测定来测量特定突变体RNase H酶的活性。“RNase P(RNP)测定”是通过定量RNASE P的扩增来评估酶活性的方法。RNP测定利用两个寡核苷酸引物与探针的组合，并允许添加酶，例如，RNase H2。其它 RNase H2测定方法是本领域技术人员熟知的。
可与本文所述方法结合使用的突变体P.a.RNase H2酶氨基酸序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、 SEQID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:165，或与任一前述氨基酸序列至少90％相同(例如，90％、91％、92％、93％、94％相同)的氨基酸序列，并且优选至少95％相同(例如，95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。更优选地，突变体P.a.RNase H2酶包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、 SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、或SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:82、 SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:165的氨基酸序列。
可以与本文描述的方法结合使用的突变体强烈火球菌RNase H2 酶氨基酸序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、 SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQID NO:130。可以与本文描述的方法结合使用的突变体掘越氏热球菌RNase H2酶氨基酸序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133。可以与本文描述的方法结合使用的突变体柯达砂热球菌RNase H2酶氨基酸序列的实例包括但不限于SEQID NO:134、SEQ ID NO:135和 SEQ ID NO:136。可以与本文描述的方法结合使用的突变体嗜热高温球菌RNase H2酶氨基酸序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:137和 SEQ ID NO:138。
在另一个实施例中，突变体强烈火球菌RNase H2酶可包含含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个： A9S、R11K、P13S、E48R、M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、 E199Y、E199G和/或F220L。在另一个实施例中，突变体掘越氏热球菌RNase H2酶可包含含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、Q48R、M80L、A107V、 P171G、S172I、D173E、E199Y、E199G和/或F218L。在另一个实施例中，突变体柯达砂热球菌RNase H2酶可包含含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、 A107V、P171G、S172I、D173E、K199Y、K199G、K199E和/或Y224L。在另一个实施例中，突变体嗜热高温球菌RNase H2酶可包含含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、 R11K、P13S、M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、K199Y、K199G、 K199E和/或F220L。如上所讨论的，突变体RNase H2酶还可以包含与任一前述氨基酸序列至少90％相同(例如，90％、91％、92％、93％、 94％相同)的氨基酸序列，并且优选至少95％相同(例如，95％、96％、 97％、98％、99％或100％相同)的氨基酸序列。
除了数字PCR系统，例如数字液滴PCR(ddPCR)和乳液液滴数字PCR，本文所述的突变体RNase H酶可用于其它核酸扩增和检测测定，包括但不限于，“热启动”测定(例如，热启动PCR)、循环探针技术(CPT)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、寡核苷酸连接测定(OLA)、连接链反应(LCR)、多项式扩增和DNA 测序。
“热启动”PCR是PCR的修饰形式，其通过在较低温度下灭活 Taq聚合酶来避免DNA的非特异性扩增。具体地，热启动测定使用修饰的寡核苷酸，其不能参与PCR反应，直到其与互补核酸序列杂交，并且被裂解以产生功能性5'-或3'-末端。与使用标准未修饰的DNA寡核苷酸的相应测定相比，热启动方案提供增强的特异性。此外，排除了对可逆失活的DNA聚合酶或DNA连接酶的需求。在一个实施例中，热启动组分可以是热稳定的RNase H或其它切口酶，其在反应中使用的高温下获得活性。可用本文所述的突变体RNase H酶进行的其它测定包括例如引物延伸测定(包括PCR、DNA测序和多项式扩增)、循环探针反应、通过连接测序和通过产生末端标记的片段测序。
在OLA中，使用一组两个或更多个寡核苷酸与热稳定的Taq DNA 连接酶的组合来辨别单核苷酸多态性等位基因。一个探针是等位基因特异性探针，其与靶DNA杂交，使得3'碱基直接位于SNP核苷酸上，而另一个探针与SNP多态性位点上游的模板杂交，为连接反应提供5' 末端。只有当等位基因特异性探针与靶DNA匹配时才能发生连接。在 LCR中，对于两条DNA链中的每一条，连接两个部分探针以形成一个探针；因此LCR使用两种酶：DNA聚合酶和热稳定DNA连接酶。在其它实施例中，其中读数取决于PCR测定以扩增连接事件的产物，可以将任何封闭基团置于通过RNase H裂解除去的本发明寡核苷酸的结构域中。在这种实施例中，可调节RNase H可裂解结构域中封闭基团的精确位置以改变裂解的特异性，并且封闭基团相对于可裂解RNA碱基的精确放置可改变实现最佳裂解速率所需的酶量。
对于连接测定(例如，OLA和LCR)，抑制聚合酶延伸和/或连接活性的修饰可位于寡核苷酸的3'-或5'-末端处或附近。在其它实施例中，如果使用的话，抑制聚合酶延伸和/或连接活性的修饰优选置于通过探针裂解除去的区域中可裂解RNA碱基的3'位的结构域内。在其它实施例中，C3间隔子可以位于本文所述的寡核苷酸探针中靠近RNA 碱基的位置，以提高有助于改善错配辨别的特异性。
5.样品
本文描述的方法理想地在包含一个或多个核酸序列的样品上实施。“样品”或“生物样品”或“样本”是同义词，并且是指从受试者获得的样品。样品可包含核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。样品可以从如本文所定义的受试者获得，其优选是哺乳动物，更优选是人(例如，包含稀有等位基因或突变的人)。受试者还可包括非人动物，例如，所有哺乳动物和非哺乳动物的脊椎动物(例如但不限于非人灵长类动物、羊、狗、猫、牛、猪、马、啮齿目动物、家禽、两栖动物和爬行动物)。样品可以是，例如，生物体液(例如，血液、尿液、精液、唾液、脑脊液、羊水等)，组织活检、刮除物、细针抽出物和离体细胞或组织培养物。
6.用于裂解靶序列的试剂盒
本文描述的发明还包括用于在乳液中在RNase H2依赖性裂解反应中裂解靶序列的试剂盒，例如本文所述的RNase H依赖性PCR (rhPCR)反应(例如，乳液液滴数字PCR系统)、环介导等温扩增 (LAMP)反应或循环探针技术(CPT)。试剂盒理想地包含突变体 RNaseH2酶，例如本文所述的那些，与一种或多种试剂的组合，用于对样品进行RNase H2-介导的裂解反应。包含在试剂盒中的合适试剂的实例包括，例如，野生型RNase H2酶(用于对照)、封闭剂、标记试剂、一个或多个引物、缓冲液、中期染色体涂片(metaphase spread) 等。许多这样的试剂在本文中描述或另外在本领域中已知并且可商购获得。
7.实例
以下实例进一步说明本发明，但不应解释为以任何方式限制其范围。
实例1
本实例证明了野生型P.a.RNase H2酶不能在乳液液滴数字PCR (ddPCR)测定中实施。
首先使用RNase P测定(RNP测定)来评估野生型P.a.RNase H2 酶在数字rhPCR系统中的活性。在RNP测定中，靶核酸是已知量的人 RNASE P基因。使用QX-200TM液滴数字TM(DDPCRTM)系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)，用稀释系列的野生型RNase H2酶进行RNP测定。该系统为(伯乐生命医学产品)或基于探针的数字PCR应用提供靶核酸分子(DNA或 RNA)的绝对定量。
通过添加含有探针和未封闭或封闭的RNP引物的主混合物来制备用于PCR的RNASEP核酸样品。未封闭的引物用作对照，其不需要由 RNase H2裂解为功能性的。封闭的引物包括防止引物二聚体形成的核糖核苷酸残基，并且该残基必须被RNase H2裂解，以便在PCR系统中进行产物扩增。用于测定的特异性探针和引物核苷酸序列列于表1 中。在表1中，DNA核苷酸以大写字母显示，而RNA核苷酸以小写字母显示。HEX(6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素)是荧光染料，FQ 是IOWAFQ荧光猝灭剂。X是C3丙二醇间隔子，用于在RNase H2裂解引物之前防止引物延伸。
表1.RNase P引物和探针序列
对于每20μl反应体积，将4200fmol(210nM或2000mU)、3150 fmol(157.5nM或1500mU)、2100fmol(105nM或1000mU)或420 fmol(21nM或200mU)的野生型RNase H2酶加至含有1x ddPCR探针用Supermix(无dUTP)(伯乐公司)，900nM封闭或未封闭RNP 引物，250nM探针和5x104个拷贝RNaseP模板(集成DNA 技术有限公司(IDT)，科勒尔维尔，爱荷华州)的混合物中。含有未封闭引物的反应用作对照以确保数字rhPCR系统的活力。
