CN114075595A - 甲基化检测组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甲基化检测组合物、试剂盒及方法。具体地,本发明提供用于核酸扩增的寡核苷酸接头和捕获寡核苷酸及其使用方法和用途,所述寡核苷酸接头包含第一结合序列和第二结合序列,所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列相同的序列,所述第二结合序列与靶标分子互补,所述捕获寡核苷酸包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列。本发明产品和方法可实现特异性好、灵敏度高的DNA甲基化检测。
Description
技术领域
本发明涉及甲基化检测组合物、试剂盒及方法。
背景技术
血浆中含有游离DNA(cfDNA)。相比于组织活检,血浆样本可多次取样、无侵入性。然而,cfDNA在体液中的含量极少,健康人血浆cfDNA含量仅约5-10ng/ml。因此,cfDNA甲基化检测最大的技术难点在于如何利用微量的cfDNA样本对极少量的甲基化异常基因进行检测。
目前,基于重亚硫酸盐转化的方法是cfDNA甲基化检测的主流选择。其原理为重亚硫酸盐处理DNA,胞嘧啶会脱氨基转变成尿嘧啶,5甲基胞嘧啶由于其携带的甲基基团抑制了重亚硫酸盐的作用而保持原来的序列不变,本质在于利用重亚硫酸盐处理使胞嘧啶上修饰基团的不同转变成碱基序列的不同,后续可通过甲基化特异性PCR、甲基化芯片或测序来检测cfDNA甲基化位点。
基于重亚硫酸盐转化的方法存在许多不足:1、重亚硫酸盐转化的DNA样本需要经受严苛的化学处理过程,例如低pH、高温、高浓度的重亚硫酸盐等,这些条件会导致DNA大量降解,降解高达90%,模板完整性降低,因此所需的cfDNA起始用量较大;2、重亚硫酸盐处理不彻底会导致未甲基化的胞嘧啶转化不完全,出现假阳性的结果,从而对DNA甲基化情况产生错误的评估;3、未甲基化的胞嘧啶约占人基因组总胞嘧啶数的95%,将未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶则会严重降低序列复杂性,在对多种靶标分子进行同时检测时,引物设计更困难,可能导致检测准确性降低,以及增加检测成本;4、重亚硫酸盐转化处理时间长、后续需要反复洗涤纯化、操作繁琐,耗费大量的人力和时间。
本领域需要一种无需重亚硫酸盐转化、无需大量起始样本、操作简单快捷、特异性好、灵敏度高的甲基化检测体系和方法,实现对微量cfDNA的甲基化检测。
发明内容
发明人开发了一种利用位点特异性切割核酸酶和基于通用引物扩增的核酸检测体系,可对微量cfDNA进行甲基化检测,具有无需重亚硫酸盐转化、所需起始样本量少、操作简单快捷、特异性好、灵敏度高的优点。
本发明第一方面提供一种用于核酸扩增的寡核苷酸接头,从5’到3’包含第一结合序列和第二结合序列,所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列至少部分相同的序列,所述第二结合序列与靶标分子互补。
优选地,所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰。
在一个或多个实施方案中,所述核酸延伸阻断修饰位于第二结合序列的3’端。
在一个或多个实施方案中,所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种:Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。
在一个或多个实施方案中,所述第二结合序列与靶标分子的非5’末端序列互补。
在一个或多个实施方案中,所述第二结合序列与靶标分子的3’末端序列互补。
在一个或多个实施方案中,所述第二结合序列可具有核酸类似物修饰;优选地,所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA。
在一个或多个实施方案中,所述靶标分子是3’端和5’端序列明确的靶标分子。优选地,所述靶标分子是位点特异性切割核酸酶的酶切产物,例如是两端均因位点特异性切割核酸酶酶切而具有明确序列的靶标分子。
在一个或多个实施方案中,所述位点特异性切割核酸酶是核酸外切酶和/或核酸内切酶。
在一个或多个实施方案中,所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶或错配修复酶中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述甲基化依赖型限制性内切酶包含选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
本发明第二方面还提供一种捕获寡核苷酸,所述捕获寡核苷酸从5’到3’依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列,其中,所述折叠序列与靶标分子的5’末端序列至少部分相同,和/或,所述结合捕获序列与本文所述的寡核苷酸接头的非3’末端序列至少部分相同。
在一个或多个实施方案中,所述捕获寡核苷酸在折叠序列和结合捕获序列之间还包含第二通用序列。
在一个或多个实施方案中,所述结合捕获序列与寡核苷酸接头的第一结合序列至少部分相同。
在一个或多个实施方案中,所述捕获寡核苷酸具有核酸类似物修饰。
在一个或多个实施方案中,所述核酸类似物修饰位于第一通用序列、折叠序列、或结合捕获序列。
在一个或多个实施方案中,所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥(methylene bridge)RNA、2'-甲氧基修饰碱基(2'-O-Methyl Base)、2'-O-甲基(Methyl)RNA、脱氧尿嘧啶核苷(deoxyuridine dU)或2'-氟代(Fluoro)RNA。
在一个或多个实施方案中,所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰。
在一个或多个实施方案中,所述核酸延伸阻断修饰位于折叠序列的3’端。
在一个或多个实施方案中,所述核酸延伸阻断修饰位于第二通用序列的5’端。
在一个或多个实施方案中,所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种:Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。
本发明第三方面还提供一种核酸检测组合物,所述组合物包括本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸和本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头。
在一个或多个实施方案中,所述组合物还包括位点特异性切割核酸酶;优选核酸外切酶和/或核酸内切酶。
在一个或多个实施方案中,所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR-Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述甲基化依赖型限制性内切酶选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
在一个或多个实施方案中,所述组合物还包括:
(1)通用引物,所述通用引物(I)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同,或者(II)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与(a)或(b)相同:(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列,(b)(a)的部分序列;更优选地,通用引物从5’到3’包括以下序列:第二通用序列或其3’端部分序列和/或第一结合序列或其5’端部分序列;和/或
(2)特异引物,其包含与第一通用序列相同或部分相同的序列;优选地,特异引物3’端序列与第一通用序列或其部分序列相同,或与折叠序列或其部分序列相同。
在一个或多个实施方案中,所述组合物还包括探针。
在一个或多个实施方案中,所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。
在一个或多个实施方案中,所述荧光基团标记在检测探针的5’端;所述淬灭基团标记在检测探针的3’端。
在一个或多个实施方案中,所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种或多种;所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述组合物还包括DNA聚合酶、dNTP或Mg2+中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述组合物还包括酶切缓冲液和/或PCR缓冲液。
本发明还提供一种核酸检测试剂盒,所述试剂盒包括:
(1)本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸和本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头,或
(2)本文任一实施方案所述的组合物。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括位点特异性切割核酸酶;优选核酸外切酶和/或核酸内切酶。
