CN105154556A

CN105154556A - 实时荧光恒温指数扩增方法

Info

Publication number: CN105154556A
Application number: CN201510604571.0A
Authority: CN
Inventors: 黄庆; 府伟灵
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-09-22
Also published as: CN105154556B

Abstract

本发明提供了一种实时荧光恒温指数扩增方法，使用荧光标记的“茎-环-尾”结构寡核苷酸信号扩增模板，或者荧光标记的单纯线性结构寡核苷酸信号扩增模板，能够在恒定温度条件下，在具有切割双链核酸分子中一条链的缺口剂和具有链替换活性的DNA聚合酶共同作用下，重复进行“切割-延伸-链置换”过程，以指数形式扩增靶分子特异性寡核苷酸且能释放荧光信号。通过不同靶分子特异性寡核苷酸对应的信号扩增模板释放的荧光信号种类和丰度，可在单个反应管、检测池或检测孔中实现多个靶分子的平行检测，靶分子特异性寡核苷酸扩增10⁶倍以上，能够有效解决现有恒温扩增技术无法在单个检测体系中同时检测多种靶分子的技术难题。

Description

实时荧光恒温指数扩增方法

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，是一种可同时定性和/或定量检测多种核酸靶分子的实时荧光恒温指数扩增方法，可广泛应用于miRNA、mRNA、cDNA和基因组DNA等各种靶分子的现场快速检测。

背景技术

核酸扩增技术(nucleicacidamplificationtechnologies，NAT)被广泛应用于生命科学的各个领域，如遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤疾病、食品安全、法医学。核酸扩增技术的简便性、高效性、特异性、灵敏度、准确度、精确度，以及经济可承受性至关重要。

目前，主要有两大类核酸扩增技术，分别是基于温度热循环的变温扩增技术，例如聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)和连接酶链式反应(ligasechainreaction，LCR)，以及温度基本不变的恒温扩增技术(isothermalamplificationtechnology)。

以PCR为代表的变温扩增技术具有检测灵敏度高、特异性好等优势，是目前最精准的基因诊断方法之一。但是，却存在以下缺陷(ChangCC，etal.Diagnosticdevicesforisothermalnucleicacidamplification.Sensor.2012；12:8319-37)：需要反复的热变性以DNA双链，无法摆脱依赖高质量热循环仪的局限；扩增效率受到多种因素的影响和制约，易出现非特异性扩增；扩增反应时间长，一般需要几个小时。上述技术缺陷使PCR技术难于胜任生命科学领域的一些特殊用途，如现场快速检测或床旁检测(point-of-caretesting，POCT)。

恒温扩增技术是温度基本不变的核酸扩增技术。相对于PCR，恒温扩增技术具有以下主要优势(ChangCC，etal.Diagnosticdevicesforisothermalnucleicacidamplification.Sensor.2012；12:8319-37)：反应温度单一，对设备的要求程度低；不存在温度变化，扩增效率及核酸扩增片段长度均优于常规PCR技术；反应时间短，可在1小时，甚至几分钟内实现靶分子的有效扩增，且灵敏度和特异性与PCR技术相当，甚至更好。上述技术优势使恒温扩增技术在生命科学的各个领域得到了广泛应用，并且，特别适合于现场快速检测或床旁检测。

目前，已经发展出了多种核酸恒温扩增技术，其中，具有代表性的技术主要包括：链置换扩增(stranddisplacementamplification，SDA)、环介导核酸等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)、依赖于核酸序列的扩增(nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(helicase-dependentisothermalDNAamplification，HAD)、转录介导扩增(transcription-mediatedamplification，TMA)、单引物等温扩增(singleprimerisothermalamplification，SPIA^TM)、信号介导RNA扩增技术(signalmediatedamplificationofRNAtechnology，SMART)、恒温指数扩增(exponentialamplificationreaction；EXPAR)。各种恒温扩增技术充分利用了DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶等不同酶的生物学功能，不同恒温扩增技术的具体工作原理可参见YanL等的相关述评(YanL，etal.IsothermalamplifieddetectionofDNAandRNA.MolBiosyst.2014；10(5):970-1003.FakruddinM，etal.Nucleicacidamplification:Alternativemethodsofpolymerasechainreaction.JPharmBioalliedSci.2013Oct；5(4):245-52.ChangCC，eal.Diagnosticdevicesforisothermalnucleicacidamplification.Sensor.2012；12:8319-37.KimJ，etal.IsothermalDNAamplificationinbioanalysis:strategiesandapplications.Bioanalysis.2011；3(2):227-39.KimJ，etal.IsothermalDNAamplificationinbioanalysis:strategiesandapplications.Bioanalysis.2011；3(2):227-39.GillP，etal.Nucleicacidisothermalamplificationtechnologies:areview.NucleosidesNucleotidesNucleicAcids.2008；27(3):224-43)。

无论是变温还是恒温扩增技术，DNA聚合酶均是其反应体系的必需酶。一般而言，DNA聚合酶通常具有以下一种或多种生物学功能：5'→3'扩增活性(amplificationactivities)、5'→3'核酸外切酶活性(exonucleaseactivities)、3'→5'核酸外切酶活性、链置换活性(stranddisplacementactivities)。

无论是变温还是恒温扩增技术，在引物延伸过程中，当其3'-延伸末端抵达下游DNA链，即其3'-延伸末端存在另一条与模板分子互补配对形成的双链DNA(doublestrandDNA，dsDNA)区域时，如果DNA聚合酶既不具备5'→3'外切酶活性，也不具备链置换活性，那么，引物的3'-末端延伸则受到下游DNA链的阻止而无法继续延伸。但是，当DNA聚合酶具有5'→3'外切酶活性时(如：TaqDNA聚合酶)，该活性可将下游DNA链按照5'→3'方向水解成单核苷酸，从而使引物的延伸得以继续，如实时荧光PCR中的水解探针技术；或者，当DNA聚合酶具有链置换活性时(如：BstDNA聚合酶)，该活性可以使引物的延伸得以继续，同时，将下游DNA链从dsDNA区域剥离，使下游DNA链变成游离的单链核酸分子。DNA聚合酶的上述链置换活性被广泛应用于多种恒温扩增系统，如SDA、LAMP、RCA等。

具有链置换活性、缺乏5'→3'外切酶活性的DNA聚合酶被广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应。所谓双链核酸分子缺口是指双链核酸分子的一条链保持完整性，另一条链的某两个毗邻核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成一个缺口。该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-端羟基(3'-hydroxygroup，3'-OH)和5'-端磷酸基团(5'-phosphategroup，5'-PO4)。在上述DNA聚合酶存在的作用下，具有3'-OH的核酸分子从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离，使下游旧链转变成游离的单链核酸分子。

缺口内切酶(nickingendonuclease)，亦叫缺口酶(nickingenzyme)，是II型限制性内切酶(restrictionendonuclease)中的一类特殊类型酶。目前已经发现280余种缺口酶，商品化的近20余种，并且，其热稳定性到可达到65℃或更高。该类酶只切割双链核酸分子中的一条链，造成一个双链核酸分子缺口，该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-OH和5'-PO4。完全或部分双链核酸分子中被缺口内切酶识别的核苷酸序列被称为缺口内切酶识别序列(nickingendonucleaserecognitionsequences，NERS)。

限制性内切酶中还有一种特殊类型的酶(如：HincII)，该类酶具有常规限制性内切酶的功能，能够识别并在天然双链核酸分子的限制性内切酶识别序列(restrictionendonucleaserecognitionsequences，RERS)处同时酶切双链核酸分子的两条链。但是，当双链核酸分子中的一条链在RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：α巯基-脱氧核苷酸(α-thiodeoxynucleotide)时，该衍生核苷酸可阻止限制性内切酶切割该核酸分子链，因此，只能切割另一条不含有衍生核苷酸的天然核酸分子链。这种仅有一条链的RERS序列含有阻止限制性内切酶切割的双链核酸分子被称为半修饰RESR。可见，能够识别并切割半修饰RERS的限制性内切酶具有与缺口内切酶相似的功能，即可用于制备双链核酸分子缺口。

缺口内切酶及可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶的上述生物学活性被广泛应用于依赖双链核酸分子缺口的链置换反应，并且，该链置换反应原理被广泛应用于多种恒温扩增技术，如SDA、EXPAR等。例如，在缺口内切酶(或：可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶)和具有链置换活性DNA聚合酶的共同作用下，具有3'-OH的核酸分子从缺口处3'-OH开始延伸反应，同时，其延伸合成的新生核酸链将下游的旧链剥离。因链延伸而被封闭的缺口可以在缺口内切酶(或：可识别半切割半修饰RESR的限制性内切酶)的作用下重复产生，从而使得“切割-延伸-链置换”的过程能够重复进行，并在此过程中，以线性或指数方式不断剥离或释放出与下游旧链序列相同的单链核酸分子(WalkerGT,etal.Stranddisplacementamplification--anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique.NucleicAcidsRes.1992；20(7):1691-6.WalkerGT,etal.Stranddisplacementamplification--anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique.NucleicAcidsRes.1992；20(7):1691-6.VanNessJ,etal.Isothermalreactionsfortheamplificationofoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA.2003；100(8):4504-9.ShiC,etal.Exponentialstrand-displacementamplificationfordetectionofmicroRNAs.AnalChem.2014；86(1):336-9)。

VanNessJ等在2003年通过联用缺口内切酶和DNA聚合酶，建立了一种能够以指数形式扩增寡核苷酸片段的恒温扩增技术，该技术被称为EXPAR(VanNessJ,etal.Isothermalreactionsfortheamplificationofoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA.2003；100(8):4504-9)。相对于已有的恒温扩增技术，该技术具有十分高的扩增效率和检测灵敏度，能够在几分钟内实现靶分子的10⁶扩增，相关专利见WIPO(NO.WO2004067726)及美国专利(No.US60/443，65229.01.2003)。相关研究者在此基础上，通过技术改良，将该技术进一步用于纳米金、薄层层析快速检测等领域(RoskosK,etal.SimplesystemforisothermalDNAamplificationcoupledtolateralflowdetection.PLoSOne.2013Jul26；8(7):e69355；TanE,IsothermalDNAamplificationcoupledwithDNAnanosphere-basedcolorimetricdetection.AnalChem.2005Dec15；77(24):7984-92)。