然后使用BIO-自动微滴发生器TM(伯乐公司)系统乳化样品，其在每个样品内产生多达20,000个均匀的纳升大小的油包水液滴。在液滴内，靶DNA随机分布，并且每个液滴用于分配反应。根据泊松分布，使用PCR阳性液滴的部分来定量靶核酸。然后使用表1中列出的引物和探针进行数字rhPCR，并且在BIO-QX-200TM液滴数字TM读数器上分析20,000个液滴中的每一个的荧光强度的增加。荧光强度的增加表明阳性反应，而没有荧光表明没有发生靶核酸的扩增。然后使用QUANTASOFTTM v1.7软件(伯乐公司)绘制每个液滴的荧光强度(事件编号)。结果显示在图1中。用未封闭引物(U)进行的反应表现出具有高荧光表达的紧密条带，表明模板DNA的成功扩增。相反，用封闭引物(B)与4200fmol、3150fmol和2100fmol的野生型 RNase H2进行的反应表现出特征性“雨”效应，表明模板DNA的扩增不良。这是乳液中野生型RNase H2活性差的直接结果，这导致引物保持封闭并降低扩增反应的功效。在420fmol野生型P.a.RNase H2中在使用封闭引物的情况下根本没有发生扩增。
这些结果证实了野生型P.a.RNase H2在乳液液滴数字PCR系统中无效。
实例2
本实例描述了突变体P.a.RNase H2酶在乳液液滴数字PCR (ddPCR)测定中的用途。
为了确定在基于乳液的数字PCR测定中突变的P.a.RNase H2酶与野生型P.a.RNase H2相比是否可表现出改善的性能，通过标准定点诱变方法(参见Weiner等人，《基因(Gene)》，151：119-123(1994)) 使用表2中的寡核苷酸引物针对野生型酶产生一系列22个突变体。使用集成DNA技术有限公司的密码子优化网络工具 (www.idtdna.com/CodonOpt)对突变体RNase H酶序列进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。每种突变体酶含有至少一个氨基酸替代。如表2所示，根据发生替代的氨基酸残基编号指定每个突变体，前面是原始氨基酸，后面是替代的氨基酸。
表2
RNase H突变体在大肠杆菌中表达，通过NiNTA色谱法纯化，并重悬于缓冲液F(20mM Tris-HCl pH 8.4,100mM KCl，0.1M EDTA， 0.1％Triton X-100，和50％甘油)中。纯化技术与先前描述的用于纯化 HIS标记的野生型P.a.RNase H2的那些相同(参见美国专利8,911,948)。
使用先前描述的合成rhPCR测定表征突变体酶以确定其功能活性 (参见美国专利8,911,948)。每种突变体相对于野生型P.a.RNase H2 的酶活性如表3所示。
表3
一旦确定了活性，就使用先前描述的数字rhPCR RNP测定进一步测试突变体RNase酶。
对于每20μl反应体积，将420fmol(21nM)的每种RNase H2 酶加至含有1x ddPCR探针用Supermix(无dUTP)(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)，900nM封闭或未封闭的 RNP引物，250nM探针和5×104个拷贝RNase P模板(集成DNA技术有限公司(IDT)，科勒尔维尔，爱荷华州)的混合物中。含有未封闭引物的反应用作对照以确保数字rhPCR系统的活力。
然后使用BIO-自动微滴发生器TM(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)系统乳化样品，其在每个样品内产生多达20,000个均匀的纳升大小的油包水液滴。在液滴内，靶DNA 随机分布，并且每个液滴用于分配反应。根据泊松分布，使用PCR阳性液滴的部分来定量靶核酸。然后使用表1中列出的引物和探针进行数字rhPCR，并且在Bio-QX-200TM液滴数字TM读数器上分析 20,000个液滴中的每一个的荧光强度的增加。荧光强度的增加表明阳性反应，而没有荧光表明没有发生靶核酸的扩增。然后使用QUANTASOFTTM v1.7软件(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)绘制每个液滴的荧光强度(事件编号)。用未封闭引物(U)进行的反应表现出具有高荧光表达的紧密条带，表明模板 DNA的成功扩增。该测定的结果显示在图2中。在含有封闭引物和野生型RNase H2(WT-B，相对于含有未封闭引物的反应)的反应混合物中几乎没有发生RNASE P模板的扩增，与图1显示的结果一致。但是，含有突变的RNase H2酶的几个反应显示出扩增效率的提高；特别地，与含有野生型RNase H2酶的反应相比，突变体A9S(SEQ ID NO:1)、R11K(SEQ ID NO:2)、P13S(SEQ ID NO:7)、P13T(SEQ ID NO: 8)、P171G(SEQ ID NO:13)、S172G(SEQ ID NO:15)、S172I(SEQ ID NO:16)、S172H(SEQ ID NO:17)、D173E(SEQ ID NO:18)和 A9S R11K(SEQ ID NO:20)表现出更大的RNASE P模板扩增。
类似于图1中所示的结果，用突变体RNase H2酶进行的成功反应表现为具有高荧光强度的阳性反应带。在测试的突变体酶中，P13S (SEQ ID NO:7)表现出最高水平的活性，产生明显的条带，其显示出接近未封闭的对照反应的荧光信号强度。此外，RNASE P模板获得的定量值在P13S突变体和野生型RNase H2酶之间相似(2450个拷贝/ μl，数据未显示)，表明产物的成功扩增是通过野生型和突变体酶两者实现的。
实例3
本实例描述了不同浓度的突变体P.a.RNase H2酶在乳液液滴数字 PCR(ddPCR)测定中的作用。
为了进一步评估P13S RNase H2突变体的功能，进行所述酶的滴定，范围为420fmol(21nM)至26fmol(1.3nM)，并且使用RNP 测定评估每种稀释在数字rhPCR系统中的活性。
对于每20μl反应体积，将420fmol(21nM)、210fmol(10.5nM)、 105fmol(5.25nM)、52fmol(2.6nM)或26fmol(1.3nM)的P13S 突变体RNase H2酶加至含有1x ddPCR探针用Supermix(无dUTP) (伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)，900nM 封闭或未封闭RNP引物，250nM探针和5x104个拷贝RNase P模板(集成DNA技术有限公司(IDT)，科勒尔维尔，爱荷华州) 的混合物中。含有未封闭引物的反应用作对照以确保数字rhPCR系统的活力。
然后使用BIO-自动微滴发生器TM(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)系统乳化样品，其在每个样品内产生多达20,000个均匀的纳升大小的油包水液滴。在液滴内，靶DNA 随机分布，并且每个液滴用于分配反应。根据泊松分布，使用PCR阳性液滴的部分来定量靶核酸。然后使用表1中列出的引物和探针进行数字rhPCR，并且在Bio-QX-200TM液滴数字TM读数器上分析 20,000个液滴中的每一个的荧光强度的增加。荧光强度的增加表明阳性反应，而没有荧光表明没有发生靶核酸的扩增。然后使用QUANTASOFTTM v1.7软件(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚)绘制每个液滴的荧光强度(事件编号)。
本实验的结果如图3所示。与未封闭的引物(U)相比，含有封闭的RNP引物(B)的样品中PCR反应的信号强度降低。然而，P13S突变体(SEQ ID NO：7)在420和210fmol(分别为21和10.5nM)下表现出RNP模板成功扩增，并且在低至105fmol(5.25nM)酶时仍能获得良好的浓度调用。从105fmol的P13S突变体酶开始，反应的扩增效率开始下降，如荧光强度的扩大带所示。在52fmol和26fmol功效持续下降。这些结果证明P13S以大于210fmol存在于反应中时表现理想。
本实例的结果证明，可以使用根据本发明方法的突变体深海热球菌(P.a.)RNaseH2酶在RNase H依赖性PCR反应中扩增核酸序列。另外，P13S突变体(SEQ ID NO：7)在较低浓度下有效。
实例4
本实例证明了其它P.a.RNase H2突变体酶在基于乳液的数字液滴 PCR测定中的用途。
通过使用在乳液系统中的标准定点诱变(参见Weiner M.等人，《基因(Gene)》，151：119-123(1994))和表4中列出的寡核苷酸引物产生总共26种突变体RNase H2酶。使用集成DNA技术有限公司的密码子优化网络工具对大肠杆菌的序列进行密码子优化。这些突变体在大肠杆菌中表达，通过NiNTA色谱法纯化，并重悬于缓冲液F 中，如上所述。每种突变体酶含有至少一个氨基酸替代。在表4中，替代位点由残基编号指定，前面是原始氨基酸，并且后面是替代的氨基酸。替代的氨基酸的相应核酸密码子以大写字母显示，而所有其它DNA碱基以小写字母显示。
表4
首先使用RNP测定在数字rhPCR系统中表征这些突变体的功能活性。在含有420fmol酶和封闭或未封闭的RNP引物的反应中测试每种突变体。对于每20μl反应体积，将420fmol(21nM)的每种突变体RNase H2酶加至单独的反应混合物中，该反应混合物还含有1x ddPCR 探针用Supermix(无dUTP)(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)，900nM封闭或未封闭的RNP引物，250nM探针和5×104个拷贝RNaseP模板(集成DNA技术有限公司 (IDT)，科勒尔维尔，爱荷华州)。含有未封闭引物的反应用作对照以确保数字rhPCR系统的活力。
