CN111206077A - 标定聚合酶链反应荧光信号的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种标定聚合酶链反应荧光信号的方法，用同一块荧光陶瓷材料作为荧光试剂，将其依次放入待标定的多个孔位，使用同一光强的激发光源照射所有荧光试剂，通过调节激发光源光强使得通过荧光试剂后的接收荧光信号至要求的信号范围内，完成多孔位荧光试剂标定。提高PCR基因扩增仪的生产效率和出厂一致性。
Description
技术领域
本发明涉及一种标定技术，特别涉及一种标定聚合酶链反应荧光信号的方法。
背景技术
PCR基因扩增仪是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，是分子生物学研究极其重要的工具，主要应用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析等细分研究方向，在食品检测、临床检验、疾病控制、检验检疫、科研实验室、食品安全、化妆品检测、环境卫生等生命科学领域有着广泛的应用。
在PCR反应中，无论是定性还是定量分析，分析的都是PCR的终产物。若想分析未经PCR放大的起始模板量，则需借助RT-qPCR技术。RT-qPCR技术即是在PCR的反应过程中加入荧光探针。一种荧光探针的5’端标记有报告基团R可发出荧光信号，3’端标记有荧光淬灭基团Q可吸收荧光信号。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，从而不被检测出来。当PCR扩增至探针所在位置时，TaqDNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针5’端的报告基团切断，使其远离探针本身，这时产生的荧光信号就不能被淬灭基团吸收，而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生，通过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。国内生产的PCR仪出厂之前必须进行荧光信号标定，使得标定后荧光信号在允许范围内，保证测试精度。标定方法主要是：设使用光强为Iek(k＝1,2,3……n)的激发光源照射同一管荧光试剂，接收到的荧光强度为Idk(k＝1,2,3……n)。标定前，Iek设置为相同的数值，由于仪器每个孔之间存在细微差异，导致每个孔的荧光结果Idk不一致，并不是全部分布在目标区间内。标定过程即是调整每个孔的Iek使其Idk能够分布在目标区间范围内。
近几年国内PCR的研发和生产大量涌现，但是与进口仪器相比，国内仪器普遍存在仪器一致性差、生产效率低等问题。仪器孔间、台间差异大，主要是因为仪器荧光信号主要是由荧光染料来标定，荧光染料为有机试剂，存在性能不稳定、易失效等特性，如光漂白、光降解、稳定性受温度影响较大等；由于标定物质的不稳定性，增加了仪器生产的生产周期和人力、资金等成本。
发明内容
本发明是针对PCR基因扩增仪中因为标定物质的不稳定性导致仪器成本高的问题，提出了一种标定聚合酶链反应荧光信号的方法，采用一种与PCR常用荧光通道一致的荧光陶瓷材料作为标记物(荧光通道是根据待检物质性质决定的)，该陶瓷材料为无机物，性能稳定，使用寿命长，成本低廉，还可以避免标记物荧光信号衰减以及环境温度的干扰。
本发明的技术方案为：一种标定聚合酶链反应荧光信号的方法，用同一块与PCR基因扩增仪荧光通道相匹配的荧光陶瓷材料作为荧光试剂，将其依次放入待标定的多个孔位，使用同一光强的激发光源照射所有荧光试剂，通过调节激发光源光强使得通过荧光试剂后的接收荧光信号均至要求的信号范围内，完成PCR基因扩增仪多孔位的标定。
本发明的有益效果在于：本发明标定聚合酶链反应荧光信号的方法，提高PCR基因扩增仪的生产效率和出厂一致性。
附图说明
图1为本发明荧光陶瓷材料和荧光素长时间稳定性测试结果图；
图2为本发明荧光陶瓷材料与荧光素热稳定性测试结果图；
图3为本发明标定方式示意图。
具体实施方式
一、荧光陶瓷材料和羧基荧光素性能对比：荧光陶瓷材料属于无机物，而PCR仪上用的荧光素材料是有机物，其有光漂白、光降解、稳定性受温度影响较大等特点，所以陶瓷材料相对荧光染料性能更稳定。
1、荧光陶瓷材料与荧光素长时间稳定性对比测试
配置好两种不同浓度的荧光素，在同样的温度及环境条件下，与荧光陶瓷材料分别进行80分钟的荧光信号测试，记录荧光信号值。
衡量稳定性重要方法：变异系数(C.V,Coefficient of Variance)定义为标准差σ与平均值μ之比，
X包括测试温度下数据、测试时间对应下数据，孔间距离数据、仪器间距离。
根据公式(1)，计算测试得到的荧光信号数据，对比结果如图1和表1显示，纵坐标为相对荧光强度,横坐标为时间,三条线分别是试剂1、试剂2和陶瓷材料测试得到的荧光信号随时间的变化曲线图，C.V(t)为衡量仪器测试重复性的变异系数，荧光陶瓷材料长时间漂移量与试剂相比更小，即相对更稳定。
表1
| C.V(t) | |
| 试剂1 | 1.59％ |
| 试剂2 | 1.31％ |
| 陶瓷 | 0.89％ |
2、荧光陶瓷材料与荧光素热稳定性对比测试：
配置好两种不同浓度的荧光素，分别对两种浓度的试剂和荧光陶瓷材料进行加热到30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃，在每种温度下测试其荧光信号值。根据公式(1)，计算信号随温度的稳定性，见图2。
根据测试结果显示，荧光陶瓷材料的温度稳定性优于荧光素。
二、标定方式及对比结果
1、标定方式：
现在用同一块荧光陶瓷材料代替原来的荧光素试剂作为标定物质(荧光试剂)，将此材料依次放入不同的待标定孔位，通过调节激发光源光强就可调节通过标定物质后输出荧光信号至要求的信号范围内，直接实现多个孔位荧光信号标定，如图3所示同时对多个孔位进行标定。
由于荧光陶瓷材料长时间的稳定性好，同一块材料可以应用在每台仪器上，进一步提高了仪器的台间一致性。而荧光素性能不稳定，同一管试剂往往只能标定一两台仪器，大大影响了仪器的一致性。
2、用荧光陶瓷材料和荧光素试剂标定仪器的台间一致性对比：
根据上述方法，用荧光陶瓷材料经过标定好的仪器直接测量和用荧光素试剂标定完后测量，具体结果如表2所示用荧光陶瓷材料和荧光素标定仪器的台间一致性对比结果，利用荧光陶瓷材料标定能有效减少仪器间的差异性。
表2
Claims (1)
1.一种标定聚合酶链反应荧光信号的方法，其特征在于，用同一块与PCR基因扩增仪荧光通道相匹配的荧光陶瓷材料作为荧光试剂，将其依次放入待标定的多个孔位，使用同一光强的激发光源照射所有荧光试剂，通过调节激发光源光强使得通过荧光试剂后的接收荧光信号均至要求的信号范围内，完成PCR基因扩增仪多孔位的标定。
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