CN109632757A - 基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的荧光分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的荧光分析方法。其特征是单独的酸性磷酸酶或多巴胺不会引起量子点的荧光变化；而检测体系中同时含有多巴胺和酸性磷酸酶时，量子点的荧光发生淬灭，据此建立了检测酸性磷酸酶的荧光分析方法。本发明所述的检测方法操作简便，同时碳量子点的荧光淬灭与酸性磷酸酶浓度之间呈现良好的线性相关，检测限较低，达到0.45 U/L。实际人血清样品中酸性磷酸酶的加标回收率在93.7%‑109.1%范围内。因此，有望为临床检测酸性磷酸酶提供新的方法选择。

Description

基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的荧光分析方法
技术领域
本发明涉及碳纳米材料的应用领域，具体地，涉及一种基于碳量子点的荧光分析方法检测酸性磷酸酶的活性。
背景技术
（1）酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP），是一类广泛存在于自然界中的酶，主要位于各种哺乳动物组织和体液中，如前列腺，肝脏，脾脏，肾，血以及唾液等。作为一种水解酶，酸性磷酸酶可以在酸性条件下催化磷酸单酯水解以释放游离磷酸基团，该水解反应通常用于测定ACP的活性。临床上，ACP活性的检测已用于诊断癌症和监测细胞活力。虽然人体ACP通常以低浓度存在，但是一些疾病（如前列腺癌、多发性骨髓瘤和甲状旁腺功能亢进等）通常伴有ACP浓度的变化。事实上，ACP多年来一直作为转移性前列腺癌的肿瘤标志物。因此，快速方便的检测人血液中的ACP活性具有重要的临床意义，特别是在人前列腺疾病和前列腺癌的诊断中。最近几年，已经报道了许多用于检测ACP活性的测定方法，主要分为两类：基于免疫反应的方法（放射免疫测定，荧光免疫测定、酶免疫测定）和基于酶催化的方法（电化学方法、分光光度法）。然而，一些方法由于检测限差、灵敏度低、分析耗时、仪器设置复杂而受到限制。
（2）多巴胺（Dopamine，DA），典型的儿茶酚胺家族成员，因其在神经传递和激素释放控制中的作用而众所周知。多巴胺在弱碱性条件下通过氧化亲核反应诱导环化转化为5,6-二羟基吲哚，并通过共价键，氢键，p-p相互作用等聚合成聚多巴胺（PDA）。
（3）碳量子点（CDs）作为碳纳米材料的一大分支，具有特殊的物理和化学性质，这使得碳量子点受到了国内外许多研究者的关注。由于CDs表现出良好的生物相容性、低毒性、化学惰性、光致发光等性能，使得碳量子点在生物成像、光电器件等领域具有广阔的应用前景。本发明以实验室前期研究合成所得的碳量子点为基础，利用酪氨酸酶能够催化氧化多巴胺产生多巴醌的特性，构建“Turn-off”型荧光传感器来实现对酪氨酸酶的检测。
发明内容
（1）本发明的目的是利用酸性磷酸酶促进多巴胺氧化，凭借多巴胺的氧化、聚合对碳量子点产生作用，从而建立荧光分析方法检测酸性磷酸酶，该方法操作简单，灵敏度高。
（2）为了实现上述目的，本发明提供了一种基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的荧光分析新方法，其特征在于，包括如下步骤：配置含有不同浓度酸性磷酸酶的缓冲溶液，加入碳量子点和多巴胺进行反应，检测碳量子点的荧光来检测酸性磷酸酶活性。其中，试剂配制操作简单，反应条件易操纵。
（3）制备的试剂移入荧光微量比色皿中，利用荧光分光光度计进行检测，在350 nm的波长激发，读取452 nm的荧光强度；所述碳量子点（CDs）是由2g柠檬酸和0.6g谷胱甘肽熔融后加入8 mL多乙烯多胺反应90 min制备得到的。
为获得CDs最大荧光淬灭效率的反应体系，作为优选，检测不同反应时间和不同反应温度条件下反应体系中CDs的荧光淬灭值。对反应时间10、20、40、60、80、100、120min和反应温度25、30、37°C进行优化。
