CN116926070A - 一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开了一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16‑30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物F3及B3结合位置之间的区域；所述探针5’末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。基于上述引物探针组合，本发明同时公开了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒，该试剂盒中的探针不需要在反应过程中被酶切，也无需增加额外序列或试剂即可实现对新型冠状病毒N基因的检测，且特异性好，灵敏度高，操作简单，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用。
背景技术
环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi于2000年发明的一种恒温核酸扩增方法，其特点是针对目标序列的6个区域设计4-6条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在60-65℃反应温度下，60分钟内即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、检测效率高等特点，已在食品安全、微生物检验、临床诊断等方面得到了广泛应用。
LAMP是识别了目标序列上6-8个独立的基因片段，而PCR是利用两条引物特异地识别目的片段的两个区域，因此从理论上讲，LAMP应该比PCR具有更高的特异性。但事实上，已经有多个研究证实，因为引物数目较多，LAMP更容易遇到由非特异扩增而带来的假阳性问题。
将荧光标记的探针用于LAMP是提高特异性的最佳选择之一。最先使用Taqman探针，此时需要具有5’-3’外切活性的酶，而外切酶活性与链置换活性是矛盾的。目前商品化BST聚合酶均尽可能避免残留5’-3’外切活性，各别商品化BST聚合酶(如NEB BST 3.0)明确表示不具有5’-3’外切活性。如继续使用Taqman探针需要额外添加具有5’-3’外切活性的Taq酶。其次，通过添加其他酶实现对探针的切割，如加入高保真酶或RNase H进行探针切割并收集荧光，此类方法探针设计比较复杂，需要做相应的特别设计。如使用高保真酶时需要探针3’端的错配，添加RNase H时探针需要序列中插入RNA残基。此外，还可以通过探针的特别结构实现荧光信号的变化，如分子信标探针、“蝎子”探针及双探针等，此类探针因为需要形成特别的二级结构(例如发夹、环、互补双链等)，需要添加额外的序列，对探针设计的要求较高。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的环介导等温扩增技术中荧光探针设计复杂，且需增加额外的序列或试剂才能进行检测的问题，提供一种用于环介导等温扩增的引物探针组合及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16-30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物F3及B3结合位置之间的区域；所述探针5’末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端的碱基或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
优选地，所述探针序列位于目标核酸序列上环引物LF及LB结合位置之间的区域。
优选地，所述探针3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
本发明还提供了上述引物探针组合在新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒制备中的应用。
基于上述应用，本发明提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括根据新型冠状病毒N基因设计的新型冠状病毒环介导等温扩增检测专用引物和探针：
外引物CovN-F3：5’-AGATCACATTGGCACCCG-3’；
外引物CovN-B3：5’-CCATTGCCAGCCATTCTAGC-3’；
内引物CovN-FIP：5’-TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCTTTTCAATGCTGCAATCGTGCTAC-3’；
内引物CovN-BIP：5’-GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTTTTCCTACTGCTGCCTGGAGTT-3’；
环引物CovN-LF：5’-TGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGT-3’；
环引物CovN-LB：5’-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTC-3’；
探针CovN-LBp：5’-BHQ1-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTT(FAM)C-3’，所述探针CovN-LBp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