在一个或多个实施方案中,所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR-Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括:
(1)通用引物,所述通用引物(I)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同,或者(II)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与(a)或(b)相同:(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列,(b)(a)的部分序列;和/或
(2)特异引物,其包含与第一通用序列相同或部分相同的序列;优选地,其从5’到3’包括以下序列:第一通用序列或其3’端部分序列和折叠序列或其5’端部分序列。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括探针。
在一个或多个实施方案中,所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。
在一个或多个实施方案中,所述荧光基团标记在检测探针的5’端;所述淬灭基团标记在检测探针的3’端。
在一个或多个实施方案中,所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种或多种;所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP或Mg2+中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括酶切缓冲液和/或PCR缓冲液。
本发明还提供一种核酸检测体系,其特征在于,所述体系包括1~100nM本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸、至少1nM(例如1~100nM,优选1-20nM)本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头、1~5U(优选1-2U)Taq聚合酶、50~500μM(优选100~300μM)dNTP、1~10mM(优选1~5mM)MgCl2和PCR缓冲液;
在一个或多个实施方案中,所述体系还包括100~800nM(优选100~400nM)通用引物。
在一个或多个实施方案中,所述体系还包括100~800nM(优选100~400nM)特异引物。
在一个或多个实施方案中,所述体系还包括100~600nM(优选100~300nM)探针。
在一个或多个实施方案中,所述体系还包括至少1U(例如,1~5U,优选1~2U)USER酶。
在一个或多个实施方案中,所述通用引物、特异引物、探针如本文第三方面所述。
在一个或多个实施方案中,所述体系还包括1-20U(优选5~15U)位点特异性切割核酸酶;优选核酸外切酶和/或核酸内切酶。
在一个或多个实施方案中,所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR-Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
本发明第四方面还提供一种核酸扩增或检测方法,包括采用寡核苷酸接头延伸靶标分子、和采用捕获寡核苷酸结合经延伸的靶标分子的步骤。
在一个或多个实施方案中,所述方法包括:
(1)3’端和5’端序列明确的靶标分子与寡核苷酸接头的第二结合序列互补结合,
(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸,在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头互补的序列,获得延伸的靶标分子,
(3)延伸的靶标分子与捕获寡核苷酸的结合捕获序列互补结合,
(4)捕获寡核苷酸以延伸的靶标分子为模板进行延伸反应,在捕获寡核苷酸3’末端添加与延伸的靶标分子互补的序列,获得延伸的捕获寡核苷酸,
(5)延伸的捕获寡核苷酸通过延伸的序列与分子内的折叠序列结合,形成半发夹结构产物;
(6)半发夹结构产物进行延伸反应,在3’末端添加与分子内的第一通用序列互补的核苷酸,形成完整的发夹结构产物。
在一个或多个实施方案中,所述寡核苷酸接头如本文任一实施方案所述,所述捕获寡核苷酸如本文任一实施方案所述。
在一个或多个实施方案中,步骤(1)和(2)是:
(1)3’端和5’端序列明确的靶标分子与寡核苷酸接头的第二结合序列互补结合,
(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸,在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头的第一结合序列互补的序列,获得延伸的靶标分子。
在一个或多个实施方案中,3’端和5’端序列明确的靶标分子是位点特异性切割核酸酶的DNA酶切产物,优选是两端均因位点特异性切割核酸酶酶切而具有明确序列的靶标分子。所述DNA包括cfDNA。
在一个或多个实施方案中,所述位点特异性切割核酸酶是核酸外切酶和/或核酸内切酶。
在一个或多个实施方案中,所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR-Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。
在一个或多个实施方案中,所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
在一个或多个实施方案中,所述方法还包括基于特异引物的扩增和/或基于通用引物的扩增。
在一个或多个实施方案中,所述方法还包括:
(7)使用具有尿嘧啶切割功能的酶(例如USER酶)处理完整的发夹结构产物,然后,采用通用引物和/或特异引物进行扩增,得到扩增产物,所述扩增任选还包含使用探针;或者
(7)以完整的发夹结构产物作为模板,采用通用引物和/或特异引物进行扩增,得到扩增产物,所述扩增任选还包含使用探针。
在一个或多个实施方案中,所述通用引物(I)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同,或者(II)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与(a)或(b)相同:(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列,(b)(a)的部分序列。
在一个或多个实施方案中,所述特异引物包含与第一通用序列相同或部分相同的序列;优选地,其从5’到3’包括以下序列:第一通用序列或其3’端部分序列和折叠序列或其5’端部分序列。
在一个或多个实施方案中,所述方法还任选包括:(8)检测探针信号。
本发明还提供本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、组合物、试剂盒和/或体系在制备DNA甲基化检测产品中的应用。
在一个或多个实施方案中,所述产品选自试剂盒、装置、计算机可读介质。
本发明还提供一种能形成茎环结构的核酸分子,所述核酸分子在茎序列和/或环序列中具有脱氧尿嘧啶核苷。
在一个或多个实施方案中,所述能形成茎环结构的核酸分子是本文第四方面的方法中所形成的发夹结构产物。
本发明还提供一种破坏核酸分子的茎环结构的方法,所述核酸分子如本文任一实施方案所述,所述方法包括将所述核酸分子在尿嘧啶被切割的条件下与具有尿嘧啶切割功能的酶(例如USER酶)孵育。
附图说明
图1:本发明一实施方案的甲基化检测原理图。
图2:人源Septine 9基因的超声碎片DNA的甲基化检测结果图。
图3:使用不同的寡核苷酸接头检测基因甲基化的结果图。A-B分别表示使用直链寡核苷酸接头和自折叠寡核苷酸接头获得的检测结果。
图4:使用不同结构的捕获寡核苷酸检测基因甲基化的结果图。A-B分别表示使用自折叠的捕获寡核苷酸和脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸获得的检测结果。
图5:使用特异引物进行线性延伸反应的检测结果图。A-B分别表示线性延伸反应中不使用和使用特异引物获得的检测结果。
图6:仅对靶标分子5’端酶切的扩增方案与实施例1的扩增效率对比结果图。
图7:仅对靶标分子5’端酶切的扩增方案与本文方法在假阳性方面的对比结果图。A-D分别表示仅对靶标分子5’端酶切的扩增方案和本文方法在不同含量的非甲基化DNA中获得的检测结果。
图8:含锁核酸修饰的寡核苷酸接头的检测结果。
图9:使用无第二通用序列的捕获寡核苷酸的检测结果。
图10:人源SHOX2基因的甲基化检测结果图。
具体实施方式
应理解,在本发明范围中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成优选的技术方案。
本发明使用寡核苷酸接头辅助捕获寡核苷酸对靶标分子的捕获。首先,寡核苷酸接头延伸靶标分子;然后采用捕获寡核苷酸结合延伸靶标分子并启动特异性线性扩增,得到含有可被通用引物引发指数扩增的中间序列;之后,对由线性扩增得到的中间序列,实施通用引物和/或特异引物引导的指数扩增。
本文的寡核苷酸接头从5’到3’包含(优选依次包含)第一结合序列和第二结合序列,所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列至少部分相同的序列,所述第二结合序列与靶标分子互补,优选地,所述第二结合序列与靶标分子的3’末端序列互补。