然后使用Bio-自动微滴发生器TM(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)系统乳化样品，其在每个样品内产生多达20,000个均匀的纳升大小的油包水液滴。在液滴内，靶DNA 随机分布，并且每个液滴用于分配反应。根据泊松分布，使用PCR阳性液滴的部分来定量靶核酸。然后使用表1中列出的引物和探针进行数字rhPCR，并且在Bio-QX-200TM液滴数字TM读数器上分析 20,000个液滴中的每一个的荧光强度的增加。荧光强度的增加表明阳性反应，而没有荧光表明没有发生靶核酸的扩增。然后使用QUANTASOFTTM v1.7软件(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)绘制每个液滴的荧光强度(事件编号)。结果显示在图4中。
每种突变体的活性列于表5中，并且呈现了相对于野生型P.a. RNase H2的活性水平。从这些实验中，RNase H2突变体P13S(SEQ ID NO:7)、Q48R(SEQ ID NO:70)、M80L(SEQID NO:77)、P13S_A107V (SEQ ID NO:79)、P13S_D199Y(SEQ ID NO:80)、A107V_D199G (SEQID NO:86)和A107V_D199E(SEQ ID NO:87)被鉴定为表现最佳的。
表5
本实例的结果证实了P.a.RNase H2突变体酶可用于基于乳液的数字液滴PCR测定。
实例5
本实例证明了获自或衍生自其它物种的野生型RNase H2酶在基于乳液的数字液滴PCR测定中的活性。
野生型RNase H2酶由强烈火球菌(SEQ ID NO：95)、掘越氏热球菌(SEQ ID NO：96)和与火球菌属具有更大序列差异的古菌种柯达砂热球菌(SEQ ID NO：97)和嗜热高温球菌(SEQ ID NO：98)合成和/或纯化。RNase H2氨基酸序列的比较(参见图5)显示，两种热球菌物种都具有天然Q48R氨基酸序列，并且柯达砂热球菌在80位具有额外的天然亮氨酸氨基酸(相当于P.a.RNase H2中的M80L)。
使用集成DNA技术有限公司(IDT)密码子优化网络工具 (www.idtdna.com/CodonOpt)，获得每种酶的野生型RNase H2序列作为合成序列并对大肠杆菌进行密码子优化。野生型RNase H2序列在大肠杆菌中表达，通过Ni-NTA亲和色谱法纯化，并在缓冲液F(20mM Tris-HCl pH 8.4,100mM KCl，0.1mM EDTA，0.1％Triton X-100和50％甘油)中透析，如前对纯化野生型P.a.RNase H2所述的(参见美国专利8,911,948)。通过布拉德福(Bradford)和二辛可宁酸(BCA)测定，使用制造商描述的标准方案独立地验证蛋白质浓度。使用和试剂盒(集成DNA技术有限公司，科勒尔维尔，爱荷华州)测试重组蛋白的RNase和DNase污染。
为了确定来自强烈火球菌、掘越氏热球菌、柯达砂热球菌和嗜热高温球菌的野生型蛋白质是否在rh-ddPCR中显示出改善的活性，使用如上所述的RNase P测定来评价功能性(参见表1，SEQ ID Nos:23-27)。反应以96孔板形式进行，并含有1x ddPCRTM探针用Supermix(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)(无dUTP)， 900nM封闭或未封闭的引物，250nM HEX探针和5x104个拷贝RNaseP 模板(集成DNA技术有限公司，科勒尔维尔，爱荷华州)。将RNase H2酶在缓冲液D中稀释，并加入420fmol至终体积20μl。用Bio-Rad自动微滴发生器TM系统(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)生成乳液。在PCR扩增后使用Bio-Rad QX200TM数字液滴读数器(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯， CA)分析液滴。
如上所证明的，野生型P.a.不支持在420fmol下从封闭的引物扩增(参见图6)。密切相关的野生型P.fur和P.hori也不支持420fmol 的扩增。虽然野生型T.lit在420fmol时没有表现出活性，但野生型T.kod (含有天然Q48R和M80L突变)在420fmol时显示出活性，其信号强度与未封闭的引物对照相似，如图6所示。
在rh ddPCR中测试T.kod RNase H2从840fmol至52.5fmol(相当于400mU至25mU的野生型Pa)的滴定，以进一步评价酶活性，如图7所示。包括P.a.RNase H2从840fmol至210fmol(400mU至 100mU)的滴定。虽然野生型P.a.酶在210fmol下无活性，但野生型 T.kod酶支持有效扩增，在测试酶浓度下信号强度与未封闭对照相似。
这些结果证实来自P.fur、P.hori和T.lit的野生型RNase H2酶在乳液液滴数字PCR系统中无效，而野生型T.kod在较低浓度下有效。
实例6
本实例证明了衍生自P.fur、P.hori、T.kod和T.lit的RNase H2突变体酶在基于乳液的数字液滴PCR测定中的用途。
为了确定P.a.P13S、Q48R、M80L、A107V和P13S A107V突变的等同物是否改善了替代RNase H2酶在乳液中的活性，通过定点诱变 (参见Weiner等人，《基因(Gene)》，151：119-123(1994))使用表6中列出的引物将这些突变引入P.fur、P.hori、T.lit和T.kod RNase H2蛋白中。使用集成DNA技术有限公司的密码子优化网络工具 (www.idtdna.com/CodonOpt)对突变体RNase H酶序列进行密码子优化以在大肠杆菌中表达。每种突变体酶含有至少一个氨基酸替代。如表6所示，根据发生替代的氨基酸残基编号指定每个突变体，前面是原始氨基酸，后面是替代的氨基酸。
表6
RNase H突变体在大肠杆菌中表达，通过NiNTA色谱法纯化，并重悬于缓冲液F(20mM Tris-HCl pH 8.4,100mM KCl，0.1M EDTA， 0.1％Triton X-100，和50％甘油)中。纯化技术与先前描述的用于纯化HIS标记的野生型P.a.RNase H2的那些相同(参见美国专利8,911,948)。
根据制造商的说明，使用Bradford和BCA测定独立地验证蛋白质浓度。还使用DNASE和RNASE试剂盒(集成DNA 技术有限公司，科勒尔维尔，爱荷华州)测试蛋白质的RNase和DNase 污染。一些突变体蛋白表现出低水平的RNase污染。结果，在所有rh ddPCR反应中包括5U的SUPERASE-INTM RNase抑制剂(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。SUPERASE-INTM并不抑制RNase H2 活性并封闭背景RNase活性。
对于每20μl反应体积，将420fmol(21nM)的每种RNase H2 酶加至含有1x ddPCR探针用Supermix(无dUTP)(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)，900nM封闭或未封闭的 RNP引物，250nM探针，5U SUPERASE-INTM和5x104个拷贝RNaseP模板(集成DNA技术有限公司(IDT)，科勒尔维尔，爱荷华州)的混合物中。含有未封闭引物的反应用作对照以确保数字rhPCR系统的活力。
使用Bio-Rad AUTODGTM(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)系统乳化样品，其在每个样品内产生20,000个均匀的纳升大小的油包水液滴。在液滴中，靶DNA随机分布，并且每个液滴用于分配反应。根据泊松分布，使用PCR阳性液滴的部分来定量靶核酸。然后使用表1中列出的引物和探针进行数字rhPCR，并且在QX-200TM液滴数字TM读数器(伯乐生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)上分析20,000个液滴中的每一个的荧光强度的增加。荧光强度的增加表明阳性反应，而没有荧光表明没有发生靶核酸的扩增。然后使用QUANTASOFTTM v1.7软件(生命医学产品有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)绘制每个液滴的荧光强度 (事件编号)。用未封闭的引物(U)进行的反应显示具有高荧光表达的紧密条带，表明模板DNA的成功扩增。
对于每个突变体组，用野生型RNase H2进行比较，以评价P.a. 突变赋予的任何改进。除了T.lit(参见图8)，在每种野生型酶背景中都观察到增强的活性。特别地，在P.furP13S(SEQ ID NO：126)和 P13S A107V(SEQ ID NO：130)突变体中观察到改善的活性，如图9所示。在测试的P.hori突变体Q48R(SEQ ID NO：131)、M80L(SEQ ID NO：132)和A107V(SEQID NO：133)中观察到裂解和随后的扩增活性，其信号强度与未封闭的引物对照相似，如图10所示。在T.kod 突变体P13S(SEQ ID NO：134)、A107V(SEQ ID NO：135)和P13S A107(SEQID NO：136)中观察到裂解和随后的扩增活性，其信号强度大于野生型突变体，并且在减少的酶输入量下发生扩增，如图11所示。
本实例的结果证实了P.fur、P.hori和T.kod.RNase H2突变体酶可用于基于乳液的数字液滴PCR测定。
实例7
本实例证明了使用另外的P.a.突变体在基于乳液的数字液滴PCR 测定中的用途。
生成P.a.P13S Q48R M80L A107V(SEQ ID NO：165)四重突变体以与实例6中描述的T.kod P13S A107V(SEQ ID NO 136)突变体的活性比较。通过上述P.a.P13S A107V突变体的标准定点诱变，使用表 6中列出的引物生成P.a.四重突变体以引入Q48R和M80L，总共进行四轮定点诱变。如上所述纯化蛋白质。使用Bradford和BCA测定独立地验证蛋白质浓度，并使用DNASE和RNASE试剂盒(集成DNA技术有限公司，科勒尔维尔，爱荷华州)测试RNase 和DNase污染。