EXPAR原型设计及在此基础上发展起来的相关技术中，为了实现指数扩增，缺口内切酶的NERS反义链序列两侧的核苷酸序列基本完全相同，并且，用于扩增寡核苷酸片段的模板是单纯线性核酸分子(VanNessJ,etal.Isothermalreactionsfortheamplificationofoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA.2003；100(8):4504-9)。此原理存在的主要缺陷在于，只有当引物与NERS反义链序列的3'-端核苷酸序列互补结合时，才能触发线性或指数扩增。但是，NERS反义链序列两侧的核苷酸序列基本完全相同，因此，引物与NERS反义链序列5'-和3'-端两侧核苷酸序列的互补结合是一种随机事件，这种随机性势必会影响该体系的扩增效率，从而影响整个检测系统的检测灵敏度，最终降低该技术在生物科学领域的实际应用价值。此外，包括EXPAR在内的多种恒温扩增技术(如：LAMP、RCA)往往只能检测单种靶分子，并且，检测手段主要依靠凝胶电泳或DNA非特异性染料(如：SYBRGreen)，或者，依赖于其它技术手段，如DNA质谱技术。上述技术瓶颈在一定程度上限制了现有恒温扩增技术的应用价值，特别是在需要尽可能实现靶分子多重检测的生命科学领域，例如感染性病原体和miRNA的检测。可见，如何提高靶分子与NERS反义链序列3'-端序列的特异性结合，以及实现靶分子的多重检测，对于极大地拓展现有恒温扩增技术的应用领域具有重要实用价值。

发夹型寡核苷酸是一类具有亚稳定状态的茎环状短片段DNA序列，被广泛应用于生物医学检测的各个领域，如实时荧光PCR(MackayJ,etal.Real-timePCRfluorescentchemistries.MethodsMolBiol.2007；353:237-61)、杂交链反应(DirksRM,etal.Triggeredamplificationbyhybridizationchainreaction.ProcNatlAcadSciUSA.2004Oct26；101(43):15275-8)。发夹型寡核苷酸的最大特征在于其分子内杂交双链的热稳定性，同时，可在其茎状结构末端的互补碱基对分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，从而实现靶分子特异性的多重荧光检测，其典型应用代表包括分子信标(TyagiS,etal.Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization.NatBiotechnol.1996；14:303-8)、发夹式引物(NazarenkoIA,etal.AclosedtubeformatforamplificationanddetectionofDNAbasedonenergytransfer.NucleicAcidsRes.1997；25:2516-21)、蝎形引物(WhitcombeD,etal.DetectionofPCRproductsusingself-probingampliconsandfluorescence.NatBiotechnol.1999Aug；17(8):804-7)。例如，发夹式引物和分子信标基础上演变而来的蝎形引物由两部分构成，分别是3'-端的引物序列区和5'-端具有分子信标结构与特性的探针序列区，引物序列区与探针序列区之间用延伸阻断剂(extensionblocker)连接，以阻止PCR产物沿探针序列延伸。探针序列区呈亚稳定状态的茎环结构。在游离状态时，探针序列区茎部结构的5'-末端和3'-末端分别标记的荧光报告基因和淬灭基团在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)作用下不产生荧光信号。在引物延伸阶段，探针序列区的环状序列与引物的3'-末端延伸产物形成分子内杂交双链，从而使原有的茎部结构被破坏而释放荧光信号(DetectionofPCRproductsusingself-probingampliconsandfluorescence.NatBiotechnol.1999Aug；17(8):804-7.MackayJ,etal.Real-timePCRfluorescentchemistries.MethodsMolBiol.2007；353:237-61)。

由上可见，如果能将发夹型寡核酸的热稳定性、基于荧光标记的多重检测特性揉合至恒温扩增技术，就可创建出一种新型的恒温扩增技术，提高扩增特异性，实现靶分子的多重并行检测，极大地拓展现有恒温扩增技术的应用领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于荧光标记寡核苷酸模板的恒温扩增系统，该系统可在恒定温度条件下，可根据荧光信号的种类和丰度分别实现不同核酸靶分子的定性和定量检测。

为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：

⑴实时荧光恒温指数扩增方法，反应混合物包括以下反应成分：

①具有3'-OH，具有核酸靶分子特异性的靶分子特异性寡核苷酸；

②标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且具有缺口剂识别序列的信号扩增模板寡核苷酸；

③DNA聚合酶；

④识别信号扩增模板寡核苷酸缺口剂识别序列的缺口剂；

⑤三磷酸脱氧核苷酸；

⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应。

靶分子特异性寡核苷酸(targetspecificoligonucleotide,ODN_TS)是具有3'-端羟基(3'-hydroxylgroup，3'-OH)的寡核苷酸(oligonucleotide，ODN)，该寡核苷酸具有核酸靶分子特异性，其种类和丰度可直接表征核酸靶分子的种类和丰度，在本发明所述实时荧光恒温指数扩增反应体系中的作用相当于现有核酸扩增技术中的引物。

信号扩增模板(signalamplificationtemplate,T_SA)是标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，在本发明所述实时荧光恒温指数扩增反应体系中的作用是通过其释放的荧光信号种类和强度分别判断的ODN_TS类别和丰度。

DNA聚合酶(DNApolymerase)具有链置换活性，同时缺乏5'→3'外切酶活性，可加入提高DNA聚合酶链置换活性的链置换促进剂。

缺口剂(nickingagent,NA)被用于识别和切割T_SA寡核苷酸缺口剂识别序列(nickingagentrecognitionsequences,NARS)。当T_SA寡核苷酸的缺口剂识别序列是缺口内切酶识别序列(nickingendonucleaserecognitionsequences,NERS)时，所用缺口剂是识别该缺口内切酶识别序列的缺口内切酶；当T_SA寡核苷酸的缺口剂识别序列是半修饰限制性内切酶识别序列(restrictionendonucleaserecognitionsequences,RERS)时，所用缺口剂是识别该半修饰RERS的限制性内切酶。

三磷酸脱氧核苷酸，通常包括dCTP、dGTP、dTTP或dATP，在生物DNA合成，以及DNA聚合酶介导的链延伸反应中起原料作用。

满足DNA聚合酶和缺口剂生物学活性功能的离子与缓冲体系。

本发明的原理和有益效果为：在没有的ODN_TS条件下，T_SA的荧光报告基团和荧光淬灭基团距离极近，因荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)作用，荧光报告基团不发生荧光。但是，当存在ODN_TS的条件下，可在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，T_SA结构区解体，荧光报告基团与荧光淬灭基团的距离增大，FRET作用减弱或被破坏，荧光报告基团释放荧光信号。可见，可通过T_SA释放的荧光信号种类和强度分别判断的ODN_TS类别和丰度，最终实现核酸靶分子的定性和/或定量检测。同时，由于T_SA具有特殊的结构区，从而使ODN_TS只能与T_SA的特定区域特异性结合，从而充分保证反应体系的特异性。

进一步，所述的DNA聚合酶是具有链替换活性的DNA聚合酶；

或者，DNA聚合酶不具有链替换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子；

或者，DNA聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶；

或者，DNA聚合酶是DNA依赖性DNA聚合酶。

进一步，所述的信号扩增模板寡核苷酸包括硫代碱基、锁核酸或肽核酸的衍生核苷酸。

所述的T_SA寡核苷酸第一区核苷酸序列可以含有与ODN_TS3'-末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸。

进一步，所述的信号扩增模板寡核苷酸的荧光报告基团包括羧基荧光素、六氯荧光素、四氯荧光素、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素、吲哚二羧菁、TAMRA或ROX；所述的信号扩增模板寡核苷酸的荧光淬灭基团包括TAMRA或ROX荧光淬灭剂和BHQ1、BHQ2非荧光淬灭剂；

所述的信号扩增模板寡核苷酸的延伸阻断剂包括聚六乙二醇或C3(三个碳原子的碳链)。

进一步，所述的恒温的反应温度范围为16-70℃。

进一步，所述的恒温的反应温度为37℃、55℃、60℃或65℃。

进一步，所述的反应时间为5-60min。

进一步，所述的反应时间为10min、20min、30min或40min。

进一步，所述的信号扩增模板寡核苷酸通过其3'-末端以物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质的表面；

或者，所述的信号扩增模板寡核苷酸通过其5'-末端以物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质的表面。

进一步，所述的靶分子特异性寡核苷酸长度为10～40nt，例如单链核酸分子的限制性内切酶酶切产物的5'-端片段。

进一步，所述的靶分子特异性寡核苷酸是具有3'-OH的天然存在的小片段核酸分子。

⑵所述的信号扩增模板是具有“茎-环-尾”结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

①第一区，其核苷酸序列与靶分子特异性寡核苷酸核苷酸序列部分或完全互补；

②缺口剂识别序列反义链序列区；

③第二区，其核苷酸序列与第一区核苷酸序列部分或完全相同；

④延伸阻断区；

⑤环区；

⑥第三区，其核苷酸序列与第二区核苷酸序列部分互补或完全相同，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团；第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光淬灭基团；

或者，第三区，其5'-末端碱基标记荧光淬灭基团；第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光报告基团。

⑶所述的信号扩增模板是具有“茎-环-尾”结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

①第一区，其核苷酸序列与靶分子特异性寡核苷酸序列部分或完全互补；

②缺口剂识别序列反义链序列区；

④环区，其核苷酸序列含有限制性内切酶识别序列；

或者，其核苷酸序列含有切口剂识别序列正义链序列；

⑤第三区，其核苷酸序列与第二区核苷酸序列部分互补或完全相同，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团；第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基标记荧光淬灭基团；

或者第三区5'-末端碱基标记荧光淬灭基团；第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基标记荧光报告基团。

⑷所述的信号扩增模板是具有线性结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

①第一区，其核苷酸序列与靶分子特异性寡核苷酸部分或完全互补；

②缺口剂识别序列反义链序列区；

③第二区，其核苷酸序列与第一区核苷酸序列部分或完全相同。

④限制性内切酶识别序列区，并且，在限制性内切酶识别序列酶切位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团；

或者在限制性内切酶识别序列酶切位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光淬灭基团和荧光报告基团。

⑸所述的信号扩增模板是具有线性结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

②缺口剂识别序列反义链序列区；

④缺口剂识别序列正义链序列区，并且，在缺口剂识别序列切割位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团；

或者，在缺口剂识别序列切割位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光淬灭基团和荧光报告基团。

上述⑴的反应混合物：具有3'-OH的寡核苷酸具有核酸靶分子特异性，在本发明中被称为靶分子特异性寡核苷酸(targetspecificODN，ODN_TS；图1中所示寡核苷酸ODN_TS)，其作用相当于现有核酸扩增技术中的引物。

上述⑵的反应混合物：具有“茎-环-尾”结构的寡核苷酸片段是信号扩增模板(signalamplificationtemplate,T_SA)，其3'-端至5'-端(3'-5')的核苷酸序列组成特征依次为(图1A)：①第一区(thefirstregion，R₁)，其核苷酸序列与ODN_TS核苷酸序列部分(或：完全)互补；②缺口剂识别序列(nickingagentrecognitionsequences，NARS)反义链序列区；③第二区(thesecondregion，R₂)，其核苷酸序列与第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同，并且，第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光淬灭基团；④延伸阻断区，该区含有延伸阻断剂(extensionblocker)；⑤环区(loopregion，R_L)；⑥第三区(thethirdregion，R₃)，其核苷酸序列与第二区核苷酸序列部分(或：完全)互补，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团。