本文所述互补包括完全互补和部分互补。通常,对于需要延伸的核酸链,其3’端序列在对应的互补链上至少90%互补,例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、或完全互补,只要不影响核酸链延伸即可。例如,在靶标分子与寡核苷酸接头的第二结合序列的互补中,靶标分子是需要延伸的核酸链,其3’末端序列在第二结合序列上至少90%互补或完全互补(即靶标分子的3’末端核酸在接头上具有配对碱基),而第二结合序列在靶标分子的3’末端序列上可以是不互补或部分互补或完全互补(即接头的3’末端核酸在靶标分子上可具有或不具有配对碱基)。
3’端和5’端序列信息明确的靶标分子与寡核苷酸接头的结合序列互补结合,随后以寡核苷酸接头为模板延伸,在靶标分子的3’端添加寡核苷酸接头的互补链(例如第一结合序列的互补链)。如图1所示。为了使接头本身不发生延伸,所述寡核苷酸接头还可选包括核酸延伸阻断修饰。所述核酸延伸阻断修饰通常位于第二结合序列的3’端。所述核酸延伸阻断修饰有能阻断DNA聚合酶延伸的物质,使得寡核苷酸接头不会向3’端延伸,从而形成靶标分子的互补链影响后续捕获寡核苷酸的结合和延伸。所述能阻断DNA聚合酶延伸的修饰包括:Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。本发明实施例中,具有所述核酸延伸修饰的寡核苷酸接头在第二结合序列的3’端具有巯基修饰。
本发明中,第一结合序列可以是人工序列。因此,在针对不同靶标分子进行检测时,只需要根据靶标分子设计第二结合序列,而第一结合序列可保持不变。在一些实施方案中,为了降低非特异性扩增,根据不同靶标分子设计第一结合序列和第二结合序列。
捕获寡核苷酸从5’到3’依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列,以及任选地位于折叠序列和结合捕获序列之间的第二通用序列。捕获寡核苷酸首先通过结合捕获序列(与寡核苷酸接头的第一结合序列相同或部分相同)捕获上述经寡核苷酸接头延伸的靶标分子,随后以靶标分子为模板进行延伸反应,在捕获寡核苷酸3’端添加靶标分子的互补链,得到的延长的捕获寡核苷酸由于分子内部存在至少部分碱基互补配对的折叠序列(与靶标分子的5’末端序列至少部分相同)及其延长的3’端序列,诱发分子内的自我折叠,并在聚合酶的作用下进一步延伸,在3’端添加第一通用序列的互补链,最终得到具有完整发夹式结构产物,可以采用通用引物和/或靶标分子特异性引物进行PCR扩增检测。如图1所示。延伸序列与折叠序列可以是完全互补配对,也可以是不完全互补配对。
本发明中,第一通用序列、第二通用序列和结合捕获序列可以是人工合成序列。因此,在针对不同靶标分子进行检测时,只需要根据靶标分子设计捕获寡核苷酸的折叠序列,而第一通用序列、第二通用序列和结合捕获序列可保持不变。在一些实施方案中,为了降低非特异性扩增,根据不同靶标分子设计捕获寡核苷酸的折叠序列和结合捕获序列,而第一通用序列和第二通用序列保持不变。
为进一步提高检测体系的扩增效率以及避免引物自身或引物之间引起的非特异性扩增,可以在寡核苷酸接头的任意区域(优选在第二结合序列)或捕获寡核苷酸的任意区域(优选第一通用序列、折叠序列、结合捕获序列进行)包含核酸类似物修饰。所述核酸类似物包含选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥(methylenebridge)RNA、2'-甲氧基修饰碱基(2'-O-Methyl Base)、2'-O-甲基(Methyl)RNA、脱氧尿嘧啶核苷(deoxyuridine dU)或2'-氟代(Fluoro)RNA。核酸类似物修饰在捕获寡核苷酸第一通用序列、折叠序列、或结合捕获序列上,可用于减少捕获寡核苷酸分子内折叠引发的非特异性扩增。在修饰脱氧尿嘧啶核苷的方案中,脱氧尿嘧啶核苷可用于后续使用酶(例如USER酶)破坏延伸捕获寡核苷酸的发卡结构以提高扩增效率。
捕获寡核苷酸还包括位于结合捕获序列的5’端的第二通用序列。本发明中,通过在折叠序列和结合捕获序列之间设置第二通用序列,在进行捕获寡核苷酸的延长和自我折叠后,得到的发夹式结构产物可以采用特异引物和/或通用引物作为上下游引物,进行PCR扩增检测,可以实现对多重靶标分子等效扩增的效果。
在捕获寡核苷酸不含第二通用序列的实施方案中,所述通用引物包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列。通用引物可以在其5’包含任何序列,只要其3’端包含与结合捕获序列或其一部分相同的序列即可。
在捕获寡核苷酸包含第二通用序列的实施方案中,所述通用引物包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与(a)或(b)相同:(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列,(b)(a)的部分序列。类似地,通用引物可以在其5’包含任何序列,只要其3’端包含与结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列或其一部分相同的序列即可。例如通用引物的序列从5’端到3’端依次包括以下序列:第二通用序列或其3’端部分序列和第一结合序列或其5’端部分序列。
通用引物的长度以及其中第二通用序列部分和第一结合序列部分的长度或比例可根据待扩增序列的组成、长度、所需特异性等进行常规调节。
本文中,特异引物包含与第一通用序列相同或部分相同的序列;特异引物可以在其5’包含任何序列,只要其3’端序列与第一通用序列或其部分序列相同,或与折叠序列或其部分序列相同即可。例如特异引物从5’端到3’端依次包括以下序列:第一通用序列或其3’端部分序列(通用部分)和折叠序列或其5’端部分序列(特异部分)。特异引物的长度以及其中第一通用序列的部分和折叠序列的部分的长度或比例可根据待扩增序列的组成、长度、所需特异性等进行常规调节。
捕获寡核苷酸还可包括核酸延伸阻断修饰,位于折叠序列的3’端或第二通用序列的5’端,用于隔断第二通用序列和折叠序列。所述核酸延伸阻断修饰有能阻断DNA聚合酶延伸的物质,使得发夹式结构产物在使用通用引物和/或靶标分子特异引物进行PCR扩增时,在核酸延伸阻断修饰处终止延伸,进而产生一个线性化的扩增模板,用于后续的指数式扩增,提高扩增的效率。本发明中,将核酸延伸阻断修饰设置在折叠序列的3’端,或者设置在第二通用序列和折叠序列之间,不仅不影响延长的捕获寡核苷酸的自我折叠,而且还可以在捕获寡核苷酸自我折叠后,以自身为模板进行自我延伸、在3’端添加不属于靶标分子的第一通用序列的互补链,从而形成具有完整的发夹式结构的产物;所述发夹式结构产物可以作为通用引物和/或靶标分子特异性引物进行PCR扩增时的模板,进行PCR指数式扩增,有效保证了扩增的特异性和准确性。
在一些实施方案中,寡核苷酸接头和捕获寡核苷酸均可具有自折叠区,且仍可以以较高的特异性和灵敏度实现甲基化检测。例如,寡核苷酸接头可以在第二结合序列的5’端添加能与自身序列配对的核酸序列,使得第二结合序列部分自折叠。或者,寡核苷酸接头可以在第一结合序列的3’端添加能与自身序列配对的核酸序列,使得第一结合序列部分自折叠。又如,捕获寡核苷酸可以在其中的第一通用序列的5’端添加能与自身序列配对的核酸序列,使得第一通用序列发生自折叠或第一通用序列和折叠序列发生自折叠。或者,捕获寡核苷酸可以在其中的结合捕获序列的3’端添加能与自身序列配对的核酸序列,使得结合捕获序列或结合捕获序列和第二通用序列发生自折叠。
本发明中,靶标分子可以是自身3’末端和5’末端序列信息明确(即序列明确)的靶标分子,或经生物学方法处理后产生的3’末端和5’末端序列信息类型明确的靶标分子。3’末端和5’末端序列信息明确的核酸序列类型包括正常核酸序列、带有修饰的核酸序列、单核苷酸突变、序列转置、序列缺失、序列重组等不同类型。
自身3’末端和5’末端序列信息明确的靶标分子,如microRNA成熟体、microRNA前体、cfDNA等。
可通过生物学方法实施切割或阻断的方法得到3’端和5’端序列信息明确的靶标分子中间产物,包括采用位点特异性切割核酸酶切割的产物,例如AP核酸外切酶、AP裂解酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、核酸限制性内切酶、甲基化依赖性核酸限制性内切酶、甲基化敏感性核酸限制性内切酶、切口酶、巨型核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas体系、错配修复酶等。甲基化依赖型限制性内切酶例如GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI;甲基化敏感性限制性内切酶例如HpaⅡ、SmaⅠ等;限制性内切酶例如MspⅠ、Xmal等;CRISPR-Cas体系包含与目标DNA片段匹配的引导性短RNA和可识别并切割特定序列的内切酶,例如基于Cas9、Cas12或Cas13的CRISPR-Cas体系。
本发明还提供包含本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸和本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头的组合物或试剂盒或体系,用于扩增或检测核酸。示例性的寡核苷酸接头如SEQ ID NO:1或20所示。示例性的修饰的寡核苷酸接头如SEQ ID NO:12所示。示例性的捕获寡核苷酸如SEQ ID NO:2、13、或21所示。示例性的修饰的捕获寡核苷酸如SEQ IDNO:8或11所示。示例性的具有自折叠区的寡核苷酸接头如SEQ ID NO:6所示。示例性的具有自折叠区的捕获寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:7或8所示。所述试剂盒还包括产生3’末端和5’末端序列信息明确的靶标分子的试剂,例如上述位点特异性切割核酸酶。所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、酶切缓冲液、PCR缓冲液中的任意一种或多种。