使用如前所述的rh-ddPCR RNase P测定(包括5U的 SUPERASE-INTM)测试P.a.P13SQ48R M80L A107V突变体(SEQ ID NO：136)的活性。将突变体酶从4200fmol至4.2fmol(相当于2000 mU至2mU的野生型P.a.)的滴定与4200和420fmol的野生型P.a. 的活性进行比较，如图12所示。P.a.P13S Q48R M80L A107V突变体 (SEQ ID NO：136)在低至42fmol时显示活性，但在4.2fmol下无活性。
本实例的结果证明了P.a.P13S Q48R M80L A107V突变体可以在 ddPCR环境中支持裂解。
实例8
本实例描述了使用本文所述的RNase H突变体检测同源定向修复 (HDR)的方法。
为了使用RNase H依赖性ddPCR检测从靶向核酸内切酶产生的 HDR事件，使用rh引物设计了靶向期望修饰位点的总共三个rhPCR测定，一个对于期望改变具有特异性，一个用于野生型序列的序列，以及一个对于HDR模板的钝插入的产物具有特异性。还设计了基因座特异性反向引物，其将扩增野生型和编辑模板二者。此外，乳液活性 (emulsion-competent)的RNase H2可裂解的循环探针(CpT)被设计用作检测编辑和未编辑DNA的对照测定。
设计第一组rh引物以检测乳液反应中野生型模板的存在。这些rh 引物被设计为可裂解部分位于可靶向核酸内切酶的最常见裂解位点之后的一个或两个碱基(通常在Cas9中的PAM识别结构域之前3个碱基)。当成功结合至野生型模板时，rh引物被乳液活性的RNase H2酶 (例如本文所述的那些酶)裂解，但当其结合至HDR或非同源末端连接(NHEJ)编辑的模板时则不会被裂解。这允许容易地辨别可能发生的编辑事件，同时仍然保留对野生型模板的特异性。
设计第二组rh引物以检测HDR编辑事件。这些rh引物对HDR 供体模板具有特异性，并且像野生型特异性引物一样设计为可裂解部分位于编辑序列开始后一个或两个碱基处，以最准确地区分HDR和野生型模板。
设计第三组rh引物以检测HDR模板的平头插入。这些rh引物专门设计用于通过识别由平头插入产生的序列复制从HDR编辑信号通道产生额外的信号强度。
每种野生型或插入特异性引物被设计为具有通用正向引物和位于引物5'末端的两个不同荧光探针结合结构域之一。这些通用结构域允许互补探针在通过RNase H2酶去除3'端并通过DNA聚合酶扩增时与扩增子结合。聚合酶的5'核酸外切酶活性将降解检测探针，产生用于野生型或HDR测定的荧光信号。
无论其它引物是否扩增，设计CpT测定以检测模板的存在。这将用于检测每个乳液液滴中DNA的存在或缺失。如果存在模板，则RNase H2酶将裂解探针，产生荧光信号。设计探针使其Tm足够高以使其在整体上与模板结合，但在被乳液活性RNase H2酶裂解时变性。因此，在大多数反应设置中，该探针的期望Tm约为60℃。
将所述引物和探针结合在合适的乳液PCR混合物中，并使用本领域技术人员已知的方法制备乳液液滴。然后进行热循环和荧光定量，允许模板扩增和RNase H2裂解。在扩增期间，在反应混合物中，循环探针与反应中的每个模板结合，允许将含有模板的液滴与不含有模板的液滴分离。含有模板的液滴将允许循环探针的裂解和荧光信号的产生。在发生这种情况时，野生型或靶特异性rh引物与每个单独乳液液滴中存在的模板结合。然后rh引物被RNase H2酶裂解，其也存在于液滴中。DNA聚合酶从新的未封闭的引物延伸，将5'通用正向引物和探针结合结构域整合到新产生的扩增子中。然后，通用正向引物将与其互补结合结构域结合，并降解检测探针。这将提供对应于野生型或期望的HDR模板的荧光信号，这取决于哪个存在于液滴中。如果通过 NHEJ装置发生HDR模板的平头插入，则额外的荧光强度将使该事件与正确的HDR插入区分开。该信号将与从循环探针获得的荧光组合以产生最终信号强度。最后，如果发生NHEJ事件而不是期望的HDR事件，那么只有循环探针将结合并被裂解。使用该技术，可以在单个反应中将期望的HDR事件与NHEJ事件和HDR模板平头插入分离。
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序列表
<110> 合成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies, Inc.）
<120> 乳液中的RNase H突变体
<130> 013670-9038-WO00
<160> 165
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 1
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ser Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
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Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Val Lys Ala Glu
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Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
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Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
130 135 140
Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
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Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
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taaccagcgg accaataact ggaccctgac cagcttcatc tgcacctgca act 53
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cagcaacaat aaccagcgga ccaataaatg gaccacgacc agcttcatct gca 53
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<220>
<223> 核酸
<400> 72
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
Leu Thr Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Ala Gln
35 40 45
Arg Glu Lys Leu Phe Asp Glu Ile Val Lys Val Leu Asp Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
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Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Val Lys Ala Glu
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Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
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Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
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Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 73
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<223> 核酸
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<223> 核酸
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<223> 核酸
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<223> 核酸
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50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Leu
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
115 120 125
Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
130 135 140
Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
145 150 155 160
Ala Glu Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr
165 170 175
Lys Lys Trp Leu Glu Glu Trp Tyr Ser Lys His Gly Asn Phe Pro Pro
180 185 190
Ile Val Arg Arg Thr Trp Asp Thr Ala Lys Lys Ile Glu Glu Lys Leu
195 200 205
Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Leu Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