优选地，所述试剂盒还包括根据内参基因人类β-ACTIN设计的引物和探针：
外引物AB-F3：5’-TGGTGGGCATGGGTCA-3’；
外引物AB-B3：5’-TGGCCTTGGGGTTCAGG-3’；
内引物AB-FIP：5’-GGTACTTCAGGGTGAGGATGCCttttGAAGGATTCCTATGTGGGCG-3’；
内引物AB-BIP：5’-CCAACTGGGACGACATGGAGAAttttAGCACGGGGTGCTCCT-3’；
环引物AB-LF：5’-TCTTGCTCTGGGCCTCGT-3’；
环引物AB-LB：5’-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3’；
探针AB-LFp：5’-BHQ3-TCTTGCTCTGGGCCT(CY5)CGT-3’，所述探针AB-LFp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
优选地，所述试剂盒中还包括BST聚合酶大片段、AMV反转录酶及LAMP反应液。
优选地，所述LAMP反应液浓度为终浓度的2倍，所述LAMP反应液包括：Tris-HCl40mM、(NH4)2SO4 20mM、KCl 50mM、0.2％ Tween-20、MgSO4 10～22mM、dNTP 2.0～3.6mM。
优选地，所述LAMP反应液中MgSO4的终浓度为7mM。
优选地，所述LAMP反应液中dNTP的终浓度为1.4mM。
如图1所示，本发明利用非酶切线性探针结合LAMP扩增方法相结合产生的荧光信号变化实现检测目标核酸序列，其方法原理的主要过程如下：
1)针对目标核酸序列设计特异性LAMP扩增引物和荧光探针：在荧光探针5’末端的碱基上标记淬灭基团；在探针3'末端的碱基或序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团，更优的选择是距3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
2)将引物探针同时添加至反应体系。反应初始，体系中绝大部分探针处于游离状态。因为淬灭基团的荧光淬灭效果，游离状态的探针几乎不发出荧光信号，此时仪器检测到的信号属荧光基线。
3)随着反应进行，产生大量产物模板。探针与模板结合后，双链DNA结构可显著抵消淬灭基团对荧光的淬灭作用，此时的荧光基团在接受激发波长的紫外光的情况下可释放一定的荧光信号，该信号强度明显高于荧光基线。此时是3'末端标记荧光基团的探针发挥作用的主要原理。
4)对于非3’末端标记荧光基团的探针，更优的选择是距3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团，因为3’末端游离，可在BST聚合酶的作用下引导双链的合成。随着产物长度的增加，双链DNA结构对淬灭基团的抵消作用更加明显，荧光基团发出荧光信号的强度更高。
本发明所具有的有益效果：
一)本发明在环介导等温扩增的基础上，通过引入一条特殊的线性荧光探针就可实现目标序列的特异性检测，该线性荧光探针为基于特异性等温扩增引物设计的非酶切线性序列，其设计简单灵活度高，该探针不需要在反应过程中被酶切，也不需要增加额外的序列以形成复杂的二级结构，使用时也不需要添加额外的试剂。通过探针在游离状态与结合状态间荧光强度的差异，实现目标核酸序列的检测；
二)本发明中建立了新型冠状病毒N基因LAMP检测体系，该体系无需增加额外序列或试剂即可实现新型冠状病毒N基因的检测，特异性好，灵敏度高，操作简单，成本低廉。
附图说明
图1为本发明检测目标核酸序列的原理图；
图2为新型冠状病毒N基因LAMP引物及其探针位置关系；
图3为新型冠状病毒N基因上不同位置设计探针的检测结果；
图4为新型冠状病毒N基因探针上不同荧光标记位置的检测结果；
图5为新冠病毒N基因及内参基因的检出时间与反应温度的变化曲线图；
图6为新冠病毒N基因及内参基因的检出时间与反应体系中Mg离子浓度的变化曲线图；
图7为新冠病毒N基因及内参基因的检出时间与反应体系中dNTP浓度的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
Bst DNA聚合酶大片段购于纽英伦生物技术有限公司；AMV反转录酶购于上海普洛麦格生物产品有限公司；dNTP购于上海生物工程技术服务有限公司；TranscriptAid T7高产率转录试剂盒购于赛默飞世尔科技公司；RNA纯化试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1新型冠状病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立
1.环介导等温扩增引物及探针的设计
设计原则：引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；探针为非酶切线性荧光探针，探针片段长度为16-30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物F3及B3结合位置之间的区域或探针序列位于目标核酸序列上环引物LF及LB结合位置之间的区域；探针5’末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端的碱基或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团或探针3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
