CN112710645A - 一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺和碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺和碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用，属于生物传感技术领域。该方法包括：高锰酸根离子引发的多巴胺和苔黑酚水合物反应生成蓝色荧光有机产物(DMTM)，通过荧光强度变化来实现对多巴胺的实时检测；由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根苔黑酚水合物磷酸钠盐，因此可用来实现对碱性磷酸酶的实时检测。此外，碱性磷酸酶由于具备分子量小，生物相容性好等优势而成为酶联免疫中的广泛使用的一种标记酶。因此，我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，利用碱性磷酸酶作为标记酶构建了一个荧光免疫传感平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺和碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用，属于生物传感技术领域。
背景技术
实时监测是对所监测分子状态的动态监测。实时监测在疾病诊断，环境监测，生物分子等领域已经被广泛的应用。在过去的十年中，通过使用电化学，表面等离子共振，化学发光，分光光度法，荧光法来实时监测生物分子已经被报道。与其他方法相比，荧光分析因其简单，高灵敏度和出色的选择性而被广泛使用。但是，许多因素包括响应时间长，温度变化以及稳定的荧光强度值，都会影响基于荧光的传感器功能并限制其应用。因此，发展一种响应时间短，简单灵敏的实时荧光传感器是十分有必要的。同时实时监测在疾病诊断应用中也具有良好的前景。
多巴胺是儿茶酚胺的一类，是一种神经递质，在生理过程中起着重要的作用。多巴胺的异常表达也会产生疾病比如帕金森病、阿尔茨海默病及抑郁症等神经性疾病。实现实时检测多巴胺是很迫切的。近年来,实时检测在作为生物检测、医疗诊断等方面的应用研究也引起了广泛的关注。Xu等人于2019年在Analytical Chemistry上提出了一种新型的荧光开启法对多巴胺进行检测，该方法主要是通过多巴胺能够增强光泽精-核黄素和多巴胺体系的荧光强度，从而实现对多巴胺定量检测多巴胺。Peter组首次开发了一种用碳糊电极修饰的新型Pt/CeO2@ Cu2O纳米复合材料，通过电分析方法用来检测多巴胺。
碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于生物组织中的膜结合酶。血清中ALP 的异常表达与骨病、糖尿病、乳腺癌、前列腺癌以及肝功能障碍等多种疾病密切相关，是一种重要的生物标志物。此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定(ELISA)中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。目前，有多种方法用于检测ALP，例如：比色法、化学发光法、电化学发光法及表面增强共振拉曼散射等方法。上述的方法存在一些不足：复杂的步骤，低灵敏度及长的响应时间。因此，实现对多巴胺和碱性磷酸酶的高选择性和高灵敏度检测将有利于临床相关疾病的诊断、监测与治疗。
为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤开发了一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺和碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用，该检测方法兼具实时检测、快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。
发明内容
本发明的目的在于，为了克服现有技术的不足，提出一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺和碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用。所述方法可以通过温和的合成条件、简单的合成步骤、便宜的合成原料制备出具有荧光的有机物，通过荧光强度与浓度的线性关系能实时、快速地实现对多巴胺和碱性磷酸酶的高选择性和高灵敏度检测。同时，又利用ALP在酶联免疫中作为标记酶的特性，构建了ALP引发的实时荧光免疫传感器并应用于心肌钙蛋白I型的实时检测。
本发明的技术方案之一是，一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺的方法，其特征在于：包括如下步骤：室温条件下，在PBS缓冲溶液中，加入多巴胺，苔黑酚水合物和高锰酸钾，混合均匀，反应3s，立刻生成蓝色荧光有机化合物DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测。