<210> 89
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 89
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
Leu Thr Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Ala Gln
35 40 45
Arg Glu Lys Leu Phe Asp Glu Ile Val Lys Val Leu Asp Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Leu
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Val Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
115 120 125
Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
130 135 140
Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
145 150 155 160
Ala Glu Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr
165 170 175
Lys Lys Trp Leu Glu Glu Trp Tyr Ser Lys His Gly Asn Phe Pro Pro
180 185 190
Ile Val Arg Arg Thr Trp Asp Thr Ala Lys Lys Ile Glu Glu Lys Leu
195 200 205
Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Leu Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
<210> 90
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 90
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
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35 40 45
Arg Glu Lys Leu Phe Asp Glu Ile Val Lys Val Leu Asp Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Val Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
115 120 125
Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
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165 170 175
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180 185 190
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Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
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<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 91
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Ser Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
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<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 92
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Ser Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
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Leu Thr Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Ala Gln
35 40 45
Arg Glu Lys Leu Phe Asp Glu Ile Val Lys Val Leu Asp Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
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115 120 125
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Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
<210> 93
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 93
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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115 120 125
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Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Lys Lys Leu Lys
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165 170 175
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Ile Val Arg Arg Thr Trp Asp Thr Ala Lys Lys Ile Glu Glu Lys Phe
195 200 205
Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
<210> 94
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 94
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Ser Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
Leu Thr Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Ala Gln
35 40 45
Arg Glu Lys Leu Phe Asp Glu Ile Val Lys Val Leu Asp Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Val Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
115 120 125
Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
130 135 140
Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
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Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220
<210> 95
<211> 224
<212> PRT
<213> 强烈火球菌（Pyrococcus furiosis）
<400> 95
Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys
20 25 30
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115 120 125
Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile
195 200 205
Lys Ala Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro
210 215 220
<210> 96
<211> 220
<212> PRT
<213> 掘越氏热球菌（Pyrococcus horikoshii）
<400> 96
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1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile Glu Arg
20 25 30
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115 120 125
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Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe
195 200 205
Arg Lys Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys
210 215 220
<210> 97
<211> 228