在上述引物和探针的设计原则基础上，使用发表在NCBI上的新型冠状病毒N基因相关核酸序列(登录号：NC_045512)设计检测新型冠状病毒(新冠病毒)的引物及探针，引物探针序列具体见表1。
表1环介导等温扩增检测新型冠状病毒的引物及探针序列
如表1所示，本实施例中根据各LAMP引物均对应设计了探针，本实施例中探针的荧光标记方式均为：5’末端的碱基上标记淬灭基团；距3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。其中，引物CovN-F3与探针CovN-F3p核酸序列相同，序列号同为：SEQ ID NO：1；引物CovN-B3与探针CovN-B3p核酸序列相同，序列号同为：SEQ ID NO：2；引物CovN-LF与探针CovN-LFp核酸序列相同，序列号同为：SEQ ID NO：5；引物CovN-LB与探针CovN-LBp核酸序列相同，序列号同为：SEQ ID NO：6。此外，脱离下游环引物(LBp)的位点设计了探针CovN-LBB1P。图2显示了各引物、探针与模板对应的位置关系。
2.阳性模板的制备
从NCBI上下载新型冠状病毒N基因的序列片段(登录号：NC_045512)，委托上海生物工程技术服务有限公司制备含有新型冠状病毒N基因的质粒，该质粒在新冠病毒N基因上游带有T7启动子。收到质粒后使用TranscriptAid T7高产率转录试剂盒转录生成带有新冠病毒N基因的单链RNA，再用RNA纯化试剂盒获得高浓度新冠病毒N基因RNA溶液。将RNA溶液用无核酸酶水稀释至1.0×106拷贝/μL。以此作为本实例中阳性模板。
3.配置反应体系
本实施例中的新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒包括：如表1所示的针对新型冠状病毒N基因设计的特异性等温扩增引物和任一条探针(CovN-F3p、CovN-B3p、CovN-F2p、CovN-B2p、CovN-LFp或CovN-LBp)、BST聚合酶大片段、AMV反转录酶及LAMP反应液；其中，LAMP反应液浓度为终浓度的2倍，LAMP反应液包括：Tris-HCl 40mM、(NH4)2SO4 20mM、KCl50mM、0.2％Tween-20、MgSO4 14mM、dNTP 2.8mM。
根据试剂盒配置LAMP反应体系，反应体系终体积为25μL，其组成与终浓度如表2所示：
表2 LAMP反应体系
| 试剂组成 | 终浓度 |
| Tris-HCl(pH 8.8) | 20mM |
| KCl | 25mM |
| (NH4)2SO4 | 10mM |
| Tween20 | 0.1％ |
| MgSO4 | 7mM |
| dNTP | 1.4mM |
| CovN-F3 | 0.2mM |
| CovN-B3 | 0.2mM |
| CovN-FIP | 1.6mM |
| CovN-BIP | 1.6mM |
| CovN-LF | 0.8mM |
| CovN-LB | 0.8mM |
| 探针 | 0.1mM |
| BST大片段 | 8U |
| AMV反转录酶 | 10U |
| 阳性模板 | 2μL |
| 无核酸酶水 | 加至25μL |
4.LAMP反应程序如表3所示：
表3 LAMP反应程序
| 序号 | 温度 | 时间 | 荧光采集 | 循环数 |
| 1 | 65℃ | 30s | 采集 | 60 |
| 2 | 85℃ | 5min | 1 |
5.实验结果
如图3所示，基于本实施例建立的新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒和检测方法，在LAMP引物对应区域设计相应探针(如表1所示)，均可实现目标核酸序列(本实施例中的目标核酸序列为新型冠状病毒N基因)的准确检测。由于探针序列差异以及终体系中浓度的差异，不同的探针在检出时间以及最终荧光强度上表现出差异。在本实施例中，脱离引物区域设计的探针CovN-LBB1p也能正常检测，说明目标核酸序列上F3及B3结合位置之间的区域均可用于设计探针。但是图3显示，根据下游环引物(CovN-LB)设计的探针(CovN-LBp)检测效果最优，说明选择环引物结合区域的序列设计探针效果更好。
实施例2新型冠状病毒N基因探针上不同荧光标记位置的检测效果
在实施例1的基础上，根据下游环引物CovN-LB的序列，设计探针(CovN-LBp、CovN-LBT2p、CovN-LBT4p和CovN-LB末p)，探针的碱基序列与下游环引物CovN-LB的碱基序列相同，如SEQ ID NO:6所示：CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTC。本实施例在探针序列的5’末端的碱基上标记淬灭基团(BHQ1)，在探针序列上的四个不同位置标记荧光基团(FAM)，从而得到四种不同荧光标记的探针：标记于靠近5’端的探针CovN-LBT2p，标记于探针中部的探针CovN-LBT4p，标记靠近3’端而非末端的探针CovN-LBp，以及标记于3’末端的探针CovN-LB末p，如表4所示。
表4引物及根据CovN-LB设计的荧光基团标记于不同位置的四种探针序列
本实施例中新型冠状病毒阳性模板的制备、配置LAMP反应体系、LAMP反应程序均与实施例1相同。