通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测来实现对多巴胺的检测，并且DMTM的荧光强度随着多巴胺浓度的增加而逐渐增加，进而实现对多巴胺的定量检测。
优选的，提出了一种基于高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺方法时，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4，PBS缓冲溶液的浓度为10mM，苔黑酚水合物的浓度为4mM，高锰酸钾的浓度为150M；取1000μL PBS缓冲溶液，分别加入4mM苔黑酚水合物和0-200M的不同浓度的多巴胺，150M高锰酸钾，震荡摇匀，反应3s通过荧光光谱仪测量绘制荧光时间扫描图，记录加多巴胺前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之二是，基于一种基于高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺方法应用，室温条件下，在PBS中加入一定量的人体血清，再加入一定量的苔黑酚水合物，不同浓度的多巴胺和一定量的高锰酸钾，反应3s，立刻生成DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测来实现对多巴胺的检测，并且DMTM的荧光强度随着多巴胺浓度的增加而逐渐增加，进而实现在复杂环境体系中对多巴胺的定量检测。
在开发一种基于高锰酸根引发的原位荧光反应在复杂环境体系中实时检测多巴胺方法时，所述PBS的pH为7.4，PBS的浓度为10mM，苔黑酚水合物的浓度为4mM，高锰酸钾的浓度为150M；取1000μL PBS，加入1％的人体血清，再加入4mM苔黑酚水合物和不同浓度的多巴胺，150M高锰酸钾，震荡摇匀，反应3s后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光时间扫描图，记录加多巴胺前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之三是，一种基于高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中，加入一定量的苔黑酚水合物磷酸钠盐与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应生成苔黑酚水合物，取孵化液于PBS，然后依次加入多巴胺和高锰酸钾，反应3s生成DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测来实现对碱性磷酸酶的高选择性检测，并且DMTM的荧光强度随着碱性磷酸酶浓度的增加而逐渐增强，可实现对碱性磷酸酶的定量检测。
优选的，构建一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的荧光传感，所述缓冲溶液的pH为7.4，PBS的浓度为10mM，苔黑酚水合物磷酸钠盐的浓度为160μM，多巴胺的浓度为150μM，高锰酸钾的浓度为150μM；取 40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入1.6mM苔黑酚水合物磷酸钠盐的与0-100mU/mL碱性磷酸酶，在37℃条件下孵化反应1h后，取孵化液30μL 于270μL PBS缓冲溶液中，再依次加入150μM的多巴胺，150μM的高锰酸钾，震荡摇匀，反应3s后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光时间扫描图，记录加碱性磷酸酶前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之四是，一种基于高锰酸根引发的原位荧光反应在复杂环境体系中实时检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在PBS缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再加入一定量的苔黑酚水合物磷酸钠盐与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应生成苔黑酚水合物，再加入多巴胺和高锰酸钾，3s内反应快速生成具有蓝色荧光的有机物，通过DMTM的荧光强度与碱性磷酸酶浓度的线性关系，计算复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率。
优选的，在构建一种高锰酸根引发的原位荧光反应在复杂环境体系中实时检测碱性磷酸酶的荧光传感时，所述缓冲溶液的pH为7.4，PBS缓冲溶液的浓度为10mM，苔黑酚水合物磷酸钠盐的浓度为160μM，多巴胺的浓度为150μM，高锰酸钾的浓度为150μM；取40μLTris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入1.6 mM苔黑酚水合物磷酸钠盐的与0-100mU/mL碱性磷酸酶，在37℃条件下孵化反应1h后，取孵化液30μL于270μL PBS缓冲溶液中，加入1％的人体血清，再依次加入150μM的多巴胺，150μM的高锰酸钾，震荡摇匀，反应3s后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加碱性磷酸酶前后荧光强度变化情况。