在没有ODN_TS的条件下，由于分子内链杂交优势，T_SA寡核苷酸的第二区与第三区核苷酸序列互补形成分子内茎状结构区(图1A所示R_S)，此时，荧光报告基团与荧光淬灭基团距离极近，因FRET作用，荧光报告基团不发生荧光(图1A)。但是，在适当条件下，如高温变性(图1B)，T_SA的茎环状结构解体，转变成单纯线性单链DNA(singstrandDNA，ssDNA)，荧光报告基团与荧光淬灭基团的距离增大，FRET作用减弱或被破坏，荧光报告基团释放荧光信号；或者，当存在ODN_TS的条件下(图1C)，可在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，寡核苷酸延伸产物置换T_SA茎状结构第三区，T_SA寡核苷酸原有的茎状结构解体，荧光报告基团与淬灭基团的距离增大，FRET作用减弱或被破坏，荧光报告基团释放荧光信号(图1D)。

尽管T_SA寡核苷酸的第三区与第一区存在部分互补的核苷酸，但是，由于环区的存在，导致T_SA寡核苷酸的第三区与第二区形成分子内茎状结构的热动力学稳定性更高，从而确保ODN_TS能够特异性地与T_SA寡核苷酸的第一区互补杂交。

另外，T_SA寡核苷酸的第二区序列可部分延展至本发明⑵所述环区序列(图2(1))。所述环区包含了部分第二区序列，但是，延伸阻断区仍然位于环区与第二区之间(图2(1))。T_SA寡核苷酸的热动力学稳定性可确保T_SA寡核苷酸的第三区只与第二区形成稳定的分子内茎状结构，从而进一步提高T_SA寡核苷酸的“茎-状-尾”结构的热动力学稳定性，确保ODN_TS能够特异性地与T_SA寡核苷酸的第一区互补杂交(图2(2))。

通常情况下，T_SA寡核苷酸的荧光报告基团和荧光淬灭基团可互换(例如：第三区，其核苷酸序列与第二区核苷酸序列部分互补，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团；第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光淬灭基团；互换后为，第三区5'-末端碱基标记荧光淬灭基团；第二区与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光报告基团)。

T_SA寡核苷酸的荧光报告基团和荧光淬灭基团也可标记于茎状结构的其它互补碱基对，具有茎状结构时，荧光报告基团不发生荧光。当ODN_TS延伸的新生核酸链置换T_SA第三区序列时，茎状结构解体，荧光报告基团产生荧光。

T_SA寡核苷酸的第一、第二、第三区长度具体不限，最适长度为10～40nt，T_SA寡核苷酸的环区长度具体不限，最适长度为4～20nt。T_SA寡核苷酸延伸阻断区的延伸阻断剂可阻止ODN_TS寡核苷酸的新生核酸分子链延伸至环区。

T_SA寡核苷酸的NARS可以是NERS，或者是半修饰RERS。当T_SA寡核苷酸的NRAS是NERS时，所用缺口剂是识别该NERS的缺口内切酶；当T_SA寡核苷酸的NARS是半修饰RERS时，所用缺口剂是识别该半修饰RERS的限制性内切酶。

将上述⑵反应混合物置于适当恒温条件下(如：65℃或37℃)反应一定时间，包括10～60分钟，根据T_SA寡核苷酸释放的荧光信号实现核酸靶分子的定性和/或定量检测(图3)：在没有ODN_TS的条件下，T_SA不释放荧光信号；同时，T_SA的茎状结构可有效阻止ODN_TS与其第二区序列的互补杂交，使ODN_TS只能与其第一区有效互补杂交(图3(1))；当ODN_TS存在的条件下(图3(2))，该ODN_TS与T_SA第一区互补杂交后(图3(3))，可在DNA聚合酶的作用下延伸，生成新生核酸链，并且，新生核酸链的延伸终止于T_SA的延伸阻断区(图3(4))。在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，上述新生核酸链的延伸会剥离T_SA茎状结构的第三区序列，使T_SA寡核苷酸酸的第三区和环区保持游离单链核酸分子状态，此时，T_SA的荧光报告基团与荧光淬灭基团的距离增大，FRET作用减弱或被破坏，荧光报告基团释放荧光信号(图3(4))。另一方面，在缺口剂的作用下，ODN_TS延伸的新生核酸链在T_SA寡核苷酸NARS反义链序列互补位置生成新生核酸链NARS正义链序列(图3(4))，缺口剂在NARS正义链序列的缺口位点(nickingsite，NS)切割新生核酸链(图3(5))，该缺口的5'-端新生核酸链的3'-末端具有可介导DNA链延伸的3'-OH(图3(5))。由于DNA聚合酶具有链置换活性，该缺口的新生核酸链延伸产物可置换前一轮合成的与T_SA第二区互补的新生核酸链(图3(5-6))，由于T_SA的第二区核苷酸序列与第一区部分或完全相同，该置换的下来的游离单链形式的新生核酸链(图3(6))与ODN_TS的核苷酸序列也部分或完全相同，并且，可以与ODN_TS一样与T_SA的第一区互补杂交，并有效介导新生核酸链的延伸(图3(1)(3)(6))。可见，在缺口剂和具有链置换活性的DNA聚合酶的共同作用下，本发明所述反应体系一方面能够以线性方式(图3(4)-(6))释放可介导T_SA寡核苷酸释放荧光信号的ODN_TS(图3(6))，并且，每一个新合成的ODN_TS均能再次进入上述线性扩增，并使一个T_SA释放荧光信号(图3(1)(3)(6))，最终实现的ODN_TS指数扩增(图3)。上述“切割-延伸-链置换”过程能够在恒温条件下重复进行，以指数形式扩增ODN_TS，并且，反应混合物中原有的每个ODN_TS及新扩增的每个ODN_TS寡核苷酸均能使一个T_SA寡核苷酸释放相应的荧光信号，最终实现靶分子的定性和/或定量检测。可针对不同核酸靶分子的ODN_TS，设计不同的T_SA寡核苷酸，并标记不同的荧光报告基团和荧光淬灭基团。将不同ODN_TS及其对应的T_SA置于同一个反应管、检测池或检测孔中，就可根据T_SA释放的荧光信号种类和丰度，在单个反应管、单个检测池或检测孔平行检测多种靶分子，实现靶分子的多重定性和/或定量检测。

上述⑶T_SA寡核苷酸是具有环区RERS序列的“茎-环-尾”结构寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成依次为(图4(1))：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与ODN_TS寡核苷酸序列部分(或：完全)互补；②NARS反义链序列区；③第二区(R₂)，其核苷酸序列与第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同，并且，与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基标记荧光淬灭基团；④环区(loopregion,R_L)，环区具有NARS正义链序列或RERS序列；⑤第三区(thethirdregion,R₃)，其核苷酸序列与第二区核苷酸序列部分(或：完全)互补，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团。反应混合物中还包括识别环区NARS或RERS序列的切口剂或限制性内切酶。在反应条件下，ODN_TS寡核苷酸以T_SA为模板，合成与T_SA完全互补的双链核酸分子(图4(1)-(3))。以RERS序列为列，此时，限制性内切酶在环区RERS序列的酶切位点切割该双链核酸分子的两条链，使T_SA释放荧光信号(图4(4))，同时，缺口剂在ODN_TS寡核苷酸延伸产物的NARS正义链序列的缺口位点切割，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增方式合成并释放新生寡核苷酸片段(图4(4)-(5))。该新生寡核苷酸与ODN_TS的核苷酸序列部分(或：完全)相同，可直接触发新的T_SA寡核苷酸进入重复进行的“切割-延伸-链置换”线性扩增方式，以指数形式扩增ODN_TS，并且，反应混合物中原有的每个ODN_TS及新扩增的每个ODN_TS寡核苷酸均能使一个T_SA寡核苷酸释放相应的荧光信号，最终实现靶分子的定性和/或定量检测。

尽管T_SA寡核苷酸的第三区与第一区存在部分互补的核苷酸，但是，由于环区的存在，导致T_SA寡核苷酸的第三区与第二区形成分子内茎状结构的热动力学稳定性更高，从而确保ODN_TS寡核苷酸能够特异性地与T_SA寡核苷酸的第一区互补杂交。

另外，在上述⑶的基础上T_SA寡核苷酸的第二区序列可部分延展至所述环区序列(图5(1))。T_SA的热动力学稳定性可确保T_SA寡核苷酸的第三区只与第二区形成稳定的分子内茎状结构，从而进一步提高T_SA寡核苷酸的“茎-状-尾”结构的稳定性，确保ODN_TS能够特异性地与T_SA寡核苷酸的第一区互补杂交(图5(2))。

上述⑷的T_SA是同时具有NARS反义链序列和RERS序列的单纯线性结构寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成依次为(图6(1))：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与ODN_TS寡核苷酸部分(或：完全)互补；②NARS反义链序列区；③第二区(R₂)，其核苷酸序列与第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同；④RERS序列区，并且，在RERS序列区酶切位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当RERS序列区处于完整状态时，其酶切位点5'-和3'-端碱基的荧光报告基团和荧光淬灭基团因FRET作用而使荧光报告基团不发生荧光。反应混合物中还包括识别RERS序列的限制性内切酶。在反应条件下，ODN_TS寡核苷酸以T_SA为模板，合成与T_SA完全互补的双链核酸分子(图6(1)-(3))。此时，限制性内切酶在RERS序列的酶切位点切断双链核酸分子，使T_SA释放荧光信号(图6(4))，同时，缺口剂在ODN_TS寡核苷酸延伸产物的NARS正义链序列的缺口位点切割新生核酸链(图6(4))，随后在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增方式合成并释放寡核苷酸片段(图6(5)-(6))。该新生寡核苷酸与ODN_TS的核苷酸序列部分(或：完全)相同，可直接触发新的T_SA寡核苷酸进入重复进行的“切割-延伸-链置换”线性扩增方式，以指数形式扩增ODN_TS，并且，反应混合物中原有的每个ODN_TS及新扩增的每个ODN_TS寡核苷酸均能使一个T_SA寡核苷酸释放相应的荧光信号，最终实现靶分子的定性和/或定量检测。