对缓冲溶液的类型进行优化，其中缓冲溶液为pH6.0的PBS、Tris-HCl、NaAC-HAC。
对PBS缓冲液的pH进行优化，其中pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。
对底物DA的浓度进行优化，其中DA浓度为0、10、30、50、100、200、300、400、500、600、700μM。
本发明选取100min作为最优反应时间，25℃作为最优反应温度，400μM DA作为最优底物浓度，10mM pH 7.0的PBS作为反应体系的缓冲溶液。
所述酸性磷酸酶浓度为0、1、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、400、500U/L。
（4）为获得CDs最大荧光淬灭效率的反应体系，作为优选，检测不同类型缓冲溶液条件下反应体系中CDs的荧光淬灭值。
（5）为获得CDs最大荧光淬灭效率的反应体系，作为优选，检测不同pH缓冲溶液条件下反应体系中CDs的荧光淬灭值。
（6）为获得CDs最大荧光淬灭效率的反应体系，作为优选，检测不同DA浓度条件下反应体系中CDs的荧光淬灭值。
（7）针对上述现有技术，本发明的目的在于克服测定过程中酸性磷酸酶的准确性、灵敏度低、重复性差、过程比较繁琐等问题，提供一种操作简便、灵敏度高，能有效检测酸性磷酸酶活性的方法。
（8）为了实现上述目的，本发明还提供了一种定量检测酸性磷酸酶活性的方法，通过荧光分光光度法进行酸性磷酸酶活性的检测，其特征在于，所述荧光分光光度法中的溶剂通过PBS缓冲溶液、碳量子点、多巴胺和酸性磷酸酶混合而成。通过所述荧光分光光度法绘制的吸收光谱曲线方程为：Y=16.0251+2.52176X，R2=0.99312，其中Y为CDs的荧光淬灭值；X为酸性磷酸酶的活性浓度，最低检测限（LOD）=0.45 U/L；所述溶液中CDs的浓度为25μg/mL。
（9）本发明的有益效果是，本发明利用酸性磷酸酶促进多巴胺氧化，借由多巴胺的氧化聚合对碳量子点产生作用，导致碳量子点的荧光发生淬灭。通过测定反应体系中CDs荧光强度的变化程度，建立“Turn-off”型荧光检测方法检测酸性磷酸酶，获得了良好的效果，且操作方便，灵敏度高，酸性磷酸酶的最低检出限可达到0.45 U/L。
（10）本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的可行性荧光发射光谱。
图2是碳量子点的荧光激发光谱、荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱。
图3A是检测体系在不同反应温度下的动力学反应过程结果图。
图3B 是反应时间为100 min时，检测体系在各个温度下的荧光淬灭效率结果图。
图4是CDs、CDs/DA/ACP体系的荧光强度和不同类型缓冲溶液之间的关系图。
图5A是在不同pH的PBS缓冲溶液（10mM）中，检测体系的荧光淬灭效率结果图。
图5B是CDs、CDs/DA体系的荧光强度和PBS缓冲溶液pH之间的关系图。
图6A是CDs/ACP体系在加入不同浓度DA后的荧光发射图谱。
图6B 是CDs的荧光强度和DA浓度之间的关系图。
图7A 是CDs/DA体系在加入不同浓度ACP后的荧光发射图谱。
图7B 是CDs的荧光淬灭值和ACP浓度之间的关系图。
图7C 是CDs的荧光淬灭值和ACP浓度之间的线性关系图。
图8是酸性磷酸酶检测的特异性考察结果图。
具体实施方式
（1）下面结合具体实施方式和附图对本发明进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
（2）实施例（酸性磷酸酶检测的可行性分析）
名词解释：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP），多巴胺（DA），碳量子点（CDs）。
本实施例的可行性实验样品通过以下步骤制得：