实验结果如图4所示，本实施例表4中的四种探针(5’末端的碱基上标记淬灭基团；3'末端或序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团)均可以有效检测目标核酸序列新型冠状病毒。四种探针在检出时间以及最终荧光强度上表现出差异，其中，在距3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团的探针CovN-LBp效果最好。
实施例3新冠病毒N基因及内参基因的检出时间与反应温度的关系
1.本实施例的引物和探针序列如表5所示，包括新冠病毒N基因的引物、探针和内参基因β-ACTIN的引物和探针。
根据内参基因β-ACTIN的引物AB-LF的序列设计探针AB-LFp，两者核酸序列相同，序列号同为SEQ ID NO：11。探针AB-LFp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
表5本实施例的引物和探针序列
2.阳性模板的制备
从NCBI上下载新型冠状病毒N基因(登录号：NC_045512)及人类β-ACTIN基因(登录号：NM_001101.5)的序列片段，委托上海生物工程技术服务有限公司制备含有新型冠状病毒N基因及人类β-ACTIN基因的质粒，质粒在插入基因的上游含有T7启动子。收到质粒后使用TranscriptAid T7高产率转录试剂盒转录生成带有插入目的基因的单链RNA，再用RNA纯化试剂盒获得高浓度新冠病毒N基因RNA溶液及内参基因RNA溶液。将RNA溶液用无核酸酶水稀释至1.0×106拷贝/μL。以此作为本实例中阳性模板。
3.配置反应体系
本实施例中的新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒包括：针对新型冠状病毒N基因和内参基因β-ACTIN设计的特异性等温扩增引物和探针(本实施例步骤1中表5所示)、BST聚合酶大片段、AMV反转录酶及LAMP反应液；其中，LAMP反应液浓度为终浓度的2倍，包括：Tris-HCl 40mM、(NH4)2SO4 20mM、KCl 50mM、0.2％Tween-20、MgSO4 14mM、dNTP 2.8mM。
LAMP反应体系终体积为25μL，其组成与终浓度如表6所示：
表6 LAMP反应体系
| 试剂组成 | 终浓度 |
| Tris-HCl(pH 8.8) | 20mM |
| KCl | 25mM |
| (NH4)2SO4 | 10mM |
| Tween20 | 0.1％ |
| MgSO4 | 7mM |
| dNTP | 1.4mM |
| CovN-F3 | 0.2mM |
| CovN-B3 | 0.2mM |
| CovN-FIP | 1.6mM |
| CovN-BIP | 1.6mM |
| CovN-LF | 0.8mM |
| CovN-LB | 0.8mM |
| CovN-LBp | 0.1mM |
| AB-F3 | 0.2mM |
| AB-B3 | 0.2mM |
| AB-FIP | 1.6mM |
| AB-BIP | 1.6mM |
| AB-LF | 0.8mM |
| AB-LB | 0.8mM |
| AB-LFp | 0.1mM |
| BST大片段 | 8U |
| AMV反转录酶 | 10U |
| 阳性模板 | 2μL |
| 无核酸酶水 | 加至25μL |
4.LAMP反应程序如表7所示：
表7 LAMP反应程序
5.实验结果
如图5所示，本实施例中，表7中的各反应温度下试剂盒均可检测新冠病毒N基因，最适温度范围是65～67.5℃；各反应温度下试剂盒均可检测内参基因，最适温度范围是62.5～65℃。综合考虑两个基因的检测效果，本实施例中反应温度65℃为最适温度。
实施例4新冠病毒N基因及内参基因的检出时间与反应体系中Mg离子浓度关系
本实施例中的检测方法与实施例3相同，区别在于：配置LAMP反应体系时，Mg离子在体系中的终浓度分别取5、7、9、11mM；LAMP反应程序中反应温度为65℃。实验结果如图6所示，试剂盒检测新冠病毒N基因及内参基因时，Mg离子浓度与阳性检出时间的关系变化趋势一致，Mg离子浓度为5～11mM均可检测新冠病毒N基因及内参基因，其中最适浓度均为7mM。
实施例5新冠病毒N基因及内参基因的检出时间与反应体系中dNTP浓度的关系
本实施例中的检测方法与实施例3相同，区别在于：配置LAMP反应体系时，dNTP在体系中的终浓度分别取1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mM；LAMP反应程序中反应温度为65℃。实验结果如图7所示，在本实施例中，各浓度dNTP的试剂盒均可检测新冠病毒N基因及内参基因。其中，检测新冠病毒N基因的最适dNTP浓度范围是1.0～1.4mM，在此范围内检出时间随着dNTP浓度升高有轻微提前，但区别并不明显。而检测内参基因时，dNTP最适浓度明显为1.4mM。综合考虑两个基因的检测效果，1.4mM为dNTP的最适终浓度，其检测效果最好。
实施例6新冠病毒检测试剂盒检测新冠病毒N基因RNA的灵敏度测试