上述⑸的T_SA是同时具有一个NARS反义链序列和一个NARS正义链序列的单纯线性结构寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成依次为(图7(1))：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与ODN_TS寡核苷酸部分(或：完全)互补；②NARS反义链序列区；③第二区(R₂)，其核苷酸序列与第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同；④NARS正义链序列区，并且，在NARS序列缺口位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当T_SA的NARS正义链序列区处于完整状态时，其缺口位点5'-和3'-端碱基的荧光报告基团和荧光淬灭基团因FRET作用而使荧光报告基团不发生荧光。反应混合物中包括识别T_SA两个NARS序列的缺口剂。在反应条件下，ODN_TS寡核苷酸以T_SA为模板，合成与T_SA完全互补的双链核酸分子(图7(1)-(3))。此时，识别T_SA寡核苷酸NARS反义链序列区NARS的缺口剂在其缺口位点切割T_SA寡核苷酸，使T_SA释放荧光信号(图7(4))。同时，识别T_SA寡核苷酸NARS反义链序列区NARS的缺口剂在ODN_TS寡核苷酸延伸产物的NARS正义链序列的缺口位点切割新生DNA链(图7(4))，随后在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增方式合成并释放寡核苷酸片段(图7(5)-(6))。该新生寡核苷酸与ODN_TS的核苷酸序列部分(或：完全)相同，可直接触发新的T_SA寡核苷酸进入重复进行的“切割-延伸-链置换”线性扩增方式，以指数形式扩增ODN_TS，并且，反应混合物中原有的每个ODN_TS及新扩增的每个ODN_TS寡核苷酸均能使一个T_SA寡核苷酸释放相应的荧光信号，最终实现靶分子的定性和/或定量检测。

通常情况下，T_SA寡核苷酸的荧光报告基团和荧光淬灭基团可互换(例如：半修饰限制性内切酶识别序列区的5'-和3'-端碱基分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团；互换后为：在半修饰限制性内切酶识别序列酶切位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光淬灭基团和荧光报告基团。

上述发明⑵、⑶、⑷或⑸的T_SA寡核苷酸还可以通过其3'-端、5'-端或中间碱基以物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质的表面，从而可通过固相基质表面释放的荧光信号种类和丰度实现靶分子的定性和/或定量检测。

⑹实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的制备方法，反应混合物包括以下反应成分：

①天然存在缺口内切酶识别序列正义链序列的核酸靶分子；

②信号产生模板(signalproductiontemplate,T_SP)寡核苷酸；

③DNA聚合酶；

④识别核酸靶分子缺口内切酶识别序列的缺口内切酶；

⑤三磷酸脱氧核苷酸，包括dCTP、dGTP、dTTP、dATP；

⑥满足上述DNA聚合酶和缺口内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应，得到替代实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增产物。

进一步，靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：所述的T_SP寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

①第一区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分或完全互补；

②缺口内切酶识别序列反义链序列区，其核苷酸序列与核酸靶分子的缺口内切酶识别序列正义链序列部分或完全互补；

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分或完全互补，且与实时荧光恒温指数扩增方法的信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

进一步，所述的T_SP寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列无同源性，但是，与实时荧光恒温指数扩增方法的信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

⑺实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的制备方法，反应混合物包括以下反应成分：

①天然存在两个邻近缺口内切酶识别序列正义链序列的核酸靶分子；

②DNA聚合酶；

③识别核酸靶分子缺口内切酶识别序列的缺口内切酶，；

④三磷酸脱氧核苷酸；

⑤满足上述DNA聚合酶和缺口内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应时间；得到替代实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增产物。

⑻实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的制备方法，反应混合物包括以下反应成分：

①半修饰限制性内切酶识别序列正义链序列的核酸靶分子；

②信号产生模板寡核苷酸；

③DNA聚合酶；

④识别核酸靶分子半修饰限制性内切酶识别序列的限制性内切酶；

⑤三磷酸脱氧核苷酸；

⑥满足上述DNA聚合酶和限制性内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应；得到替代实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增产物。

进一步，信号产生模板寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

②半修饰限制性内切酶识别反义链序列区，其核苷酸序列与核酸靶分子的半修饰限制性内切酶识别序列正义链序列部分或完全互补；

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分或完全互补，且与实时荧光恒温指数扩增方法所述信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

进一步，所述的信号产生模板寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

②半修饰限制性内切酶识别反义链序列区，其核苷酸序列与核酸靶分子的半修饰限制性内切酶识别序列正义链序列部分或完全互补。

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列无同源性，且与实时荧光恒温指数扩增方法所述信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

⑼实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的制备方法，反应混合物包括以下反应成分：

①天然存在半修饰限制性内切酶识别序列的单链核酸靶分子；

②识别单链核酸靶分子半修饰限制性内切酶识别序列的限制性内切酶；

③三磷酸脱氧核苷酸；

④满足上述DNA聚合酶和限制性内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；

⑽实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的制备方法，反应混合物包括以下反应成分：

①天然存在的核酸靶分子；

②四条引物：P₁、P₂、P₃和P₄引物，且四条引物具有以下特征：

P₁和P₂引物5'-3'方向核苷酸序列依次为：靶分子特异性寡核苷酸部分或完全互补区，其核苷酸序列与实时荧光恒温指数扩增方法中所述靶分子特异性寡核苷酸序列部分或完全互补；

③缺口剂识别序列反义链序列区；

核酸靶分子互补结合区，且P₁引物的核苷酸序列与核酸靶分子的反义链序列部分或完全互补，P₂引物的核苷酸序列与核酸靶分子的正义链序列部分或完全互补；

P₃引物和P₄引物分别与核酸靶分子的反义链和正义链序列部分或完全互补；

P₁引物与核酸靶分子反义链序列的互补结合位置位于P₃引物与核酸靶分子反义链序列的互补结合位置的3'-端；

P₂引物与核酸靶分子反义链序列的互补结合位置位于P₄引物与核酸靶分子反义链序列的互补结合位置的3'-端；

④DNA聚合酶；

识别P₁和P₂引物缺口剂识别序列的缺口剂，缺口剂为缺口内切酶和/或限制性内切酶；

⑤磷酸脱氧核苷酸，包括dCTP、dGTP、dTTP和dATP；

进一步，P₁引物只有核酸靶分子互补结合区，或者，P₂引物只有核酸靶分子互补结合区。

天然存在且具有3'-OH的小片段核酸分子，包括微小RNA(microRNA，miRNA)，核酸靶分子可直接用作上述⑴中的ODN_TS。

上述⑹的反应混合物包括以下反应成分，天然存在NERS正义链序列的核酸靶分子，包括mRNA或cDNA。可用核酸靶分子、T_SP寡核苷酸直接替代上述⑴⑵⑶⑷⑸中的ODN_TS(图8)，并且，核酸靶分子的NERS可与上述⑴⑵⑶⑷⑸中T_SA寡核苷酸的NARS相同或不相同，当二者不同时，在本上述⑴⑵⑶⑷⑸中反应混合物中增加识别核酸靶分子NERS的缺口内切酶。T_SP寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次为：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分(或：完全)互补；②NERS反义链序列区；③第二区(R₂)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分(或：完全)互补，同时，又与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同。在反应条件下，T_SP寡核苷酸与核酸靶分子互补杂交形成双链核酸分子(图8(1))，此时，识别核酸靶分子NERS的缺口内切酶在缺口位点切割核酸靶分子(图8(2))，缺口5'-端核酸链在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，以T_SP寡核苷酸为模板，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增方式合成并释放T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列互补的寡核苷酸(图8(3)-(5))。该寡核苷酸片段(图8(5))与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)互补，并带有3'-OH，因此，可直接替代上述发明⑴⑵⑶⑷⑸中的ODN_TS，触发恒温指数扩增。

另外，T_SP寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次还可以是(图9)：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分(或：完全)互补；②NERS反义链序列区；③第二区(R₂)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列无同源性，但是，与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同。在此实施方式中，T_SP寡核苷酸的第一区及NERS反义链序列区与核酸靶分子互补杂交形成双链核酸分子(图9(1))，随后，缺口内切酶在缺口位点切割核酸靶分子(图9(2))，缺口5'-端核酸链在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，以T_SP寡核苷酸为模板，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增合成并释放T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列互补的寡核苷酸(图9(3)-(5))。该寡核苷酸片段(图9(5))与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)互补，并带有3'-OH，因此，可直接替代上述⑴⑵⑶⑷⑸中的ODN_TS，触发上述发明⑴⑵⑶⑷⑸恒温指数扩增。此种方式的具体应用优势在于，针对不同的核酸靶分子，设计完全相同的T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列，从而使上述发明⑴⑵⑶⑷⑸恒温指数扩增检测系统具有通用性，可用于不同核酸靶分子的检测。或者，针对不同的核酸靶分子，易于设计不同的、但具有相同热动力学杂交特征的T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列，从而使不同靶分子的恒温指数扩增检测系统具有均一的热动力学特征，有效提高整个检测系统的有效性。

上述⑹中的核酸靶分子、T_SP寡核苷酸直接替代上述⑴的ODN_TS，同时，反应混合物中增加识别核酸靶分子NERS的缺口内切酶。

也可单独制备本上述⑹放入ODN_TS寡核苷酸。主要实施步骤包括：①制备包括以下成分的反应混合物：核酸靶分子、T_SP寡核苷酸、识别核酸靶分子NERS的缺口内切酶、具有链置换活性的DNA聚合酶、dNTPs、满足DNA聚合酶和缺口剂生物学活性功能的离子与缓冲体系；②将上述反应混合物置于适当恒温条件下(如：37℃或65℃)反应一定时间，通常为10～60分钟；③直接将扩增产物替代实时荧光恒温指数扩增方法的ODN_TS，或者，将扩增产物纯化后替代实时荧光恒温指数扩增方法的ODN_TS。

上述⑺，天然存在两个邻近NERS正义链序列的核酸靶分子，包括人类、动物、植物或微生物基因组DNA。可用核酸靶分子直接替代上述⑴的ODN_TS(图10)，并且，核酸靶分子的两个邻近NERS可相同或不相同，并且，可与本发明⑴⑵⑶⑷⑸的NARS相同或不相同。当核酸靶分子的NERS与本发明⑴⑵⑶⑷⑸的NARS不同时，在所述反应混合物中增加可识别核酸靶分子NERS的缺口内切酶。在所述反应体系，缺口内切酶在核酸靶分子两个邻近NERS缺口位点切割核酸靶分子(图10(2))，两个缺口的5'-端均在DNA聚合酶的作用下以线性方式合成并释放两个邻近NERS之间的寡核苷酸(图10(2))，该寡核苷酸可直接替代实时荧光恒温指数扩增方法的ODN_TS，触发恒温扩增系统。