另外,所述试剂盒还包括特异性引物和/或通用引物。具体地,所述试剂盒还包括如本文前述的通用引物和特异引物。示例性通用引物如SEQ ID NO:4、15、19或23所示。示例性特异引物如SEQ ID NO:3、14或22所示。
在检测不同靶标分子时,只需根据靶标分子设计特异引物的特异部分(折叠序列或其5’端部分序列)即可,而通用引物、特异引物的通用部分(第一通用序列或其3’端部分序列)可以保持不变。
为了检测核酸,所述试剂盒还可包括探针。在一些实施方案中,探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。通常,荧光基团标记在检测探针的5’端,淬灭基团标记在检测探针的3’端。所述荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种或多种;所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种或多种。示例性探针如SEQ ID NO:5、16或24所示。
所述试剂盒还可包括测序所需试剂,这些试剂为本领域技术人员周知,例如聚合酶、测序引物等。
本发明提供了一种核酸扩增或检测方法,包括采用寡核苷酸接头延伸靶标分子、和采用捕获寡核苷酸结合靶标分子的步骤。具体地,所述方法包括:(1)3’端和5’端序列明确的靶标分子与寡核苷酸接头的结合序列互补结合,(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸,在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头互补的序列,获得延伸的靶标分子,(3)延伸的靶标分子与捕获寡核苷酸的结合捕获序列互补结合,(4)捕获寡核苷酸以延伸的靶标分子为模板进行延伸反应,在捕获寡核苷酸3’末端添加与延伸的靶标分子互补的序列,获得延伸的捕获寡核苷酸,(5)延伸的捕获寡核苷酸通过延伸的序列与分子内的折叠序列结合,形成半发夹结构产物;(6)半发夹结构产物进行延伸反应,在3’末端添加与分子内的第一通用序列互补的核苷酸,形成完整的发夹结构产物。
此外,发明人还发现,在步骤(1)-(6)中任一步(优选地(6)步)增加特异引物可以显著提高检测灵敏度。在线性延伸过程中,除了添加寡核苷酸接头和捕获寡核苷酸外,添加特异引物可以达到在线性过程中不添加特异引物但扩增体系中添加USER酶破坏捕获寡核苷酸茎环结构相似的扩增效果。线性延伸过程中添加特异引物的作用发生在步骤(6),形成完整的发卡结构产物之后,特异引物与其互补,富集更多后续用于扩增的模板。
此外,所述方法还包括基于特异引物的扩增和/或基于通用引物的扩增。具体地,所述方法还可包括:(7)使用具有尿嘧啶切割功能的酶(例如USER酶)处理完整的发夹结构产物,然后,采用通用引物和/或特异引物进行扩增,得到扩增产物;或者(7)以完整的发夹结构产物作为模板,采用通用引物和/或特异引物进行扩增,得到扩增产物。所述扩增任选还包含使用探针。所述方法还任选包括:(8)检测探针信号。特异引物、通用引物如上所述。
本发明还提供能形成茎环结构的核酸分子以及破坏该核酸分子的茎环结构的方法。所述核酸分子在茎序列和/或环序列中具有脱氧尿嘧啶核苷。具有脱氧尿嘧啶核苷使得核酸分子的茎环结构可通过USER酶或其他具有尿嘧啶切割功能的酶而被破坏。本文所述“茎序列”、“环序列”指茎环结构的核酸分子中分别形成茎结构和环结构的序列。脱氧尿嘧啶核苷可以位于环序列上或茎序列的任一条链上。茎环序列可包含至少两个或至少三个脱氧尿嘧啶核苷。示例性地,任意两个脱氧尿嘧啶核苷相隔多至10个碱基,优选多至8个碱基,例如相隔8、7、6、5、4、3、2、1或0个碱基。示例性地,茎序列上的任意脱氧尿嘧啶核苷与环序列距离多至10个碱基,优选多至8个碱基。所述方法包括将所述核酸分子在尿嘧啶被切割的条件下与具有尿嘧啶切割功能的酶(例如USER酶)孵育。USER酶或其他具有尿嘧啶切割功能的酶进行尿嘧啶切割的其他试剂和条件本领域周知,例如缓冲液、温度等。
在具体实施方案中,本发明涉及甲基化检测体系,主要包含甲基化依赖型限制性内切酶处理和基于通用引物扩增的荧光PCR技术两部分。该甲基化检测体系,涉及对靶标基因序列利用甲基化依赖型限制性内切酶进行酶切处理;涉及对甲基化依赖型限制性内切酶的酶切产物进行基于通用引物扩增的荧光PCR扩增。优选地,甲基化检测体系包括寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、特异性探针、特异引物和通用引物,上述组分如本文他处所述。
所述甲基化检测体系,所涉及的寡核苷酸接头从5’端到3’端依次包括第一结合序列和第二结合序列。所述第一结合序列是人工序列。所述第二结合序列与靶标分子的3’末端序列互补。
所述甲基化检测体系,所涉及的捕获寡核苷酸从5’端到3’端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列。所述折叠序列与靶标分子5’端序列至少部分相同,任选地,所述捕获寡核苷酸在折叠序列和结合捕获序列之间还包含第二通用序列。所述第一通用序列和第二通用序列可为人工序列。所述结合捕获序列与上述寡核苷酸接头的第一结合序列至少部分相同。
所述甲基化检测体系,所涉及的捕获寡核苷酸有核酸类似物;优选地,所述核酸类似物包括肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA中的任意一种或至少两种的组合。以上优选的核酸类似物修饰在捕获寡核苷酸折叠序列或靠近5’端的通用序列上,可用于减少捕获寡核苷酸分子内折叠引发的非特异性扩增,以及用于后续USER酶破坏延伸捕获寡核苷酸的发卡结构以提高扩增效率。
所述甲基化检测体系,所涉及的特异性探针两端分别标记有荧光检测基团和淬灭基团。所优选的荧光检测基团是FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种。
上述基于通用引物扩增的荧光PCR扩增检测包括以下步骤:
(1)3’端和5’端序列明确的靶标分子与寡核苷酸接头的第二结合序列互补结合,酶切后的靶标分子以寡核苷酸接头为模板进行延伸反应,延伸出与寡核苷酸接头的第一结合序列互补的序列,形成延伸的靶标分子。
(2)延伸的靶标分子与捕获寡核苷酸的第一结合序列互补结合,捕获寡核苷酸以延伸的靶标分子为模板进行延伸,形成延伸的捕获寡核苷酸。
(3)延伸的捕获寡核苷酸通过延伸得到的序列与自身的折叠序列互补配对,形成半发卡结构。
(4)半发卡结构以自身为模板进行延伸,延伸出与特异引物序列完全互补的序列,形成完整的发卡结构。
(5)特异引物可直接结合完整发卡结构中与其互补的序列,并和通用引物进行PCR,切割探针产生信号,从而实现甲基化位点检测;也可使用USER酶将修饰U的核苷酸剪切下来,破坏延伸捕获寡核苷酸的发卡结构后,特异引物与其互补序列结合(捕获寡核苷酸中折叠序列3’末端连续修饰了多个U(3个及以上),PCR扩增的预混液中的USER酶在适宜温度(例如37摄氏度)下能够将修饰了尿嘧啶(U)的核苷酸剪切下来,从而使捕获寡核苷酸的茎环结构被破环),此后,特异引物和通用引物进行PCR,切割探针产生信号,从而实现甲基化位点检测。
具体实施例通过如下方法检测Septine 9基因的如SEQ ID NO:10所述序列中的甲基化位点:
使用SEQ ID NO:1或6所示的寡核苷酸接头(1)与经GlaI酶切的cfDNA接触,寡核苷酸接头(1)与SEQ ID NO:10所示的靶标分子(2)互补结合;靶标分子(2)以SEQ ID NO:1或6为模板延伸,在靶标分子(2)的3’末端添加与SEQ ID NO:1或6互补的序列,获得延伸的靶标分子(3);延伸的靶标分子(3)与SEQ ID NO:2或7所示的捕获寡核苷酸(4)互补结合;捕获寡核苷酸(4)以延伸的靶标分子(3)为模板进行延伸反应,在捕获寡核苷酸(4)的3’末端添加与延伸的靶标分子(3)互补的序列,获得延伸的捕获寡核苷酸(5);延伸的捕获寡核苷酸(5)通过延伸的序列与分子内的折叠序列结合,形成半发夹结构产物(6);半发夹结构产物(6)进行延伸反应,在3’末端添加与分子内的第一通用序列互补的核苷酸,形成完整的发夹结构产物(7);以完整的发夹结构产物(7)作为模板,采用SEQ ID NO:4所示的通用引物和/或SEQ ID NO:3所示的特异引物和如SEQ ID NO:5所示的探针进行扩增,检测探针信号。
或者,使用SEQ ID NO:1或6所示的寡核苷酸接头(1)与经GlaI酶切的cfDNA接触,寡核苷酸接头(1)与SEQ ID NO:10所示的靶标分子(2)互补结合;靶标分子(2)以SEQ IDNO:1或6为模板延伸,在靶标分子(2)的3’末端添加与SEQ ID NO:1或6互补的序列,获得延伸的靶标分子(3);延伸的靶标分子(3)与SEQ ID NO:8所示的捕获寡核苷酸(4)互补结合;捕获寡核苷酸(4)以延伸的靶标分子(3)为模板进行延伸反应,在捕获寡核苷酸(4)的3’末端添加与延伸的靶标分子(3)互补的序列,获得延伸的捕获寡核苷酸(5);延伸的捕获寡核苷酸(5)通过延伸的序列与分子内的折叠序列结合,形成半发夹结构产物(6);半发夹结构产物(6)进行延伸反应,在3’末端添加与分子内的第一通用序列互补的核苷酸,形成完整的发夹结构产物(7);使用USER酶处理完整的发夹结构产物(7),然后采用SEQ ID NO:4所示的通用引物和/或SEQ ID NO:3所示的特异引物和如SEQ ID NO:5所示的探针进行扩增,检测探针信号。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1)本发明的cfDNA甲基化检测技术,无需繁琐的化学处理、洗涤纯化等过程,只需对待测样本进行简便快捷的酶切处理,得到5’端、3’端序列明确的样本,结合基于通用引物的扩增技术,即可实现特异性好、灵敏度高的cfDNA甲基化检测。