<212> PRT
<213> 柯达砂热球菌（Thermococcus kodakarensis）
<400> 97
Met Lys Ile Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
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115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Phe Arg Lys Val
225
<210> 98
<211> 224
<212> PRT
<213> 嗜热高温球菌（Thermococcus litoralis）
<400> 98
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Glu Leu Tyr Gly Glu Ile Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Thr
165 170 175
Arg Arg Phe Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Ala His Gly Glu Phe Pro Pro
180 185 190
Ile Val Arg Lys Ser Trp Lys Thr Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Leu
195 200 205
Lys Ala Lys Lys Thr Gln Pro Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Lys Pro
210 215 220
<210> 99
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 99
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<210> 100
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 100
aacaataacc agcggaccaa taaccgaacc acgaccagct tcatctgcac c 51
<210> 101
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 101
gtatccgcag cctctatcct ggcaaccgtt atccgtgacc gcgagatcga a 51
<210> 102
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 102
ttcgatctcg cggtcacgga taacggttgc caggatagag gctgcggata c 51
<210> 103
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 103
ccgccgatcg tgcgtcgtac ttggtatact gcaaagaaaa tcgaagaaaa a 51
<210> 104
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 104
tttttcttcg attttctttg cagtatacca agtacgacgc acgatcggcg g 51
<210> 105
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 105
ccgccgatcg tgcgtcgtac ttggaatact gcaaagaaaa tcgaagaaaa a 51
<210> 106
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 106
tttttcttcg attttctttg cagtattcca agtacgacgc acgatcggcg g 51
<210> 107
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 107
ccgccgatcg tgcgtcgtac ttggggtact gcaaagaaaa tcgaagaaaa a 51
<210> 108
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 108
tttttcttcg attttctttg cagtacccca agtacgacgc acgatcggcg g 51
<210> 109
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 109
ccgccgatcg tgcgtcgtac ttgggagact gcaaagaaaa tcgaagaaaa a 51
<210> 110
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 110
tttttcttcg attttctttg cagtctccca agtacgacgc acgatcggcg g 51
<210> 111
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 111
ccgccgatcg tgcgtcgtac ttgggttact gcaaagaaaa tcgaagaaaa a 51
<210> 112
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 112
tttttcttcg attttctttg cagtaaccca agtacgacgc acgatcggcg g 51
<210> 113
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 113
gacattgacg gtcgtaaggg cagcctgaac gaactggagg tagaaaactt c 51
<210> 114
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 114
gaagttttct acctccagtt cgttcaggct gcccttacga ccgtcaatgt c 51
<210> 115
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 115
cgtgcgcagc tgaccctgga caacttactg aagcgttttc gcaacaagct t 51
<210> 116
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 116
aagcttgttg cgaaaacgct tcagtaagtt gtccagggtc agctgcgcac g 51
<210> 117
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 117
gccggaagtt atttacattg attccgttga tgttaaagct gaacgtttcg ctg 53
<210> 118
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 118
cagcgaaacg ttcagcttta acatcaacgg aatcaatgta aataacttcc ggc 53
<210> 119
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 119
tgcaggtgca gatgaagctg gtcgttctcc agttattggt ccgctggtta ttgt 54
<210> 120
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 120
acaataacca gcggaccaat aactggagaa cgaccagctt catctgcacc tgca 54
<210> 121
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 121
gaaagttgca ggtgcagatg aagcttctcg tggtccagtt attggtccgc tgg 53
<210> 122
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 122
ccagcggacc aataactgga ccacgagaag cttcatctgc acctgcaact ttc 53
<210> 123
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 123
aaaagttatc cgtgaccgcg agatcaagaa gctgaaagcc gaatacggt 49
<210> 124
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 124
atcaccgtat tcggctttca gcttcttgat ctcgcggtca cggataactt tt 52
<210> 125
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 125
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
Leu Thr Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Ala Gln
35 40 45
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Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Met