配置以下溶液：溶液1为CDs；溶液2为CDs/DA；溶液3为150U/L ACP/CDs；溶液4为75U/LACP/DA/CDs；溶液5为150U/L ACP/DA/CDs；溶液6为300U/L ACP/DA/CDs；溶液7为300U/LACP/DA。其中CDs浓度为25μg/mL，DA浓度为300µM，各组分溶液均用磷酸盐缓冲溶液配制，本发明实施例用的磷酸盐缓冲溶液由Na2HPO4﹒12H2O、NaH2PO4﹒2H2O、NaCl组成，浓度为10mM、pH值7.0。
所述碳量子点（CDs）是由2g柠檬酸和0.6g谷胱甘肽熔融后加入8mL多乙烯多胺反应90min制备得到。
对上述本实施例配制的溶液进行荧光检测，图1表明单独的ACP或者DA不会对CDs的荧光产生影响，当ACP和DA两者混合时，CDs的荧光发生了淬灭，说明可以建立荧光分析方法检测酸性磷酸酶。
（3）图2表明上述步骤（2）制备的碳量子点水溶液的最大激发波长和发射波长分别为350nm和452nm。图2表明碳量子点水溶液的紫外吸收光谱分别在245nm和350nm处有两个典型吸收峰，推测为 C=C的 π-π*跃迁和 C=O的 n-π*跃迁。
（4）本发明提供一种基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的荧光分析方法，步骤（2）检测体系中同时存在多巴胺与酸性磷酸酶时，碳量子点荧光发生淬灭。
图3A是上述步骤（2）的检测体系在不同反应温度下的动力学反应过程结果图；图3B是反应时间为100 min时各个反应温度下的荧光淬灭效率结果图，可以看出当温度为 25℃时，其荧光淬灭效率最高。综合考虑，选取25℃、100min作为酸性磷酸酶检测的最优反应温度和反应时间。
（5）图4反映了上述步骤（2）的检测体系在不同类型缓冲溶液中的荧光强度，可以看出，CDs的荧光淬灭效率在PBS缓冲溶液中最高。由图5A和5B可以看出，当PBS缓冲液的pH为7.0时，体系CDs/DA的荧光强度与空白CDs溶液相同，且CDs/DA/ACP检测体系中CDs的荧光淬灭效率最高。综合考虑，选择 pH7.0的 PBS（10mM）作为检测酸性磷酸酶的缓冲液体系。
（6）图6A是上述步骤（2）的检测体系在加入不同浓度DA后的荧光发射图谱，图6B是CDs的荧光强度和DA浓度之间的关系图，由图可知，多巴胺浓度为400µM时，荧光淬灭程度随着DA浓度的增大开始逐渐趋于平稳，因此选择400µM作为DA的最优反应浓度。
（7）图7是上述步骤（2）的检测体系中酸性磷酸酶检测的线性范围考察结果，图7A是体系CDs/DA在加入不同浓度ACP后的荧光发射图谱。图7B是CDs的荧光淬灭值和ACP活性浓度之间的关系图。图7C是CDs的荧光淬灭值和ACP活性浓度之间的线性关系图。
（8）图8是上述步骤（2）的检测体系中酸性磷酸酶检测的特异性考察结果，由图可以看出，干扰物质存在下的荧光强度与对照组的荧光强度相当，说明本发明的检测方法具有良好的特异性。
（9）表1是5%人血清中ACP活性加标测定的回收率。
（10）本发明提供了一种酸性磷酸酶活性的检测方法，通过荧光分光光度法进行酸性磷酸酶活性的检测，其中，所述荧光分光光度法中的溶液通过PBS缓冲溶液、CDs、ACP和DA混合而成。
①准确吸取步骤（2）制得的15 µL CDs溶液、8 µL DA溶液和一系列不同活性浓度的ACP，保持总体积为200 µL，在25℃下避光反应100 min后将所得溶液置于荧光分光光度计中。其中，所有的组分溶液均用磷酸盐缓冲液配制，CDs浓度为25μg/mL，DA浓度为400µM。
②在激发波长350 nm条件下，读取发射波长452nm处的荧光强度值，获得不同ACP活性浓度下CDs的荧光强度值，并绘制CDs荧光淬灭值和ACP活性浓度之间的标准曲线。