2)由于cfDNA片段化程度高,可能随机断裂在甲基化位点或其附近,本发明方案只有3’端和5’端均由甲基化位点介导产生的才能引发扩增,可以有效抑制cfDNA随机断裂导致的扩增假阳性,进一步提高了扩增的特异性,更适用于cfDNA这种片段化程度高的甲基化检测。
3)本发明针对不同靶标分子进行甲基化检测时,只需根据靶标分子设计寡核苷酸接头的第二结合序列、捕获寡核苷酸的折叠序列、特异探针和特异引物的特异部分,而可以保持寡核苷酸接头和捕获寡核苷酸的第一结合序列、通用引物、特异引物的通用部分不变,降低了多重靶标分子扩增时易出现多种引物间的干扰,提高了反应的灵敏度,从而可以实现多重靶标分子的甲基化检测。
4)本发明中的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、特异引物经过特殊设计,当环境中存在靶标分子时,可引发由寡核苷酸接头和捕获寡核苷酸介导的延伸反应,形成发卡结构的延伸产物,并通过后续的指数扩增放大信号,满足对cfDNA甲基化检测的灵敏度需求。
5)本发明的双端酶切方案相比单端酶切方案降低了假阳性;此外,含有U的发卡结构被USER酶破坏,减小了后续特异引物与捕获寡核苷酸结合的难度,大大提高了扩增效率。
实施例
实施例1:人源Septine 9基因的超声碎片DNA的甲基化检测
(1)分别提取Jurkat细胞系和Hela细胞系的基因组DNA,测序鉴定Septine9基因的甲基化状态。
(2)通过超声处理上述两种基因组DNA,得到片段大小约150bp的碎片DNA。
(3)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对上述超声碎片处理的DNA进行酶切反应,反应体系为:1×酶切缓冲液,10U GlaI,不同浓度的超声碎片DNA,体积共10μL;反应条件为37℃孵育1小时;酶切反应结束后,将体系加热至85℃,孵育10分钟,对GlaI进行热灭活。
(4)分别向上述酶切体系中加入Septine 9基因的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸进行线性延伸反应,反应体系为:酶切后的超声碎片DNA、5nM寡核苷酸接头、50nM捕获寡核苷酸、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1X PCR缓冲液,终体积为20μl;反应程序为95℃预变性3min;95℃10s,63℃90s,10个循环。
(5)再向上述反应体系中加入Septine 9基因的特异性探针、特异引物和通用引物,PCR检测Septine 9基因的甲基化状态,PCR扩增体系为:步骤(4)获得的延伸产物、400nM特异引物、400nM通用引物、250nM特异性探针、1.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mMMgCl2和1×PCR缓冲液,终体积为30μL;PCR反应程序为95℃预变性3min;94℃10s,66℃90s,10个循环;95℃10s,65℃20s,40个循环;在ROCHE仪器(480)上进行实时荧光PCR,对相应的荧光数值进行采集。
采用的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、特异引物、通用引物、特异性探针的组合包括:
寡核苷酸接头
捕获寡核苷酸(斜体为2’甲氧基修饰碱基)
特异引物
5-TGCCAACGGTATTCATCGTTGACC(SEQ ID NO:3)
通用引物
特异性探针
5-VIC-CCATCATGTCGGACCC-MGB(SEQ ID NO:5)
人源Septine 9基因部分序列如下:
//为酶切位置,其前后的CG为甲基化位置。
寡核苷酸接头在其3’端具有巯基修饰以阻断延伸。捕获寡核苷酸在折叠序列的3’端具有Spacer以阻断延伸。
如图2所示,经测序鉴定发现,Jurkat细胞系基因组的Septine 9基因是非甲基化的,Hela细胞系基因组的Septine 9基因是甲基化的。超声碎片的DNA主要片段约为150bp,用以模拟血浆提取的cfDNA。采用qPCR检测不同浓度的甲基化样本和非甲基化样本中Septine 9基因的甲基化状态,如图所示,1和2为Septine 9阳性模板的扩增曲线,分别为0.4ng和0.04ng的Septine 9甲基化基因样本,显示为阳性结果,3和4为Septine 9阴性模板的扩增曲线,分别为5ng和10ng的Septine 9非甲基化样本,显示为阴性结果,5为阴性对照NC的扩增曲线,无扩增。
说明本发明对超声碎片DNA的Septine 9基因的甲基化检测具有良好的灵敏度和特异性。
实施例2:不同结构寡核苷酸接头的实验
为了减少寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸和靶标分子的竞争,本实施例选择了不同结构的寡核苷酸接头进行检测。所使用的捕获寡核苷酸、特异引物、通用引物和特异性探针与实施例1相同,酶切条件和扩增条件与实施例1相同。
采用的寡核苷酸接头包括:
直链寡核苷酸接头
5-TGCCGTCAGAGTCCTGTCTCGAGCGACCCGCTGCCCACCAG(SEQ ID NO:1)
自折叠寡核苷酸接头(下划线为自折叠的区域)
5-TCGAGACAGGACTGCCGTCAGAGTCCTGTCTCGAGCGACCCGCTGCCCAC(SEQ ID NO:6)
人源Septine 9基因部分序列如实施例1所示。
如图3所示,采用直链寡核苷酸接头和自折叠寡核苷酸接头,在300拷贝、120拷贝、40拷贝、12拷贝甲基化阳性基因组DNA的检测中都出现扩增曲线,显示为阳性结果,说明采用直链寡核苷酸接头和自折叠寡核苷酸接头均能实现高灵敏的甲基化检测;但相比于自折叠寡核苷酸接头,使用直链寡核苷酸接头时,甲基化阳性基因组DNA扩增的CT值更小,荧光信号值更高,尤其表现在低拷贝(12拷贝)的甲基化阳性基因组DNA中,这是由于直链寡核苷酸接头的结构更简单,碱基数更少,具有更好的反应动力学表现,更有利于与模板的互补配对。因此,采用直链寡核苷酸接头在DNA甲基化检测中表现更优。
实施例3:不同结构捕获寡核苷酸的实验
为了提高扩增效率,本实施例选择了不同结构的捕获寡核苷酸进行检测,所使用的酶切条件和扩增条件,寡核苷酸接头、特异引物、通用引物和特异性探针与实施例1相同,在脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸反应体系内,加入通用引物和特异性探针的同时加入1.5U USER酶。
采用的捕获寡核苷酸包括:
自折叠的捕获寡核苷酸(下划线为自折叠区域)
5-CGGACCCATGCCAACGGTATTCATCGTTGACCGCGGGGTCCGAGATGTGGCACTGACAATGCCGTCAGAGTCCTGTCTCGA(SEQ ID NO:7)
脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸(下划线为自折叠区域)
5-CGGACCCAUGCCAACGGUATUCATCGTUGACCGCGGGGTCCGAGATGTGGCACTGACAATGCCGTCAGAGTCCTGTCTCGA(SEQ ID NO:8)
人源Septine 9基因部分序列如实施例1所示。
如图4所示,自折叠的捕获寡核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸在300拷贝、120拷贝、40拷贝的甲基化阳性基因组DNA中都能显示阳性结果,说明采用不同结构的捕获寡核苷酸均可以实现对靶标分子的高灵敏检测。从扩增的CT值中可见,使用两种不同结构的捕获寡核苷酸可产生不同的扩增效率,脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸的扩增效率高于自折叠的捕获寡核苷酸。这是因为脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸在形成完整的发卡结构后,在USER酶的作用下降解了部分带有U的核苷酸,结构更不稳定,促进了特异引物与其互补结合,从而更有利于后续被特异引物和通用引物进行扩增;自折叠的捕获寡核苷酸更不易与特异引物互补配对,扩增效率受到一定的抑制,因此,使用自折叠的捕获寡核苷酸的扩增效率不如脱氧尿嘧啶核苷修饰的捕获寡核苷酸。
实施例4:线性延伸反应添加特异引物实验
为了提高反应效率,本实施例对线性延伸反应中是否添加特异引物进行了对比实验。所使用的酶切条件,寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、特异引物、通用引物和特异性探针与实施例1相同。
(1)提取Hela细胞系的基因组DNA,测序鉴定Septine9基因为甲基化阳性状态。
(2)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对上述基因组DNA进行酶切反应,反应体系为:1×酶切缓冲液,10U GlaI,不同浓度的基因组DNA,体积共10μL;反应条件为37℃孵育1小时;酶切反应结束后,将体系加热至85℃,孵育10分钟,对GlaI进行热灭活。
(3)向上述酶切体系中加入Septine 9基因的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸,实验组中加入特异引物,对照组中不加入特异引物,进行线性延伸反应,反应体系为:酶切后的DNA、5nM寡核苷酸接头、50nM捕获寡核苷酸、(实验组100nM,对照组0nM)特异引物、0.5U TaqDNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1X PCR缓冲液,终体积为20μl;反应程序为95℃预变性3min;95℃10s,63℃90s,10个循环。