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Ala Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
115 120 125
Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
130 135 140
Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
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Ala Glu Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr
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Lys Lys Trp Leu Glu Glu Trp Tyr Ser Lys His Gly Asn Phe Pro Pro
180 185 190
Ile Val Arg Arg Thr Trp Asp Thr Ala Lys Lys Ile Glu Glu Lys Phe
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Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
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<223> 核酸
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<220>
<223> 核酸
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<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
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<212> DNA
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<220>
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cgccaatcac taaggggccg atgactgatc cgcgcccggc ttcatcgacc cct 53
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<223> 核酸
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ggattccaag cagttaactc cgggccgtcg cgagaagttg ttcagtaaat tga 53
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<223> 核酸
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<220>
<223> 核酸
<400> 153
gccccagaag atttatgttg actcagttga cgttgacccc aagcgttttg cct 53
<210> 154
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 154
aggcaaaacg cttggggtca acgtcaactg agtcaacata aatcttctgg ggc 53
<210> 155
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 155
tggcatcgat gaagccggcc gtggcagcgt aattggtcca atggttatcg ctg 53
<210> 156
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 156
cagcgataac cattggacca attacgctgc cacggccggc ttcatcgatg cca 53
<210> 157
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 157
accggacgta atctatgctg atgcggttga cgttgacgag gaacgttttg ccc 53
<210> 158
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 158
gggcaaaacg ttcctcgtca acgtcaaccg catcagcata gattacgtcc ggt 53
<210> 159
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 159
aggtatcgat gaggccggac gcgggtcagt catcggaccg ctggtgattg cag 53
<210> 160
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 160
ctgcaatcac cagcggtccg atgactgacc cgcgtccggc ctcatcgata cct 53
<210> 161
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 161
ggaaatcgac gggcgcgatg gcaccctgaa tgagttagaa attgaaaatt tcg 53
<210> 162
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 162
cgaaattttc aatttctaac tcattcaggg tgccatcgcg cccgtcgatt tcc 53
<210> 163
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 163
acccgatgtt ttatacatcg acgccgttga cgttaaggag aagcgttttg ggg 53
<210> 164
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 164
ccccaaaacg cttctcctta acgtcaacgg cgtcgatgta taaaacatcg ggt 53
<210> 165
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸
<400> 165
Met Lys Val Ala Gly Ala Asp Glu Ala Gly Arg Gly Ser Val Ile Gly
1 5 10 15
Pro Leu Val Ile Val Ala Ala Val Val Glu Glu Asp Lys Ile Arg Ser
20 25 30
Leu Thr Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro Ala Arg
35 40 45
Arg Glu Lys Leu Phe Asp Glu Ile Val Lys Val Leu Asp Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Val Ile Val Ser Pro Gln Asp Ile Asp Gly Arg Lys Gly Ser Leu
65 70 75 80
Asn Glu Leu Glu Val Glu Asn Phe Val Lys Ala Leu Asn Ser Leu Lys
85 90 95
Val Lys Pro Glu Val Ile Tyr Ile Asp Ser Val Asp Val Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Phe Ala Glu Asn Ile Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Glu Ala Lys Val
115 120 125
Val Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala
130 135 140
Ser Ile Leu Ala Lys Val Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys
145 150 155 160
Ala Glu Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr
165 170 175
Lys Lys Trp Leu Glu Glu Trp Tyr Ser Lys His Gly Asn Phe Pro Pro
180 185 190
Ile Val Arg Arg Thr Trp Asp Thr Ala Lys Lys Ile Glu Glu Lys Phe
195 200 205
Lys Arg Ala Gln Leu Thr Leu Asp Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Asn
210 215 220

Claims (29)

1.一种用于对一个或多个目标核酸序列进行RNase H2-介导的裂解的方法，包括：
(a)提供包含一个或多个目标核酸序列的样品；
(b)对一个或多个核酸序列进行RNase H2-介导的裂解反应，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括：
(i)突变体深海热球菌(Pyrococcus abyssi)(P.a.)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:165；