上述⑻，天然存在半修饰RERS正义链序列的核酸靶分子，包括mRNA或cDNA。可用核酸靶分子、T_SP寡核苷酸直接替代上述⑴的ODN_TS(图4)，并且，核酸靶分子的RERS可与上述⑴⑵⑶⑷⑸的T_SA寡核苷酸NARS相同或不相同。当核酸靶分子的RERS与上述⑴⑵⑶⑷⑸所述T_SA寡核苷酸NARS不相同时，所述反应混合物中增加识别核酸靶分子RERS的限制性内切酶。T_SP寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次为：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分(或：完全)互补；②半修饰RERS反义链序列区；③第二区(R₂)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分(或：完全)互补，同时，又与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同。在上述(2)所述反应条件下，T_SP寡核苷酸与核酸靶分子互补杂交形成双链核酸分子(图8(1))，此时，识别核酸靶分子RERS的限制性内切酶在缺口位点切割核酸靶分子(图8(2))，缺口5'-端核酸链在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，以T_SP寡核苷酸为模板，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增方式合成并释放T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列互补的寡核苷酸(图8(3)-(5))。该寡核苷酸片段(图8(5))与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)互补，并带有3'-OH，因此，可直接替代上述(1)所述ODN_TS，触发恒温指数扩增。

另外。T_SP寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次还可以是(图9)：①第一区(R₁)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分(或：完全)互补的；②半修饰RERS反义链序列序列区；③第一区(R₁)，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列无同源性，但是，与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)相同。在此实施方式中，T_SP寡核苷酸的第一区及RERS反义链序列区与核酸靶分子互补杂交形成双链核酸分子(图9(1))，随后，缺口内切酶在缺口位点切割核酸靶分子(图9(2))，缺口5'-端核酸链在具有链置换活性DNA聚合酶的作用下，以T_SP寡核苷酸为模板，以重复进行的“切割-延伸-链置换”的线性扩增合成并释放T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列互补的寡核苷酸(图9(3)-(5))。该寡核苷酸片段(图9(5))与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)互补，并带有3'-OH，因此，可直接替代上述⑴所述ODN_TS，触发恒温指数扩增。此方法的具体应用优势在于，针对不同的核酸靶分子，设计完全相同的T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列，从而使恒温指数扩增检测系统具有通用性，可用于不同核酸靶分子的检测。或者，针对不同的核酸靶分子，易于设计不同的、但具有相同热动力学杂交特征的T_SP寡核苷酸第二区核苷酸序列，从而使不同靶分子恒温指数扩增检测系统具有均一的热动力学特征，有效提高整个检测系统的有效性。

上述⑻中的半修饰RERS反义链序列是指该序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：α巯基-脱氧核苷酸(α-thiodeoxynucleotide)，并且，该衍生核苷酸可阻止能够识别该RERS的限制性内切酶切割含有此衍生核苷酸的核酸分子链。

上述⑻所述核酸靶分子、T_SP寡核苷酸直接替代上述⑴的ODN_TS，同时，反应混合物中增加识别核酸靶分子RERS的限制性内切酶。

另外，可单独制备上述⑻所述ODN_TS寡核苷酸。主要实施步骤包括：①制备包括以下成分的反应混合物：核酸靶分子、T_SP寡核苷酸、识别核酸靶分子半修饰NERS正义链序列的限制性内切酶、具有链置换活性的DNA聚合酶、dNTPs、满足DNA聚合酶和限制性内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；②将上述反应混合物置于适当恒温条件下(如：37℃或65℃)反应一定时间，通常为10～60分钟；③直接将扩增产物替代上述⑴所述ODN_TS，或者，将扩增产物纯化后替代上述⑴所述ODN_TS。

上述⑻，天然存在RERS的单链核酸靶分子，包括mRNA或cDNA。可采用能够识别并切割单链核酸分子的限制性内切酶，如HhaI。RERS缺口的5'-端序列可直接替代上述⑴的ODN_TS，且RERS缺口的5'-端序列的3'-端核苷酸序列与T_SA寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分(或：完全)互补，且互补核苷酸最优长度在10～40bp之间。

上述⑻所述单链核酸靶分子直接替代上述⑴所述ODN_TS，同时，在本发明⑴所述的反应混合物中增加识别核酸靶分子RERS的限制性内切酶。

也可单独制备上述⑼所述寡核苷酸，然后，直接将酶切产物替代上述⑴所述ODN_TS，或者，用酶切纯化产物替代上述⑴所述ODN_TS。

上述⑻的可识别单链核酸分子RERS的限制性内切酶包括XcmI、HhaI、HinP1I、MnlI、HaeIII、BstNI、DdeI、HgaI、HinfI、Taq^αI、MboI、HpaII、AluI、Sau3A或AccI。

上述⑼天然存在的核酸分子包括人类基因组DNA、细菌基因组DNA、mRNA等。可设计四条引物制备能够特异性代表上述核酸靶分子的上述⑴所述ODN_TS寡核苷酸(图11)。

四条引物分别称为P₁、P₂、P₃和P₄引物，两条引物P1和P3分别靶向核酸靶分子的正义链，其中，P₁引物与靶分子反义链的互补杂交位置位于P₃引物与靶分子反义链的互补杂交位置的3'-端，且二者与靶分子反义链的互补杂交位点不存在重叠区域(图11(1))。另外两条引物P2、P4分别靶向核酸靶分子的反义链，其中，P₂的引物与靶分子正义链的互补杂交位置位于P₃引物与靶分子正义链的互补杂交位置的3'-端，且二者与靶分子反义链的互补杂交位点不存在重叠区域(图11(1))。

位于外侧的P₃和P₄引物与核酸靶分子部分(或：完全)互补。P₁和P₂引物5'-3'方向核苷酸序列依次为：①ODN_TS部分(或：完全)互补区，其核苷酸序列与上述(1)所述ODN_TS寡核苷酸部分(或：完全)互补；②NARS反义链序列区；③核酸靶分子互补结合区，其核苷酸序列与核酸靶分子部分(或：完全)互补(图11(1))。

通过以下技术方案制备上述(1)的ODN_TS寡核苷酸：①制备主要包括以下主要成分的反应混合物—核酸靶分子、P₁、P₂、P₃和P₄引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、识别P₁和P₂引物NARS的缺口剂、dNTPs；②将上述反应混合物置于恒定温度条件下反应一定时间(如：10～60分钟)，反应体系以重复进行的“切割-延伸-链置换”线性方式扩增和制备上述⑴的ODN_TS寡核苷酸，P₃和P₁引物与核酸靶分子的反义链互补杂交，并在DNA聚合酶的作用下延伸，在延伸过程中，P₃引物延伸的新生核酸链置换P₁引物延伸的新生核酸链，使P₁引物新生核酸链被剥离成单链核酸分子(图11(2))；随后，P₄和P₂引物与P₁引物的新生单链核酸分子互补杂交，并在DNA聚合酶的作用下延伸，在延伸过程中，P₄引物延伸的新生核酸链置换P₂引物延伸的新生核酸链，使P₁引物新生核酸链转被剥离成单链核酸分子，并且，该新生单链核酸分子没有引物P₃的结合位点(图11(3))；随后，引物P₁与上述引物P₂的新生单链核酸分子互补杂交(图11(3))，由于P₁引物及上述P₂引物的新生单链核酸分子均具有3'-OH，因此，二者均会延伸合成新生核酸链，并最终生成两末端是ODN_TS寡核苷酸及其互补序列的双链核酸分子，并在新生核酸链中与P₁和P₂引物NARS反义链序列对应位置生成NARS正义链序列(图7(4))；随后，在DNA聚合酶和缺口剂的共同作用下，以以重复进行的“切割-延伸-链置换”线性扩增方式合成并释放上述⑴的ODN_TS寡核苷酸(图7(4)-(5))。与上述相似，上述⑴的ODN_TS寡核苷酸的合成与释放也同时以P₄和P₂引物与核酸靶分子的正义链互补杂交来启动，其原理和步骤与上述相似。在此实施方式中，每一个完整的核酸靶分子(图7(4))可在每单次“切割-延伸-链置换”过程中产生两个上述⑴的ODN_TS寡核苷酸。

P₁和P₂引物的NARS序列可以相同或不相同。

P₁和P₂引物的NARS序列可以与上述发明⑴⑵⑶⑷⑸所述NARS相同或不相同。

核酸靶分子、P₁、P₂、P₃和P₄引物直接替代上述⑴的ODN_TS，同时，如果P₁和P₂引物的NARS与发明⑴⑵⑶⑷⑸的NARS不相同时，反应混合物中增加可识别P₁和P₂引物NARS的缺口剂。

P₁或P₂引物中，只有一条引物具有ODN_TS部分(或：完全)互补区和NARS反义链序列区。每一个完整的核酸靶分子可在每单次“切割-延伸-链置换”过程中仅产生一个上述⑴的ODN_TS寡核苷酸。

可按照单独制备上述⑴所述ODN_TS寡核苷酸，然后，将扩增产物直接替代上述⑴的ODN_TS，或者，将扩增产物纯化后替代上述⑴的ODN_TS。

为了进一步提高ODN_TS与T_SA寡核苷酸的扩增特异性，以及进一步提高核酸靶分子与T_SP寡核苷酸的扩增特异性，可在T_SA和/或T_SP中进一步采用包括硫代碱基、锁核酸(lockednucleicacids，LNA)和肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)等在内的衍生核苷酸。或者，可在T_SA第一区设计与ODN_TS寡核苷酸3'-末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸。例如：ODN_TS寡核苷酸3'-端碱基为5'-GGATGC-3'，T_SA第一区的互补碱基可设计为3'-CCTAAG-5'，其中，加下划线碱基与ODN_TS寡核苷酸3'-末端倒数第二位碱基错配。

T_SA和T_SP寡核苷酸的3'-OH可封闭或不封闭。例如，在T_SA和/或T_SP寡核苷酸3'-末端修饰磷酸基团，使其3'-OH被封闭，从而使其不能作为引物延伸合成新生核酸链。

所述荧光报告基团包括羧基荧光素(6-FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA和ROX，以及其它荧光分子或发光基团；荧光淬灭基团包括荧光类淬灭剂(如：TAMRA、ROX)和非荧光类淬灭剂(如：DABCYL，BHQ1，BHQ2)；延伸阻断剂包括聚六乙二醇(HEG)、C3(三个碳原子的碳链)等，可以阻止ODN_TS寡核苷酸新生DNA链的延伸。

荧光报告基团和荧光淬灭基团的位置可互换(例如：将上述⑴替换为上述⑵的T_SA寡核苷酸5'-末端标记荧光淬灭基团，茎部结构对应的互补碱基标记荧光报告基团)，该互换并不影响结果的判断。上述⑵和上述⑶的T_SA寡核苷酸的荧光报告基团和荧光淬灭基团可标记于茎状结构的其它互补碱基对，在T_SA具有茎状结构时，荧光报告基团不发生荧光，而当ODN_TS延伸的新生核酸链替代T_SA寡核苷酸第三区核苷酸序列时，茎状结构解体，荧光报告基团产生荧光。例如，在T_SA寡核苷酸茎状结构中间位置任意互补碱基对分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。可在T_SA寡核苷酸的适当位置引入两个或以上的荧光报告基团和/或淬灭基团，以提高荧光报告基团的荧光强度。