本发明的技术方案之五是，基于一种碱性磷酸酶构建的免疫荧光传感器检测心肌肌钙蛋白I型的方法，在96孔板中，捕捕获抗体与抗原相结合，随后抗原与一抗相连接，一抗又与ALP标记的驴羊二抗相连构建一个三明治式夹心免疫，最后加上荧光底物，通过形成荧光有机物的荧光强度的变化来实现对心肌钙蛋白 I型的定量检测。
优选的，在构建基于ALP酶触发的荧光免疫传感平台时，该传感平台条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0，Tris-HCl的浓度为10mM，多巴胺为150M，高锰酸钾的浓度为150μM，苔黑酚水合物磷酸钠盐浓度为160M，ALP标记的驴羊二抗与苔黑酚水合物磷酸钠盐的孵化温度为37℃，孵化时长为1h，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL, ALP标记的二抗浓度为2μg/mL,反应时间为3s，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行实时荧光强度检测，以此定量检测心肌钙蛋白I型。。
首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4板中孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h，取ALP标记的驴羊二抗孵育1h，结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris-HCl缓冲液和苔黑酚水合物磷酸钠盐 37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对多巴胺和高锰酸钾。混匀后立即进行实时荧光扫描。
本发明的技术方案之六是基于一种碱性磷酸酶诱导原位形成荧光有机物的免疫荧光传感器在真实病人血清样本中检测心肌钙蛋白I型的应用，在牛血清蛋白封闭结束后，加入100L不同浓度的病人血清样本，再按照上述步骤完成夹心免疫，最后再加入一定量的多巴胺和高锰酸钾，反应混合后后生成蓝色 DMTM，并且DMTM的荧光强度随着心肌钙蛋白I型的增加而逐渐增加，进而实现在病人血清样本中心肌钙蛋白I型的定量检测。
优选的，在构建基于ALP酶触发的荧光免疫传感平台时，该传感平台条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0，Tris-HCl的浓度为10mM，多巴胺为150M，高锰酸钾的浓度为150μM，苔黑酚水合物磷酸钠盐浓度为160M，ALP标记的驴羊二抗与苔黑酚水合物磷酸钠盐的孵化温度为37℃，孵化时长为1h，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL, ALP标记的二抗浓度为2μg/mL,人体稀释血清浓度为1％，病人血清样本采用 PBS稀释10倍。反应时间为3s，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行实时荧光强度检测，以此定量检测心肌肌钙蛋白I型。。
首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4板中孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200L牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h，取ALP标记的驴羊二抗孵育1h，结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris-HCl缓冲液和苔黑酚水合物磷酸钠盐37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对多巴胺和高锰酸钾。混匀后立即进行实时荧光扫描。
本发明的有益效果：
本发明的方法一为高锰酸根引发的原位荧光反应能够快速形成蓝色荧光物质DMTM，此外DMTM的荧光强度随着多巴胺浓度的增加而逐渐增强，通过荧光强度的变化可实现对多巴胺的定量检测。本发明的方法二为碱性磷酸酶能水解苔黑酚水合物磷酸钠盐，通过荧光强度的变化实现对碱性磷酸酶的高选择性检测，同时DMTM的荧光强度随着碱性磷酸酶浓度的增加而逐渐增强，可实现对碱性磷酸酶的定量检测。此外，该方法还能够应用于复杂体系中多巴胺和碱性磷酸酶的检测。本发明中的原位形成荧光有机物检测多巴胺和碱性磷酸酶的方法合成条件温和、荧光强且稳定，而且该方法对多巴胺和碱性磷酸酶的检测具有快速响应、高选择性和高灵敏度等优点。这些研究为实现对多巴胺和碱性磷酸酶的高灵敏度和高选择性检测提供了新的方法。本发明的方法三为利用碱性磷酸酶在酶联免疫中常作为标记酶的特性，以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，构建了一个ALP 引发的荧光免疫试剂盒。苔黑酚水合物磷酸钠盐为酶标记二抗的底物，通过 DMTM荧光强度的变化来实现对心肌钙蛋白I型的实时定量检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为实施例1中制得的DMTM的吸收光谱图；