(ii)突变体强烈火球菌(Pyrococcus furiosis)(P.fur)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ IDNO:130；
(iii)突变体掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)(P.hori)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133；
(iv)突变体柯达砂热球菌(Thermococcus kodakarensis)(T.kod)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136；或
(v)突变体嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列；
于是，裂解一个或多个目标核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应作为RNase H依赖性PCR(rhPCR)反应、环介导等温扩增(LAMP)反应或循环探针技术(CPT)的一部分进行。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应作为RNase H依赖性PCR(rhPCR)反应的一部分在数字PCR系统中进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述数字PCR系统是乳液液滴数字PCR(ddPCR)系统。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括突变体深海热球菌(P.a.)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ IDNO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:165。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括突变体强烈火球菌(P.fur)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括突变体柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括突变体嗜热高温球菌(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述样品包含一种或多种细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种细胞是动物细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种细胞是哺乳动物细胞。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞是体内细胞。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞是体外细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清、脑脊液、精液、尿液或羊水。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸是由合成产生的。
17.一种用于裂解一个或多个目标核酸序列的试剂盒，其包含：
(a)一种或多种试剂，用于对包含一个或多个目标核酸序列的样品在乳液中进行RNaseH2-介导的裂解反应，
(b)一个或多个选自以下的突变体RNase H2酶：
(i)突变体深海热球菌(P.a.)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:165；
(ii)突变体强烈火球菌(P.fur)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130；
(iii)突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133；
(iv)突变体柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136；和
(v)突变体嗜热高温球菌(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列，和
c.进行RNase H2-介导的裂解反应的说明书。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述RNase H2-介导的裂解反应作为RNase H2依赖性PCR(rhPCR)反应、环介导等温扩增(LAMP)反应或循环探针技术(CPT)的一部分进行。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，其包含突变体深海热球菌(P.a.)RNase H2酶，所述酶包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:165。
20.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，其包含突变体强烈火球菌(P.fur)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130。
21.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，其包含突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133。
22.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，其包含突变体柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136。
23.根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，其包含突变体嗜热高温球菌(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种试剂包括封闭剂、标记试剂、一个或多个引物、缓冲液、中期染色体涂片或其组合。
25.一种突变体RNase H2酶，其选自：
(a)突变体深海热球菌(P.a.)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、或SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQID NO:89、SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:165的氨基酸序列；
(b)突变体强烈火球菌(P.fur)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:130的氨基酸序列；
(c)突变体掘越氏热球菌(P.hori)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133的氨基酸序列；
(d)突变体柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:136的氨基酸序列；和
(e)突变体嗜热高温球菌(T.lit)RNase H2酶，其包含SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
26.一种突变体RNase H2酶，其包含以下之一：
(a)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、E48R、M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、E199Y、E199G和/或F220L；
(b)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、Q48R、M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、E199Y、E199G和/或F218L；
(c)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、A107V、P171G、S172I、D173E、K199Y、K199G、K199E和/或Y224L；或
(d)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列，除了以下氨基酸替代中的一个或多个：A9S、R11K、P13S、M80L、A107V、P171G、S172I、D173E、K199Y、K199G、K199E和/或F220L。
27.一种用于裂解一个或多个目标核酸序列的试剂盒，其包含：
(a)一种或多种试剂，用于对包含一个或多个目标核酸序列的样品在乳液中进行RNaseH2-介导的裂解反应，
(b)一个或多个根据权利要求26所述的突变体RNase H2酶，和
(c)进行所述RNase H-介导的裂解反应的说明书。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述RNase H2-介导的裂解反应作为RNase H依赖性PCR(rhPCR)反应、环介导等温扩增(LAMP)反应或循环探针技术(CPT)的一部分进行。
29.一种用于对一个或多个目标核酸序列进行RNase H2-介导的裂解的方法，包括：
(a)提供包含一个或多个目标核酸序列的样品；
(b)对一个或多个核酸序列进行RNase H2-介导的裂解反应，其中所述RNase H2-介导的裂解反应包括包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的柯达砂热球菌(T.kod)RNase H2酶，于是裂解一个或多个目标核酸序列。
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