(4)再向上述反应体系中加入Septine 9基因的特异性探针、特异引物和通用引物,PCR检测Septine 9基因的甲基化状态,PCR扩增体系为:酶切后的DNA、400nM特异引物、400nM通用引物、250nM特异性探针、1.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1×PCR缓冲液,终体积为30μL;PCR反应程序为95℃预变性3min;94℃10s,66℃90s,10个循环;95℃10s,65℃20s,40个循环;在ROCHE仪器(480)上进行实时荧光PCR,对相应的荧光数值进行采集。
人源Septine 9基因部分序列如实施例1所示。
如图5所示,对照组,即线性延伸反应中添加0nM特异引物的120拷贝、40拷贝、12拷贝甲基化阳性基因组DNA都能显示阳性结果,阴性对照NC无扩增;实验组,即线性延伸反应中添加100nM特异引物的120拷贝、40拷贝、12拷贝甲基化阳性基因组DNA也能显示阳性结果,而且相同浓度甲基化阳性基因组DNA的扩增CT值更小,扩增效率较对照组更高,阴性对照NC无扩增。这是由于线性延伸反应中添加特异引物,捕获寡核苷酸的延伸产物形成完整发卡结构后能够立即与特异引物结合,产生更多用于后续扩增的模板,因此线性延伸反应中添加100nM特异引物能够提高反应效率。
实施例5:仅对靶标分子5’端酶切后扩增方案的扩增效率对比实验
为评估仅对靶标分子5’端酶切扩增方案(单端酶切方案)与使用修饰的捕获寡核苷酸的本文双端酶切方案(双端酶切方案)的效率差异,本实施例对两种方案进行了对比实验。两种方案针对的靶标分子相同,所使用的特异引物、通用引物、特异性探针相同并与实施例1相同。双端酶切方案所使用的捕获寡核苷酸如SEQ ID NO:2所示,寡核苷酸接头与实施例1相同。单端酶切方案的捕获寡核苷酸如下所示(斜体为2’甲氧基修饰碱基):
人源Septine 9基因部分序列如实施例1所示。
实验步骤:
(1)提取Hela细胞系的基因组DNA,测序鉴定Septine9基因为甲基化阳性状态。
(2)通过超声处理上述基因组DNA,得到片段大小为约150bp的碎片DNA。
(3)采用甲基化依赖型限制性内切酶GlaI对上述超声碎片DNA进行酶切反应,反应体系为:1×酶切缓冲液,10U GlaI,1ng超声碎片DNA,体积共10μL;反应条件为37℃孵育1小时;酶切反应结束后,将体系加热至85℃,孵育10分钟,对GlaI进行热灭活。
(4)单端酶切方案:向上述反应体系中加入Septine9基因的捕获寡核苷酸、特异性探针、特异引物和通用引物,PCR检测Septine9基因的甲基化状态,PCR扩增体系为:酶切后超声碎片DNA、400nM通用引物、250nM特异性探针、1.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1×PCR缓冲液,终体积为30μL;PCR反应程序为95℃预变性3min;94℃10s,66℃90s,10个循环;95℃10s,65℃20s,40个循环;在ROCHE仪器(480)上进行实时荧光PCR,对相应的荧光数值进行采集。
双端酶切方案:延伸和扩增操作步骤和条件与实施例1相同。
如图6所示,使用两种方案对1ng超声碎片甲基化阳性DNA进行酶切后扩增检测,分别设置了3个复孔。单端酶切方案的CT值约为28,双端酶切方案的CT值约为20。可见双端酶切方案的扩增效率比单端酶切方案高。
实施例6:仅对靶标分子5’端酶切扩增方案的假阳性的对比实验
为评估仅对靶标分子5’端酶切扩增方案(单端酶切方案)与本文双端酶切方案(双端酶切方案)出现假阳性的概率,本实施例对两种方案进行了对比实验。两种方案针对的靶标分子相同,所使用的特异引物、通用引物、特异性探针相同并与实施例5相同。双端酶切方案所使用的捕获寡核苷酸如SEQ ID NO:2所示、寡核苷酸接头与实施例5相同。单端酶切方案的捕获寡核苷酸如下所示(斜体为2’甲氧基修饰碱基):
人源Septine 9基因部分序列如实施例1所示。
实验步骤:
(1)提取Jurkat细胞系和Hela细胞系的基因组DNA,测序鉴定Jurkat细胞系DNA的Septine9基因为非甲基化,Hela细胞系DNA的Septine9基因为甲基化状态。
(2)通过超声处理上述基因组DNA,得到片段大小为约150bp的碎片DNA。
(3)以GlaI酶切的1ng Septine9基因甲基化阳性的超声碎片DNA为阳性模板,以GlaI酶切的Septine9基因5ng和10ng非甲基化化样本的超声碎片DNA为阴性模板。酶切反应体系为:1×酶切缓冲液,10U GlaI,阳性模板和阴性模板,体积共10μL;反应条件为37℃孵育1小时;酶切反应结束后,将体系加热至85℃,孵育10分钟,对GlaI进行热灭活。
(4)单端酶切方案和双端酶切方案的延伸扩增步骤和条件与实施例5所述相同,不作赘述。
如图7所示,单端酶切方案的阳性对照(1ng甲基化超声碎片DNA)显示阳性结果,5ng和10ng非甲基化超声碎片DNA的8个复孔中随机出现4-5个阳性结果(即假阳性)。双端酶切方案的阳性对照能够正常扩增,而5ng和10ng非甲基化DNA的8个复孔没有扩增,显示为阴性结果。这说明单端酶切方案在检测非甲基化DNA时具有一定假阳性概率,这是由于DNA片段随机断裂在酶切位置附近时也能够被扩增,出现假阳性结果,尤其对于cfDNA片段化程度高的模板,而双端酶切方案针对两个甲基化位点,需要同时被酶切出明确的两个端点,两个端点之间间隔较小,同时随机断裂在相应两个位点的概率极小,从而大大降低了假阳性的概率,在cfDNA的甲基化检测中表现出明显的优势。
实施例7:锁核酸修饰捕获寡核苷酸的甲基化检测
为了验证捕获寡核苷酸修饰不同核酸类似物的检测效果,本实施例选择锁核酸修饰的捕获寡核苷酸进行检测。所使用的寡核苷酸接头、特异引物、通用引物和特异性探针与实施例1相同,酶切条件和扩增条件与实施例1相同。
锁核酸修饰的捕获寡核苷酸(粗体下划线为锁核酸修饰位置):
结果显示,0.4ng和0.04ng的Septine 9甲基化基因样本,显示为阳性结果,5ng和10ng的Septine 9非甲基化样本,显示为阴性结果,阴性对照NC的扩增曲线,无扩增。
可以看出,锁核酸修饰的捕获寡核苷酸对超声碎片DNA的Septine 9基因的甲基化检测具有良好的灵敏度和特异性。
实施例8:锁核酸修饰寡核苷酸接头的甲基化检测
(1)以甲基化转移酶处理的Jurkat细胞系基因组DNA作为SDC2基因甲基化阳性DNA。
(2)以甲基化依赖型限制性内切酶GlaI酶切处理的上述DNA为阳性模板。酶切反应体系为:10×酶切缓冲液1μL,10U GlaI,不同浓度的甲基化DNA,体系共10μL;反应条件为37℃孵育1小时;酶切反应结束后,将体系加热至85℃,孵育10分钟,对GlaI进行热灭活。以无GlaI酶切处理的DNA作为阴性模板。非酶切体系为:10×酶切缓冲液1μL,不同浓度的DNA,体系共10μL;反应条件为37℃孵育1小时;将体系加热至85℃,孵育10分钟。
(3)向上述酶切和非酶切体系中加入SDC2基因的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸进行线性延伸反应,反应体系为:酶切处理或非酶切处理的DNA、5nM寡核苷酸接头、50nM捕获寡核苷酸、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1X PCR缓冲液,终体积为20μl;反应程序为95℃预变性3min;95℃10s,60℃90s,10个循环。
(4)再向上述反应体系中加入SDC2基因的特异性探针、特异引物和通用引物,PCR扩增体系为:步骤(3)获得的延伸产物、400nM特异引物、400nM通用引物、250nM特异性探针、1.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1×PCR缓冲液,终体积为30μL;PCR反应程序为95℃预变性3min;94℃10s,66℃90s,10个循环;95℃10s,65℃20s,40个循环;在ROCHE仪器(480)上进行实时荧光PCR,对相应的荧光数值进行采集。
采用的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、特异引物、通用引物、特异性探针的组合包括:
寡核苷酸接头(粗体为锁核酸修饰位置)
捕获寡核苷酸
特异引物
5-TGCCAACGGTATTCATCGCCCCCG(SEQ ID NO:14)
通用引物
5-TGGCGTCAGATGTGGCACTGACAA(SEQ ID NO:15)
特异性探针(SEQ ID NO:16)
5-FAM-CAATCGCTGCGGTACTC-MGB
人源SDC2基因部分序列如下:
//为酶切位置,粗斜体部分为识别序列,其中的CG为甲基化位置
如图8所示,200拷贝、100拷贝的阳性模板出现了扩增曲线,显示为阳性结果,阴性对照NC无扩增曲线,显示为阴性结果。说明修饰了锁核酸的寡核苷酸接头能够用于检测SDC2基因的DNA甲基化。
实施例9:探究使用无第二通用序列的捕获寡核苷酸和与结合捕获序列相同的扩增引物的检测效果
本实施例选择无第二通用序列的捕获寡核苷酸,以及与结合捕获序列相同的引物,对Septin 9基因进行甲基化检测。
所使用的寡核苷酸接头、特异引物、特异性探针与实施例1相同,酶切条件和扩增条件与实施例1相同。
无第二通用序列的捕获寡核苷酸序列:
5-TGCCAACGGTATTCATCGTTGACCGCGGGGTCCGTGCCGTCAGAGTCCTGTCTCGA(SEQ ID NO:18)