ODN_TS寡核苷酸理想长度为10～40nt，或者，是大于40nt的单链核酸分子，例如单链核酸分子的限制性内切酶酶切产物的5'-端片段。

可使用不具备链置换活性的DNA聚合酶，包括(但并不限于)T4DNAPolymerase、Phi29DNAPolymerase。需要在上述⑴的反应混合物中加入链置换促进剂(stranddisplacementfacilitator)。链置换促进剂是在核酸分子3'-端延伸过程中，使其延伸链置换其后续核酸链的生物活性分子，包括腺病毒DNA结合蛋白、单链DNA结合蛋白、海藻糖等。

可使用具有5'→3'外切酶活性的DNA聚合酶。合成的寡核苷酸片段足够短，当其被切割后，能够自动地从T_SA或T_SP寡核苷酸模板解离。

如果缺口剂是切割DNA-RNA双链核酸分子的DNA链，所用DNA聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase)。如果缺口剂是切割DNA-RNA双链核酸分子的RNA链，所用DNA聚合酶是DNA依赖性DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase)，例如禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AvianMyeloblastosisvirusreversetranscriptase)。如果靶分子是mRNA，无需将其逆转录成cDNA，可直接将其应用。

可识别并切割NERS正义链序列的缺口内切酶包括Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nb.BspQI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BstI、Nb.AlwI、Nb.BsmAI或Nt.CviPII。

可识别并切割半修饰RERS正义链序列的限制性内切酶包括AvaI、BslI、BsoBI、BsrI、BstNI、Fnu4HI、HincII、NciI。

缺口剂可识别DNA-RNA双链核酸分子的核苷酸序列，并切割双链核酸分子中的一条链。

缺口剂可识别RNA双链核酸分子的核苷酸序列，并切割双链核酸分子中的一条链。

名词解释：

“核酸”或“核酸分子”是指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、RNA或DNA的多聚核苷酸及其类似物、RNA或DNA的寡核苷酸及其类似物、聚合酶链反应(PCR)或其它技术制备的核酸产物、信使RNA(messengerRNA，mRNA)、互补DNA(complementaryDNA，cDNA)、非编码RNA分子(如：microRNA或miRNA)、经过修饰的核酸(例如：重亚硫酸盐修饰的基因组DNA)、各种限制内切酶或其它酶消化或酶切的核酸产物(例如：甲基化敏感限制性内切酶(methylation-sensitiverestrictionendonuclease，MSRE)的消化产物)、其它类似核酸片段。

“天然存在的核酸(naturallyoccurringnucleicacid)”是指在自然界存在的核酸分子，如：全长基因组DNA分子、mRNA分子等。

“天然核苷酸(nativenucleotide)”是指腺苷酸(adenylicacid)、鸟苷酸(guanylicacid)、胞苷酸(cytidylicacid)、胸苷酸(thymidylicacid)或尿苷酸(uridylicacid)。

“衍生核苷酸(derivatizednucleotide)”是指天然核苷酸之外的其它类型核苷酸。

“靶分子”或“核酸靶分子”是指采用本发明所述方法直接或间接检测的物质，主要包括(但并不限于)核酸分子。

“寡核苷酸(oligonucleotide，ODN)”是指小分子核酸，由核苷酸残基(片段)通过磷酸二酯键(phosphodiester)或其它化学键(如：硫代磷酸酯键(phosphorothioates)连接(聚合)而成，分子量介于核酸与核苷酸之间，并倾向于核苷酸。本发明对核苷酸残基的数目并无严格界限。

“nt(核苷酸，nucleotide)”是指寡核苷酸的核苷酸数量，或者说是寡核苷酸的长度。例如，5nt的寡核苷酸代表寡核苷酸的长度是5个核苷酸，或者5个碱基。

“bp(碱基对，basepair)”是指双链核酸分子的碱基对数量，或者说是双链核酸分子的长度。例如，5bp的核酸分子代表核酸分子的长度是5个碱基对，或者5个碱基。

“3'-5'方向”用于描述单链核酸分子的3'-端至5'-端的方向。

“亚稳定”用于描述本发明所述“茎-环-尾”结构的T_SA寡核苷酸的热力学稳定性特征。它是指上述T_SA寡核苷酸的第三区核苷酸序列能够特异性地与第二区部分核苷酸序列形成稳定的分子内茎状结构，从而使T_SA寡核苷酸不释放荧光信号。但是，当ODN_TS寡核苷酸与上述T_SA寡核苷酸第一区核苷酸序列互补结合并触发新生核酸链的延伸合成时，上述T_SA寡核苷酸的第三区核酸分子从分子内茎状结构中被剥离成单链核酸分子，T_SA寡核苷酸分子内茎状结构的解体，导致T_SA寡核苷酸释放荧光信号。

“延伸阻断剂(extensionblocker)”是指在寡核苷酸片段中存在的一种能够阻止引物或本发明所述ODN_TS延伸的基团，包括(但并不限于)聚六乙二醇(hexethyleneglycol；HEG)、C3(三个碳原子的碳链)等。例如，HEG能够提供18个碳原子(C18)的间距，具有空间位阻效应，在引物5'→3'方向的延伸过程中，新生核酸链的延伸由于空间位阻作用，不能顺利延伸至后续碱基。

“新生核酸链”是指引物或本发明所述ODN_TS在DNA聚合酶的作用下延伸合成的核酸分子。

“新生DNA链”是指引物或本发明所述ODN_TS在DNA聚合酶的作用下延伸合成的DNA分子。

“3'-OH封闭”是指采用理化学修饰手段，使寡核苷酸丧失3'-OH，或3'-OH不发挥作用，修饰包括(但并不限于)磷酸基团、氨基基团等。其特征是阻止寡核苷酸作在DNA聚合酶的作用下，作为引物延伸合成新生核酸链。

“待检测物”是指含有或可能含有靶分子的各种标本或待分析物。

“定性检测”是指直接或间接检测核酸靶分子是否存在，或者直接或间接检测靶分子是否存在于待检测物。

“定量检测”是指直接或间接检测靶分子的浓度，或者直接或间接检测待检测物中靶分子的浓度，例如，检测待检测物中靶分子的拷贝数。

“缺口”或“双链核酸分子缺口”是指双链核酸分子的一条核酸分子链保持完整性，另一条核酸分子链的某两个毗邻核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成一个缺口。该缺口两侧的核酸分子末端分别是3'-OH和5'-PO4。

“缺口的5'-端核酸分子”或“双链核酸分子缺口的5'-端核酸分子”是指双链核酸分子缺口处，带有3'-OH的核酸分子链。

“切割(nicking)”是指切割完全互补双链核酸分子(fullydouble-strandednucleicacidmolecule)的一条链，或者是切割部分双链核酸分子(partiallydouble-strandednucleicacidmolecule)的双链区域中的一条链，并且，切割位置位于NARS的特定位置。核酸分子被切割的特定位置在本发明中被称为“缺口位点(nickingsite，NS)”

“酶切(enzymedigestion)”是指同时酶切完全互补双链核酸分子的两条链，或者是同时酶切部分双链核酸分子的双链区域中的两条链，或者是酶切单链核酸分子，并且，酶切位置位于RERS的特定位置。核酸分子被酶切的特定位置在本发明中被称为“酶切位点(enzymedigestionsite，RDS)”

“缺口剂识别序列(nickingagentrecognitionsequences，NARS)”是指完全或部分双链核酸分子中被缺口剂识别的核苷酸序列。本发明所述NARS包括(但并不限于)NERS和半修饰RERS。

“缺口内切酶识别序列(nickingendonucleaserecognitionsequences，NERS)”是指完全或部分双链核酸分子中被缺口内切酶识别的核苷酸序列称。

“限制性内切酶识别序列(restrictionendonucleaserecognitionsequences，RERS)”是指完全或部分双链核酸分子中被限制性切切酶(RE)识别的核苷酸序列。

“半修饰限制性内切酶识别序列(hemimodifiedRERS)”是指完全或部分双链核酸分子中一条链的RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：α巯基-脱氧核苷酸(α-thiodeoxynucleotide)，并且，该衍生核苷酸可阻止能够识别该RERS的限制性内切酶切割含有此衍生核苷酸的链(即：在限制性内切酶无法切割其识别序列中含有上述衍生核苷酸的核酸分子链)，而另一条链则在其识别序列的特定位置被切割，从而使限制性内切酶具有与缺口内切酶一样的生物学功能，即：只切割完全或部分双链核酸分子中的一条链。

“缺口剂(nickingagent，NA)”是指可识别完全或部分双链核酸分子的NARS序列，并且，只在NARS序列双链区域的缺口位点切割一条核酸分子链的内切酶。缺口剂包括(但并不限于)缺口内切酶(nickingendonuclease，NE；如：N.BstNBI)、限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE；如：HincII)。对于限制性内切酶，只有当完全或部分双链核酸分子含有半修饰RERS时，限制性内切酶才被作为缺口剂使用。

“缺口内切酶(nickingendonuclease；NE)”是指一种能够识别完全或部分双链核酸分子的核苷酸序列，并且，只在相对于其识别序列，即NERS的特定位置切割一条核酸分子链的内切酶。该功能与限制性内切酶不同，限制性内切酶通常需要在完全或部分双链核酸分子的识别序列中至少有一个衍生核苷酸，该衍生核苷酸能阻止限制性内切酶切割含有该衍生核苷酸的核酸分子链，而缺口酶通常识别天然核苷酸，并且，只切割完全或部分双链核酸分子中的一条链。

“NARS正义链序列(sequenceofthesensestrandoftheNARS)”是指完全或部分双链核酸分子中能够被缺口剂切割的NARS序列，该序列含有识别该NARS的缺口剂的缺口位点。

“NARS反义链序列(sequenceoftheantisensestrandoftheNARS)”是指完全或部分双链核酸分子中不能够被缺口剂切割的NARS序列，该序列没有识别该NARS的缺口剂的缺口位点。

“NERS正义链序列(sequenceofthesensestrandoftheNERS)”是指完全或部分双链核酸分子中能够被缺口内切酶切割的NERS序列，该序列含有识别该NERS的缺口剂的缺口位点。

“NERS反义链序列(sequenceoftheantisensestrandoftheNERS)”是指完全或部分双链核酸分子中不能够被缺口内切酶切割的NARS序列，该序列没有识别该NERS的缺口剂的缺口位点。

例如，以典型的缺口内切酶N.BstNBI的NERS和缺口位点为例，如下所示，“▼”标出了切割位置，字母N代表任意核苷酸。如上所述，N.BstNBI的NERS正义链序列5'-GAGTC-3'，NERS反义链序列则是5'-GACTC-3'。