本实施例中的检测方法与实施例3相同，区别在于：本实施例的LAMP反应程序中反应温度为65℃；本实施例阳性模板的制备方法为：1)从NCBI上下载新型冠状病毒N基因(登录号：NC_045512)及人类β-ACTIN基因(登录号：NM_001101.5)的序列片段，委托上海生物工程技术服务有限公司制备含有新型冠状病毒N基因及人类β-ACTIN基因的质粒，质粒在插入基因的上游含有T7启动子。收到质粒后使用TranscriptAid T7高产率转录试剂盒转录生成带有插入目的基因的单链RNA，再用RNA纯化试剂盒获得高浓度新冠病毒N基因RNA溶液及内参基因RNA溶液。2)将新冠病毒N基因RNA溶液用无核酸酶水比稀释至10000、1000、100以及10拷贝/μL。3)为模拟真实样本中人类β-ACTIN基因作为内源性核酸稳定存在的特性，所有阳性模板中均添加浓度10000拷贝/μL的内参基因RNA。所以，本实施例中，终体系新冠病毒N基因模板的浓度包括20000、2000、200及20拷贝/反应；而内参基因模板的浓度均为20000拷贝/反应。
实验结果如表8所示，本实施例中，人类β-ACTIN基因可稳定检出；而对新冠病毒N基因RNA的检测，最低可实现20拷贝/反应的100％检出。本实例结果表明，本发明所述检测试剂盒，可同时检测样本中新冠病毒N基因目标核酸序列及内参基因目标核酸序列，两者无相互干扰，且灵敏度较高。
表8新冠病毒N基因及内参基因检测灵敏度
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于环介导等温扩增的引物探针组合，其特征在于，所述引物为针对目标核酸序列设计的特异性等温扩增引物，所述引物包括一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP，一对环引物LF、LB；所述探针为非酶切线性荧光探针，所述探针片段长度为16-30bp，探针序列位于目标核酸序列上外引物F3及B3结合位置之间的区域；所述探针5’末端的碱基上标记淬灭基团，3'末端的碱基或探针序列中的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针序列位于目标核酸序列上环引物LF及LB结合位置之间的区域。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
4.如权利要求1至3任一项所述的引物探针组合在新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒制备中的应用。
5.一种新型冠状病毒环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括根据新型冠状病毒N基因设计的新型冠状病毒环介导等温扩增检测专用引物和探针：
外引物CovN-F3：5’-AGATCACATTGGCACCCG-3’；
外引物CovN-B3：5’-CCATTGCCAGCCATTCTAGC-3’；
内引物CovN-FIP：5’-TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCTTTTCAATGCTGC AATCGTGCTAC-3’；
内引物CovN-BIP：5’-GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTTTTCCTACTGCTG CCTGGAGTT-3’；
环引物CovN-LF：5’-TGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGT-3’；
环引物CovN-LB：5’-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTC-3’；
探针CovN-LBp：5’-BHQ1-CCTCATCACGTAGTCGCAACAGTT(FAM)C-3’，所述探针CovN-LBp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括根据内参基因人类β-ACTIN设计的引物和探针：
外引物AB-F3：5’-TGGTGGGCATGGGTCA-3’；
外引物AB-B3：5’-TGGCCTTGGGGTTCAGG-3’；
内引物AB-FIP：5’-GGTACTTCAGGGTGAGGATGCCttttGAAGGATTCCT ATGTGGGCG-3’；
内引物AB-BIP：5’-CCAACTGGGACGACATGGAGAAttttAGCACGGGGT GCTCCT-3’；
环引物AB-LF：5’-TCTTGCTCTGGGCCTCGT-3’；
环引物AB-LB：5’-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3’；
探针AB-LFp：5’-BHQ3-TCTTGCTCTGGGCCT(CY5)CGT-3’，所述探针AB-LFp在序列5’端标记淬灭基团，3’端最近的非末端的胸腺嘧啶碱基标记荧光基团。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括BST聚合酶大片段、AMV反转录酶及LAMP反应液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液浓度为终浓度的2倍，所述LAMP反应液包括：Tris-HCl 40mM、(NH4)2SO4 20mM、KCl 50mM、0.2％Tween-20、MgSO4 10～22mM、dNTP 2.0～3.6mM。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中MgSO4的终浓度为7mM。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中dNTP的终浓度为1.4mM。
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