与结合捕获序列相同的扩增引物:
5-TGCCGTCAGAGTCCTGTCTCGA(SEQ ID NO:19)
如图9所示,使用无第二通用序列的捕获寡核苷酸和与结合捕获序列相同的扩增引物可以实现300拷贝、120拷贝、40拷贝、12拷贝甲基化DNA的高效扩增,且3000拷贝非甲基化DNA为阴性结果,阴性对照NC也显示为阴性结果。
实施例10:人源SHOX2基因的甲基化检测
(1)以甲基化转移酶处理的Jurkat细胞系基因组DNA作为SHOX2基因甲基化阳性DNA。
(2)以甲基化依赖型限制性内切酶LpnPI酶切处理的上述DNA为阳性模板。酶切反应体系为:10×酶切缓冲液1μL,2U LpnPI,1×Activator,不同浓度的甲基化阳性DNA,体系共10μL;反应条件为37℃孵育1.5小时;酶切反应结束后,将体系加热至65℃,孵育20分钟,对LpnPI进行热灭活。以无LpnPI酶切处理的上述DNA为阴性模板。
(3)向上述酶切体系中加入SHOX2基因的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸进行线性延伸反应,反应体系为:酶切处理的DNA或无酶切处理的DNA、5nM寡核苷酸接头、50nM捕获寡核苷酸、0.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1X PCR缓冲液,终体积为20μl;反应程序为95℃预变性3min;95℃10s,60℃90s,10个循环。
(4)再向上述反应体系中加入SHOX2基因的特异性探针、特异引物和通用引物,PCR扩增体系为:酶切处理的DNA或无酶切处理的DNA、400nM特异引物、400nM通用引物、250nM特异性探针、1.5U Taq DNA聚合酶、200μM dNTPs、4.5mM MgCl2和1×PCR缓冲液,终体积为30μL;PCR反应程序为95℃预变性3min;94℃10s,66℃90s,10个循环;95℃10s,65℃20s,40个循环;在ROCHE仪器(480)上进行实时荧光PCR,对相应的荧光数值进行采集。
采用的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、特异引物、通用引物、特异性探针的组合包括:
寡核苷酸接头
捕获寡核苷酸
特异引物
5-GTCTCAGCAATCATCTCCCGCC(SEQ ID NO:22)
通用引物
5-GGACCGACAGTTCACACCAGC(SEQ ID NO:23)
特异性探针(SEQ ID NO:24)
5-FAM-CCTGCCCGACCGG-MGB
人源SHOX2基因部分序列如下:
//为酶切位置,斜体加粗为LpnPI识别序列,其中的CG为甲基化位置
如图10所示,1200拷贝、300拷贝、120拷贝、40拷贝的阳性模板都出现扩增曲线,显示为阳性结果,15000拷贝阴性模板无扩增曲线,显示为阴性结果,阴性对照NC同样无扩增曲线。说明本发明能够利用LpnPI酶切处理甲基化DNA产生28bp的模板,且对SHOX2基因的甲基化检测具有良好的灵敏度和特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学
上海慧众同康生物科技有限公司
<120> 甲基化检测组合物、试剂盒及方法
<130> 214143 1CNCN
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adapter
<400> 1
tgccgtcaga gtcctgtctc gagcgacccg ctgcccacca g 41
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 2
tgccaacggt attcatcgtt gaccgcgggg tccgagatgt ggcactgaca atgccgtcag 60
agtcctgtct cga 73
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tgccaacggt attcatcgtt gacc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cggcgtcaga tgtggcactg acaa 24
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 5
ccatcatgtc ggaccc 16
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adapter
<400> 6
tcgagacagg actgccgtca gagtcctgtc tcgagcgacc cgctgcccac 50
<210> 7
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 7
cggacccatg ccaacggtat tcatcgttga ccgcggggtc cgagatgtgg cactgacaat 60
gccgtcagag tcctgtctcg a 81
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 8
cggacccaug ccaacgguat ucatcgtuga ccgcggggtc cgagatgtgg cactgacaat 60
gccgtcagag tcctgtctcg a 81
<210> 9
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 9
tgccaacggt attcatcgtt gaccgcgggg tccgagatgt ggcactgaca agcgacccgc 60
tgccc 65
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
gctgcgcgtt gaccgcgggg tccgacatga tggctggtgg gcagcgggtc gcgcggagg 59
<210> 11
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 11
cggacccatg ccaacggtat tcatcgttga ccgcggggtc cgagatgtgg cactgacaat 60
gccgtcagag tcctgtc 77
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adapter
<400> 12
tgccgtcaga gtcctgtatt aagcacacga atccg 35
<210> 13
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 13
tgccaacggt attcatcgcc cccgagcccc gtggcgtcag atgtggcact gacaatgccg 60
tcagagtcct gtattaa 77
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
tgccaacggt attcatcgcc cccg 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
tggcgtcaga tgtggcactg acaa 24
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 16
caatcgctgc ggtactc 17
<210> 17
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
gcgcccccga gccccgagcc cgagtccccg agcctgagcc gcaatcgctg cggtactctg 60
ctccggattc gtgtgcgc 78
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 18
tgccaacggt attcatcgtt gaccgcgggg tccgtgccgt cagagtcctg tctcga 56
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
tgccgtcaga gtcctgtctc ga 22
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adapter
<400> 20
gtccactgcc actgacactc gtgcgacccc ggt 33
<210> 21
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capturer
<400> 21
gtctcagcaa tcatctcccg cctgcccgac cgacagttca caccagcgtc cactgccact 60
gacac 65
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
gtctcagcaa tcatctcccg cc 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
ggaccgacag ttcacaccag c 21
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 24
cctgcccgac cgg 13