③在本发明提供的一种优选的实施方式中，所述溶液中各组分的含量具体为：CDs的浓度为25µg/mL，DA浓度为400µM，缓冲溶液（缓冲溶液由Na2HPO4﹒12H2O、NaH2PO4﹒2H2O、NaCl组成）的浓度为10mM，且所述缓冲溶液的pH为7.0。图7A中的曲线自上而下对应的酸性磷酸酶浓度为0 U/L、1 U/L、5 U/L、10 U/L、20 U/L、30 U/L、40 U/L、50 U/L、60 U/L、80 U/L、100 U/L、150 U/L、200 U/L、250 U/L、300 U/L、400 U/L、500 U/L，从中可以看出，随着酸性磷酸酶活性浓度的增大，CDs的荧光强度逐渐减弱。通过图7C可以看出，待测酸性磷酸酶活性浓度在1-60 U/L时，其活性浓度与CDs的荧光淬灭值之间有着良好的线性关系，线性方程为：Y=16.0251+2.52176X，R2=0.99312，其中Y为CDs的荧光淬灭值；X为酸性磷酸酶的活性浓度，最低检测限（LOD）=0.45 U/L（S/N=3）。图8中显示说明在平行操作的条件下，干扰物质存在下的荧光强度与对照组的荧光强度相当，因而干扰物质不会影响酸性磷酸酶的检测。
④表1显示说明根据相同的操作流程，5%人血清（Serum）中的加标实验说明本方法检测酸性磷酸酶具有优异的回收率和重现性。
表1
⑤以上实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于碳量子点检测酸性磷酸酶活性的荧光分析方法，其特征在于，包括如下步骤：配置含有不同浓度酸性磷酸酶的缓冲溶液、加入碳量子点和多巴胺进行孵育反应，测定碳量子点的荧光来检测酸性磷酸酶活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳量子点（CDs）是由2g柠檬酸和0.6g谷胱甘肽熔融后加入8 mL多乙烯多胺反应90 min制备得到的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CDs的最大激发波长为350 nm，发射波长为452nm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对反应时间10、20、40、60、80、100、120min和反应温度25、30、37°C进行优化。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对缓冲溶液的类型进行优化，其中缓冲溶液为pH6.0的PBS、Tris-HCl、NaAC-HAC。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对PBS缓冲液的pH进行优化，其中pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对底物DA的浓度进行优化，其中DA浓度为0、10、30、50、100、200、300、400、500、600、700μM。
8.如权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于，选取100min作为最优反应时间，25℃作为最优反应温度，400μM DA作为最优底物浓度，10mM pH 7.0的PBS作为反应体系的缓冲溶液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性磷酸酶浓度为0、1、5、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、400、500U/L。
10.一种酸性磷酸酶的定量检测方法，通过荧光分光光度法对加入不同浓度酸性磷酸酶的碳量子点进行荧光检测，其特征在于，所述荧光分光光度法中使用的溶液由PBS、CDs、酸性磷酸酶和多巴胺混合而成；通过所述荧光分光光度法绘制的吸收光谱曲线方程为：Y=16.0251+2.52176X，R2=0.99312，其中Y为CDs的荧光淬灭值；X为酸性磷酸酶的活性浓度，最低检测限（LOD）=0.45 U/L；所述溶液中CDs的浓度为25μg/mL。
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