图2为实施例1中制得的DMTM的荧光激发光谱图；
图3为实施例1中制得的DMTM的荧光发射光谱图；
图4为实施例2中制得的DMTM的时间扫描图；
图5为实施例3中制得的DMTM的荧光寿命扫描图；
图6为实施例4中不同浓度的多巴胺制得的DMTM的时间扫描图；
图7为实施例4中不同浓度的多巴胺制得的DMTM的荧光强度散点图；
图8为实施例4中不同浓度的多巴胺制得的DMTM的标准曲线图；
图9为实施例5中不同的多巴胺干扰物质制得的荧光强度变化柱状图；
图10为一种检测多巴胺和碱性磷酸酶的原位荧光试剂盒的示意图。
图11为实施例6中不同浓度的碱性磷酸酶制得的DMTM的时间扫描图；
图12为实施例6中不同浓度的碱性磷酸酶制得的DMTM的荧光强度散点图；
图13为实施例6中不同浓度的碱性磷酸酶制得的DMTM的标准曲线图；
图14为实施例7中不同酶或蛋白作用制得的DMTM的荧光强度变化柱状图；
图15为一种基于碱性磷酸酶触发的检测心肌钙蛋白I型的荧光免疫试剂盒的示意图；
图16为实施10中不同浓度的心肌钙蛋白I型连接的免疫荧光试剂盒的时间扫描图；
图17为实施10中不同浓度的心肌钙蛋白I型的荧光强度散点图；
图18为实施10中不同浓度的心肌钙蛋白I型的标准曲线图；
图19为实施11中免疫荧光试剂盒中心肌钙蛋白I型的选择性的荧光强度变化柱状图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1：室温下，取1000μL PBS缓冲溶液，分别加入500M苔黑酚水合物，500M多巴胺和200M高锰酸钾，震荡摇匀。反应3s后，在紫外灯照射情况下，观察到蓝色荧光，表示DMTM制备成功。通过紫外吸收光谱仪对 DMTM进行吸收强度检测，绘制吸收光谱图，如图1。表明DMTM在420nm 出现吸收峰。通过荧光光谱仪对DMTM进行荧光强度检测，绘制荧光激发光谱图和荧光发射光谱图，如图2和图3。该物质的激发波长为420nm，发射波长为 470nm，
实施例2：室温下，取1000μL PBS缓冲溶液，分别加入500M苔黑酚水合物，500M多巴胺和200M高锰酸钾，震荡摇匀，通过荧光光谱仪对DMTM 进行时间扫描，激发波长为420nm，发射波长为470nm，绘制时间扫描图，如图 4。表明生成的物质荧光强度体系非常稳定
实施例3：室温下，取1000μL PBS缓冲溶液，分别加入4mM苔黑酚水合物，150M多巴胺和150M高锰酸钾，震荡摇匀。反应3s后，在紫外灯照射情况下，观察到蓝色荧光，表示DMTM制备成功。制备的蓝色荧光有机物通过寿命检测绘出蓝色荧光有机物的荧光寿命。如图5。寿命时间为5.25ns。
实施例4：室温下，取1000μL PBS缓冲溶液，分别加入4mM苔黑酚水合物，150M高锰酸钾，和0-200M的多巴胺，震荡摇匀。反应3s后，在紫外灯照射情况下，观察到蓝色荧光，表示DMTM制备成功。通过荧光光谱仪对 DMTM进行荧光强度检测，激发波长为420nm，发射波长为470nm。绘制实时荧光扫描图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图6、图7和图8。表明该方法对多巴胺的检测为0-120M，检测限为10nm。
实施例5：室温下，取6份PBS缓冲溶液，分别加入4mM苔黑酚水合物， 150M高锰酸钾，震荡摇匀，再分别加入150M不同物质：1、多巴胺；2、肾上腺素盐酸盐；3、去甲肾上腺素；4、左旋多巴胺；5、甲基多巴胺；6、血清胺盐酸盐，震荡摇匀。反应3s后，通过荧光光谱仪进行荧光强度检测，激发波长为420nm，发射波长为470nm。绘制荧光强度柱状图，如图9。该方法对多巴胺的检测具有特异性。
实施例6：室温下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入160μM 苔黑酚水合物磷酸钠盐的与0-100mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应1h后，取孵化液30μL于270μL PBS缓冲溶液，再依次加入150μM 的多巴胺，150μM的高锰酸钾，震荡摇匀，反应3s后，通过荧光光谱仪对DMTM 进行荧光强度检测，激发波长为420nm，发射波长为470nm。绘制实时荧光扫描图、荧光强度散点图和标准曲线图，如图11、图12和图13。表明该方法对碱性磷酸酶的检测范围为0-30mU/mL,检测限为0.1mU/mL。