“半修饰RERS正义链序列(sequenceofthesensestrandofthehemimodifiedRERS)”是指完全或部分双链核酸分子中能够被限制性内切酶切割的RERS序列，该序列含有识别该RERS的缺口剂的缺口位点，其特征是RERS序列均是天然核苷酸。

“半修饰RERS反义链序列(sequenceoftheantisensestrandofthehemimodifiedRERS)”是指完全或部分双链核酸分子中不能够被限制性内切酶切割的RARS序列，该序列没有识别该RERS的缺口剂的缺口位点，其特征是RERS序列中至少含有一个衍生核苷酸(如：α巯基-脱氧核苷酸，并且，该衍生核苷酸可阻止能够识别该RERS的限制性内切酶切割此序列。

例如，以限制性内切酶HincII的半修饰RERS和缺口位点为例，如下所示，“▼”标出了切割位置，字母As代表α巯基-三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP[αS])。如上所述，HincII的半修饰RERS正义链序列5'-GTTGAC-3'，半修饰RERS反义链序列则是5'-GTCAsAsC-3'。

5'-GT▼TGAC-3'

3'-CAsAsCTG-5'

“dNTPs”包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP等四种三磷酸脱氧核糖核苷酸。

“固相基质”包括多种方法处理的玻璃片、硅片、陶瓷片、塑料、硝酸纤维、尼龙膜或橡胶等。

“固定”是指通过物理吸附和/或化学耦联方式将寡核苷酸探针或靶分子连接于固相基质的表面。

“物理吸附”是指寡核苷酸探针或靶分子通过次级键(例如：离子键)与固相基质表面相连并固定，或者是以非共价键作用将寡核苷酸探针或靶分子直接或恒电位吸附到固相基质的表面，或者由亚稳定寡核苷酸探针中的磷酸根负离子与固相基质表面带正电荷的修饰层通过静电作用而固定。

“化学耦联”是通过形成共价键(例如：酰胺键、酯键、醚键等)使寡核苷酸探针或靶分子与固相基质表面的活性基团相互作用，从而将寡核苷酸探针或靶分子固定到固相基质的表面，例如：首先活化预处理固相基质的表面，引入各种所需活性基团，如氨基、羧基、巯基、羟基、卤素基(包括氟、氯、溴、碘等)等，或者衍生核苷酸，使其带上合适的功能基因，随后用双官能试剂或偶联活化剂联络将寡核苷酸探针或靶分子固定到固相基质的表面，常用的双官能基团有戊二醛(GA)、对硝基苯氯甲酸酯(NPC)、马来酰亚胺(MA)、二异硫氰酸酯等。

“恒温条件(isothermalconditions)”术语是指在扩增过程中，反应温度保持基本恒定的反应条件(即：温度相同，或者，最高温度和最低温度差异不超过20℃的窄温度变化范围)。

本发明具有以下技术优势与特点：①恒定温度条件下完成反应，避免了使用价格昂贵的温度循环仪；②T_SA寡核苷酸能够有效提高ODN_TS与其特定区域的互补结合，有效提高扩增体系的特异性；③T_SA寡核苷酸标记的荧光基团能够在单个反应管、检测池或检测孔实现多种核酸靶分子的平行检测；④检测速度快，可在10分钟左右完成检测并得到结果；⑤原理简单，易于推广应用；⑥工艺易于实现，容易实现产业化。

综上所述，本发明主要解决了以下技术难题：T_SA寡核苷酸中“茎-环-尾”结构使ODN_TS寡核苷酸与其第一区序列特异性互补杂交，显著提高使恒温指数的特异性和扩增效率；T_SA寡核苷酸荧光报告基团使本发明所述技术可在单个反应管、检测池或检测孔内实现多种核酸靶分子的平行检测，克服了现有恒温扩增技术通常只有检测单一靶分子的局限；针对不同特性的核酸靶分子，提高了将核酸靶分子信息转变成能够启动本发明所述恒温指数扩增体系的解决方案，提高了本发明所述技术的实用性。

附图说明

图1.T_SA寡核苷酸的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图；

图2.第二区序列延展至环区的T_SA寡核苷酸典型结构及其释放荧光信号的原理示意图；

图3.T_SA寡核苷酸指数扩增ODN_TS及其释放荧光信号的原理示意图；

图4.环区含有RERS序列的T_SA寡核苷酸的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图；

图5.第二区序列延展至环区的环区含有RERS序列的T_SA寡核苷酸的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图；

图6.带有RERS序列的单纯线性T_SA寡核苷酸的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图；

图7.带有两个NARS序列的单纯线性T_SA寡核苷酸的典型结构及其释放荧光信号的原理示意图；

图8.基于天然存在NARS或单修饰RERS正义链序列的核酸靶分子制备ODN_TS寡核苷酸的原理示意图一；

图9.基于天然存在NARS或单修饰RERS正义链序列的核酸靶分子制备ODN_TS寡核苷酸的原理示意图二；

图10.基于天然存在两个邻近NARS正义链序列的核酸靶分子制备ODN_TS寡核苷酸的原理示意图；

图11.基于任意核酸靶分子制备ODN_TS寡核苷酸的原理示意图；

图12.T_SA寡核苷酸热动力学稳定性结果示例一；

图13.实时恒温指数扩增曲线及其检测灵敏度示例一；

图14.实时恒温指数扩增产物溶解曲线结果示例一；

图15.实时恒温指数扩增产物溶解曲线结果示例二；

图16.实时恒温指数扩增产物溶解曲线结果示例三；

图17.实时恒温指数扩增产物溶解曲线结果示例四；

图18.ODN_TS制备的扩增曲线结果示例；

图19.T_SA寡核苷酸热动力学稳定性结果示例二；

图20.实时恒温指数扩增曲线示例二；

图21.实时恒温指数扩增曲线及其检测灵敏度示例三。

具体实施方式

下面将通过具体的例子来进一步阐述本发明方法，但本发明方法并不限于以下有限的例子。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

实施例一：寡核苷酸分子的检测

1.靶分子特异性寡核苷酸(ODN_TS)和信号扩增模板(T_SA)的设计与合成：

根据miRNA等天然存在且具有3'-OH的小片段核酸分子，设计并合成靶分子特异性寡核苷酸(ODN_TS)和信号扩增模板(T_SA)，其中，SEQNo.1是miRNA模拟分子，具有可触发其自身延伸的3'-OH，SEQNo.2的3'-端至5'-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与ODN_TS核苷酸序列互补的第一区核苷酸序列；②Nb.BsrDI缺口内切酶的NERS反义链序列区，即5'-GCAATG-3'；③与第一区核苷酸序列相同的第二区核苷酸序列，并且，与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光淬灭基团BHQ2；④延伸阻断区，该区含有延伸阻断剂HEG；⑤环区；⑥与第二区核苷酸序列互补的第三区核苷酸序列，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团CY5。

SEQNo.1(5'>3'方向)

CATTGCGGTCACCAGTAGAGTC

SEQNo.2(5'>3'方向)

(FAM)ATTGCGGTCACCAG(HEG)GACTCTACTGGTGACCGCAAT(BHQ1)GtGACTCTACTGGTGACCGCAATG(PO4)

2.实时荧光恒温指数扩增体系的构建；

PCR反应体系共计20μl，该体系中包括以下组分：ReactionBuffer(NEB)，0.5×CutSmart^TMBuffer(NEB)，0.4units/μlNb.BsrDINickingEnzyme(NEB)，0.05units/μl(exo-)DNAPolymerase(NEB)，400μMdNTPs(Promega)，10μg/mlBSA(NEB)，100nMSEQNo.2，系列终浓度(5×10⁶、5×10³、5、0个拷贝)SEQNo.1。反应条件为：65℃40min，且荧光采集为每分钟采集1次；80℃20min灭活切口内切酶；随后进行熔解曲线分析，温度范围为60℃逐步升温到95℃，温度变化速度为0.1℃/sec，持续采集荧光。所用设备为CFX-96实时荧光定量PCR(Bio-Rad)。

3.结果与分析

3.1T_SA的热动力学亚稳定结构：在线软件DINAMelt的分析结果表明，在Tm值为60℃时，T_SA第二区和第三区可形成亚稳定的茎状结构(图12)，而第一区则处于游离单链状态。该“茎-环-尾”状结构能够充分保证ODN_TS只能与T_SA的第一区特异性互补杂交，从而极大地提高反应体系的触发特异性。

3.2检测灵敏度(图13)：5×10⁶、5×10³、5个拷贝ODN_TS的扩增曲线如图13所示，均为重复管检测，结果表明，所有待检测浓度的ODN_TS均在10～20min的时间内达到扩增平台期，检测灵敏度至少可达到5个拷贝。

3.3扩增产物的二级结构特征：反应体系中同时存在100nMSEQNo.2和5个拷贝SEQNo.1的熔解曲线的荧光变化趋势图及Tm峰值图分别见图14和图15；反应体系中只存在100nMSEQNo.2的熔解曲线的荧光变化趋势图及Tm峰值图分别见图16和图17。结果表明，当反应体系中同时存在SEQNo.2和SEQNo.1时，SEQNo.2由于SEQNo.1的延伸作用，使其“茎-环-尾”结构被破坏而在较低温度时，其荧光强度值增强，在相同条件下，当只存在SEQNo.2时，由于“茎-环-尾”亚稳定结果，在较低温度时，极能保持上述二级结构而不产生荧光，因此，其荧光强度值处于底线水平。随着熔解曲线分析过程中温度的逐步缓慢上升，在同时存在SEQNo.2和SEQNo.1的反应体系中，SEQNo.1及其延伸产物与SEQNo.2解离，而SEQNo.2由于分子内链杂交优势而再次形成“茎-环-尾”亚稳定结构，导致其荧光强度迅速降低至基线水平，但随着温度的进一步逐步升高，其亚稳定结构受到破坏，其荧光基团与淬灭基团之间的FRET作用被破坏，从而导致其释放荧光，最终表现为有两个Tm值峰。而对于反应体系中只有SEQNo.2的反应体系，其荧光值在熔解曲线分析过程中，只有当温度达到能够解离其“茎-环-尾”亚稳定结构结构后，其FRET作用才被破坏，从而释放荧光，但只有一个Tm值峰。上述熔解曲线的分析结果表明，SEQNo.1与SEQNo.2第一区特异性互补杂交所触发的延伸过程，可破坏SEQNo.2的“茎-环-尾”亚稳定结构结构，从而使其在扩增过程中实时释放荧光，同时，可根据扩增产物熔解曲线的峰值图直接判断是否存在的扩增。