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
cgtcccgcct gcccgaccgg ggtcgcacga gc 32
Claims (10)
1.一种核酸扩增或检测方法,包括采用寡核苷酸接头延伸靶标分子、和采用捕获寡核苷酸结合靶标分子的步骤,
所述寡核苷酸接头从5’到3’包含第一结合序列和第二结合序列,所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列至少部分相同的序列,所述第二结合序列与靶标分子互补,
优选地,
所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰,
所述核酸延伸阻断修饰位于第二结合序列的3’端,和/或
所述第二结合序列与靶标分子的非5’末端序列互补;优选地,所述第二结合序列与靶标分子的3’末端序列互补,和/或
所述第二结合序列具有核酸类似物修饰;优选地,所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA,和/或
所述靶标分子是3’端和5’端序列明确的靶标分子;优选地,所述靶标分子是位点特异性切割核酸酶的酶切产物,
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述捕获寡核苷酸从5’到3’包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列,其中,所述折叠序列与靶标分子的5’末端序列至少部分相同,和/或所述结合捕获序列与权利要求1所述的寡核苷酸接头的非3’末端序列至少部分相同,
优选地,
所述结合捕获序列与寡核苷酸接头的第一结合序列至少部分相同,和/或
所述捕获寡核苷酸具有核酸类似物修饰;优选地,所述核酸类似物修饰位于第一通用序列、折叠序列、或结合捕获序列;优选地,所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA,和/或
所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰;优选地,所述核酸延伸阻断修饰位于折叠序列的3’端;优选地,所述核酸延伸阻断修饰位于第二通用序列的5’端;优选地,所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种:Spacer、硫代基团、巯基、氨基和尿嘧啶碱基。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)3’端和5’端序列明确的靶标分子与寡核苷酸接头的结合序列互补结合,
(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸,在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头互补的序列,获得延伸的靶标分子,
(3)延伸的靶标分子与捕获寡核苷酸的结合捕获序列互补结合,
(4)捕获寡核苷酸以延伸的靶标分子为模板进行延伸反应,在捕获寡核苷酸3’末端添加与延伸的靶标分子互补的序列,获得延伸的捕获寡核苷酸,
(5)延伸的捕获寡核苷酸通过延伸的序列与分子内的折叠序列结合,形成半发夹结构产物;
(6)半发夹结构产物进行延伸反应,在3’末端添加与分子内的第一通用序列互补的核苷酸,形成完整的发夹结构产物,
优选地,
步骤(1)和(2)是:
(1)3’端和5’端序列明确的靶标分子与寡核苷酸接头的第二结合序列互补结合,
(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸,在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头的第一结合序列互补的序列,获得延伸的靶标分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括基于特异引物的扩增和/或基于通用引物的扩增,
优选地,所述方法还包括:
(7)使用具有尿嘧啶切割功能的酶(例如USER酶)处理完整的发夹结构产物,然后,采用通用引物和/或特异引物进行扩增,得到扩增产物;或者
(7)以完整的发夹结构产物作为模板,采用通用引物和/或特异引物进行扩增,得到扩增产物,和
任选地(8)检测探针信号;
更优选地,
所述通用引物(I)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同,或者(II)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与(a)或(b)相同:(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列,(b)(a)的部分序列,和/或
所述特异引物包含与第一通用序列相同或部分相同的序列;优选地,特异引物3’端序列与第一通用序列或其部分序列相同,或与折叠序列或其部分序列相同。
5.一种能形成茎环结构的核酸分子,所述核酸分子在茎序列和/或环序列中具有脱氧尿嘧啶核苷。
6.一种破坏权利要求5所述的核酸分子的茎环结构的方法,其特征在于,所述方法包括将所述核酸分子在尿嘧啶被切割的条件下与具有尿嘧啶切割功能的酶孵育。
7.一种用于核酸扩增的寡核苷酸接头,从5’到3’包含第一结合序列和第二结合序列,所述第一结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列至少部分相同的序列,所述第二结合序列与靶标分子互补,
优选地,
所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰
所述核酸延伸阻断修饰位于第二结合序列的3’端,和/或
所述第二结合序列与靶标分子的非5’末端序列互补;优选地,所述第二结合序列与靶标分子的3’末端序列互补,和/或
所述第二结合序列具有核酸类似物修饰;优选地,所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA,和/或
所述靶标分子是3’端和5’端序列明确的靶标分子;优选地,所述靶标分子是位点特异性切割核酸酶的酶切产物。
8.一种捕获寡核苷酸,所述捕获寡核苷酸从5’到3’包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列,其中,所述折叠序列与靶标分子的5’末端序列至少部分相同,和/或所述结合捕获序列与权利要求1所述的寡核苷酸接头的非3’末端序列至少部分相同,任选地,所述捕获寡核苷酸在折叠序列和结合捕获序列之间还包含第二通用序列,
优选地,
所述结合捕获序列与寡核苷酸接头的第一结合序列至少部分相同,和/或
所述捕获寡核苷酸具有核酸类似物修饰;优选地,所述核酸类似物修饰位于第一通用序列、折叠序列、或结合捕获序列;优选地,所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种:肽核酸、锁核酸、2'-O,4'-C-甲基化架桥RNA、2'-甲氧基修饰碱基、2'-O-甲基RNA、脱氧尿嘧啶核苷或2'-氟代RNA,和/或
所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰;优选地,所述核酸延伸阻断修饰位于折叠序列的3’端;优选地,所述核酸延伸阻断修饰位于第二通用序列的5’端;优选地,所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种:Spacer、硫代基团、巯基、氨基和尿嘧啶碱基。
9.一种核酸检测组合物或试剂盒,包括权利要求7所述的寡核苷酸接头和权利要求8所述的捕获寡核苷酸,
优选地,
所述组合物或试剂盒还包括位点特异性切割核酸酶;优选地,位点特异性切割核酸酶是核酸外切酶和/或核酸内切酶;更优选地,所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR-Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种,和/或
所述组合物或试剂盒还包括通用引物,所述通用引物(I)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同,或者(II)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列;优选地,通用引物3’端序列与(a)或(b)相同:(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列,(b)(a)的部分序列,和/或
所述组合物或试剂盒还包括特异引物,其包含与第一通用序列相同或部分相同的序列;优选地,特异引物3’端序列与第一通用序列或其部分序列相同,或与折叠序列或其部分序列相同,和/或
所述组合物或试剂盒还包括探针;优选地,所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团,和/或
所述组合物或试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTP或Mg2+中的任意一种或多种,和/或
所述组合物或试剂盒还包括酶切缓冲液和/或PCR缓冲液。
10.权利要求7所述的寡核苷酸接头、权利要求8所述的捕获寡核苷酸、和/或权利要求9所述的组合物在制备DNA甲基化检测产品中的应用,
优选地,所述产品选自试剂盒、装置、计算机可读介质。
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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