实施例二：基因组DNA的检测

1.靶分子特异性寡核苷酸(ODN_TS)的制备

根据靶分子的序列特征(SEQNo.3)，设计用于制备靶分子特异性寡核苷酸(ODN_TS)的信号产生模板(T_SP)寡核苷酸(SEQNo.4)，其中，靶分子具有Nt.BstNBI缺口内切酶的NERS正义链序列区，即5'-GAGTC-3'。线性恒温扩增体系共计20μl，该体系中包括以下组分：1×ReactionBuffer(NEB)，0.5×NEBuffer3.1(NEB)，0.4units/μlNt.BstNBINickingEnzyme(NEB)，0.05units/μl(exo-)DNAPolymerase(NEB)，2×EvaGreen(Biotium)，400μMdNTPs(Promega)，10μg/mlBSA(NEB)，100nMSEQNo.2，系列终浓度SEQNo.3。反应条件为：60℃40min，且荧光采集为每分钟采集1次；80℃20min灭活切口内切酶。所用设备为CFX-96实时荧光定量PCR(Bio-Rad)。

SEQNo.3(5'>3'方向)

GCTCAGTTCCAGTCGTAGGTTTCAGAGTCCATCGCCGATACTGGTGATCAGCACG

SEQNo.4(5'>3'方向)

TCACCAGTATCGGCGATGGACTCTGAAACCTACGA

2.信号扩增模板(T_SA)的设计与合成

根据ODN_TS的序列特征，设计信号扩增模板(T_SA)，其3'-端至5'-端的核苷酸序列组成特征依次为：①与ODN_TS核苷酸序列互补的第一区核苷酸序列；②Nt.BstNBI缺口内切酶的NERS反义链序列区，即5'-GACTC-3'；③与第一区核苷酸序列相同的第二区核苷酸序列，并且，与第三区5'-末端碱基互补的对应碱基处标记荧光淬灭基团BHQ2；④环区，含有Nt.BstNBI缺口内切酶的NERS正义链序列区，即5'-GAGTC-3'；⑤与第二区核苷酸序列互补的第三区核苷酸序列，并且，其5'-末端碱基标记荧光报告基团CY5。

SEQNo.5(5'>3'方向)

(CY5)GCCGATACTGttttGAGTCttttTCACCAGTATCGGC(BHQ2)ttttGACTCttTCACCAGTATCGGC

3.实时荧光恒温指数扩增体系的构建

PCR反应体系共计20μl，该体系中包括以下组分：ReactionBuffer(NEB)，0.5×NEBuffer3.1(NEB),0.4units/μlNt.BstNBINickingEnzyme(NEB),0.05units/μl(exo-)DNAPolymerase(NEB),400μMdNTPs(Promega),10μg/mlBSA(NEB),100nMSEQNo.5,2μl线性恒温扩增体系产物。反应条件为：60℃40min，且荧光采集为每分钟采集1次；80℃20min灭活切口内切酶；随后进行熔解曲线分析，温度范围为65℃逐步升温到95℃，温度变化速度为0.1℃/sec，持续采集荧光。所用设备为CFX-96实时荧光定量PCR(Bio-Rad)。

4.单管实时荧光恒温指数扩增体系的构建

PCR反应体系共计20μl，该体系中包括以下组分：ReactionBuffer(NEB)，0.5×NEBuffer3.1(NEB)，0.4units/μlNt.BstNBINickingEnzyme(NEB)，0.05units/μl(exo-)DNAPolymerase(NEB)，400μMdNTPs(Promega)，10μg/mlBSA(NEB)，100nMSEQNo.5，100nMSEQNo.4，系列终浓度(5×10⁶、5×10³、5、0个拷贝)SEQNo.3。反应条件为：60℃40min，且荧光采集为每分钟采集1次；80℃20min灭活切口内切酶；随后进行熔解曲线分析，温度范围为65℃逐步升温到95℃，温度变化速度为0.1℃/sec，持续采集荧光。所用设备为CFX-96实时荧光定量PCR(Bio-Rad)。

5.结果与分析

5.1线性恒温扩增体系以线性方式生成ODN_TS，见图18。

5.2T_SA的热动力学亚稳定结构：在线软件DINAMelt的分析结果表明，在Tm值为60℃时，T_SA第二区和第三区可形成亚稳定的茎状结构(图19)，而第一区则处于游离单链状态。该“茎-环-尾”状结构能够充分保证ODN_TS只能与T_SA的第一区特异性互补杂交，从而极大地提高反应体系的触发特异性。

5.3当在反应体系中直接使用线性扩增产物在T_SA所在反应体系中时，ODN_TS可触发指数形式扩增，并以指数增长形式释放荧光信号(图20)。

5.4当SEQNo.3～5置于单个反应管时，靶分子能够以指数形式扩增，其通过TSA释放的荧光信号指示靶分子的浓度。5×10⁶、5×10³、5个拷贝靶分子的扩增曲线如图21所示，均为重复管检测，结果表明，所有待检测浓度的ODN_TS均在10～20min的时间内达到扩增平台期，检测灵敏度至少可达到5个拷贝。

Claims

1.实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：

反应混合物包括以下反应成分：

具有3'-OH，具有核酸靶分子特异性的靶分子特异性寡核苷酸；

标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团且具有缺口剂识别序列的信号扩增模板寡核苷酸；

DNA聚合酶；

识别信号扩增模板寡核苷酸缺口剂识别序列的缺口剂；

三磷酸脱氧核苷酸；

满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应。

2.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶是具有链替换活性的DNA聚合酶；

或者，DNA聚合酶是RNA依赖性DNA聚合酶；

或者，DNA聚合酶是DNA依赖性DNA聚合酶。

3.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：

所述的信号扩增模板寡核苷酸包括硫代碱基、锁核酸或肽核酸的衍生核苷酸。

4.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：

所述的信号扩增模板寡核苷酸的荧光报告基团包括羧基荧光素、六氯荧光素、四氯荧光素、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素、吲哚二羧菁、TAMRA或ROX；所述的信号扩增模板寡核苷酸的荧光淬灭基团包括TAMRA或ROX荧光淬灭剂和BHQ1、BHQ2非荧光淬灭剂。

5.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的恒温的反应温度范围为16-70℃。

6.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的反应时间为5-60min。

7.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的信号扩增模板寡核苷酸通过其3'-末端以物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质的表面；

或者，所述的信号扩增模板寡核苷酸通过信号扩增模板寡核苷酸5'-末端以物理吸附和/或化学耦联方式固定于固相基质的表面。

8.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的靶分子特异性寡核苷酸长度为10~40nt。

9.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的靶分子特异性寡核苷酸是具有3'-OH的天然存在的小片段核酸分子。

10.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的信号扩增模板是具有“茎-环-尾”结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

②缺口剂识别序列反义链序列区；

④延伸阻断区；

⑤环区；

11.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的信号扩增模板是具有“茎-环-尾”结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

②缺口剂识别序列反义链序列区；

④环区，其核苷酸序列含有限制性内切酶识别序列，

或者，其核苷酸序列含有缺口剂识别序列正义链序列；

12.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的信号扩增模板是具有线性结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

②缺口剂识别序列反义链序列区；

或者，在限制性内切酶识别序列酶切位点的5'-和3'-端碱基分别标记荧光淬灭基团和荧光报告基团。

13.如权利要求1所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的信号扩增模板是具有线性结构的寡核苷酸，其3'-5'的核苷酸序列组成特征依次为：

②缺口剂识别序列反义链序列区；

14.如权利要求5所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的恒温的反应温度为37℃、55℃、60℃或65℃。

15.如权利要求6所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：所述的反应时间为10min、20min、30min或40min。

16.如权利要求10-13中任意一个所述实时荧光恒温指数扩增方法，其特征在于：

所述的信号扩增模板寡核苷酸第一区核苷酸序列含有与靶分子特异性寡核苷酸3'-末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸。

17.如权利要求16所述实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：

反应混合物包括以下反应成分：

天然存在缺口内切酶识别序列正义链序列的核酸靶分子；

信号产生模板寡核苷酸；

DNA聚合酶；

识别核酸靶分子缺口内切酶识别序列的缺口内切酶；

三磷酸脱氧核苷酸；

满足上述DNA聚合酶和缺口内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应，得到替代实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增产物。

18.如权利要求16所述实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：

反应混合物包括以下反应成分：

天然存在两个邻近缺口内切酶识别序列正义链序列的核酸靶分子；

DNA聚合酶；

识别核酸靶分子缺口内切酶识别序列的缺口内切酶，；

三磷酸脱氧核苷酸；

所述反应混合物于恒温条件下反应时间；得到替代实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增产物。

19.如权利要求16所述实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法为：

反应混合物包括以下反应成分：

半修饰限制性内切酶识别序列正义链序列的核酸靶分子；

②信号产生模板寡核苷酸；

DNA聚合酶；

识别核酸靶分子半修饰限制性内切酶识别序列的限制性内切酶；

三磷酸脱氧核苷酸；

满足上述DNA聚合酶和限制性内切酶生物学活性功能的离子与缓冲体系；

所述反应混合物于恒温条件下反应；得到替代实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增产物。

20.如权利要求16所述实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：

反应混合物包括以下反应成分：

天然存在半修饰限制性内切酶识别序列的单链核酸靶分子；

识别单链核酸靶分子半修饰限制性内切酶识别序列的限制性内切酶；

三磷酸脱氧核苷酸；

21.如权利要求16所述实时荧光恒温指数扩增方法中的靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：

反应混合物包括以下反应成分：

天然存在的核酸靶分子；

四条引物：P₁、P₂、P₃和P₄引物，且四条引物具有以下特征：

P₁和P₂引物5'-3'方向核苷酸序列依次为：靶分子特异性寡核苷酸部分或完全互补区，其核苷酸序列与实时荧光恒温指数扩增方法中所述靶分子特异性寡核苷酸序列部分或完全互补；

缺口剂识别序列反义链序列区；

DNA聚合酶；

磷酸脱氧核苷酸，包括dCTP、dGTP、dTTP和dATP；

22.如权利要求17靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：所述的信号产生模板寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分或完全互补，且与实时荧光恒温指数扩增方法的信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

23.所权利要求17所述靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：所述的信号产生模板寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列无同源性，但是，与实时荧光恒温指数扩增方法的信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

24.所权利要求19所述方法，其特征在于信号产生模板寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列部分或完全互补，且与实时荧光恒温指数扩增方法所述信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

25.所权利要求19所述靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：所述的信号产生模板寡核苷酸3'-5'方向的核苷酸序列依次是：

③第二区，其核苷酸序列与核酸靶分子的核苷酸序列无同源性，且与实时荧光恒温指数扩增方法所述信号扩增模板寡核苷酸的第一区核苷酸序列部分或完全相同。

26.如权利要求21所述靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法，其特征在于：

P₁引物只有核酸靶分子互补结合区，或者，P₂引物只有核酸靶分子互补结合区。

27.包含有权利要求17-26中任意一个所述的的靶分子特异性寡核苷酸的扩增方法的检测试剂或者试剂盒。