实施例7：室温下，取9份40μL Tris-HCl缓冲溶液，分别加入160μM的苔黑酚水合物磷酸钠盐，震荡摇匀，再分别加入100mU/mL的不同物质：0、空白；1、胰蛋白酶；2、无机焦磷酸酶；3、酪氨酸酶；4、碱性磷酸酶；5、牛血清白蛋白；6、葡萄糖氧化酶；7、酸性磷酸酶；8、胆固醇氧化酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应1h后，取孵化液30μL于270μL PBS缓冲溶液，再依次加入150μM的多巴胺，150μM的高锰酸钾，震荡摇匀。反应3s后，通过荧光光谱仪对DMTM进行荧光强度检测，激发波长为420nm，发射波长为470nm。绘制荧光强度柱状图，如图14。表明该方法对碱性磷酸酶的检测具有特异性。
实施例8：取1000μL PBS缓冲溶液，加入1％的人体血清，再加入4mM 的苔黑酚水合物，150μM的多巴胺和不同浓度的多巴胺(0μM、4μM、10μM、 20μM和40μM)，震荡摇匀，反应3s后，通过荧光光谱仪对DMTM进行荧光强度检测；计算多巴胺恢复效率，如表1。表明该方法在复杂体系中也可以实现对多巴胺的检测。
表1为实施例8中血清样品中多巴胺的恢复效率和实施例9中血清样品中碱性磷酸酶活度的恢复效率
实施例9：取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,加入1％的人体血清，再加入160μM苔黑酚水合物磷酸钠盐的与不同浓度的碱性磷酸酶(0.4mU/mL、3 mU/mL、6mU/mL、15mU/mL和22mU/mL)，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应1h后，取孵化液30μL于270μL PBS缓冲溶液，再依次加入150μM的多巴胺， 150μM的高锰酸钾，震荡摇匀，反应3s后，通过荧光光谱仪对DMTM进行荧光强度检测。计算碱性磷酸酶的恢复效率，如表1。表明该方法在复杂体系中也可以实现对碱性磷酸酶的检测。
实施例10：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入Tris-HCl缓冲液，苔黑酚水合物磷酸钠盐37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后，结束后在孔板中加入150mM多巴胺和150μM高锰酸钾。混合均匀后进行荧光强度分析并绘制免疫荧光试剂盒的实时荧光扫描图和标准曲线，如图16，图17和图18。该方法同时应用于心肌钙蛋白的检测，检测范围为2-150ng/mL，检测限为0.05ng/mL。
实施例11：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后往各孔中分别加入200ng/mL的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入Tris-HCl缓冲液，苔黑酚水合物磷酸钠盐于37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后，结束后在孔板中加入150mM多巴胺和150μM高锰酸钾。混合均匀后进行荧光分析并绘制免疫荧光试剂盒的柱状图，如图19。表明该方法对心肌钙蛋白的检测具有特异性。
实施例12：事先将各病人血清样本用标准试剂盒计算出含有的心肌钙蛋白 I型的浓度，然后按照免疫的常规操作，在用牛血清蛋白封闭结束后再加入100 L的含有不同浓度的心肌钙蛋白I型的病人血清，之后37℃孵育1h，用TBST 去除未结合的病人血清样本后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris-HCl缓冲液,苔黑酚水合物磷酸钠盐于 37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后，结束后在孔板中加入150mM多巴胺和150M高锰酸钾。混合均匀后进行荧光强度测试并计算心肌钙蛋白I型的回收率，并与标准试剂盒的进行对比，如表2。表明该方法可应用在实际病人样本中。
表2为病人血清样本中检测的心肌钙蛋白I型的回收率与标准试剂盒的对比
本发明不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺的方法，其特征在于：包括如下步骤：室温条件下，在PBS缓冲溶液中，加入多巴胺，苔黑酚水合物和高锰酸钾，混合均匀，反应3s，立刻生成蓝色荧光有机化合物DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测。
2.根据权利要求1所述的高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺的方法，DMTM合成条件为：PBS缓冲溶液的pH为7.4，PBS缓冲溶液的浓度为10mM，多巴胺的浓度为150M，苔黑酚水合物的浓度为150M，高锰酸钾的浓度为150M，DMTM反应时间为3s，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测。
3.根据权利要求2所述的高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺的方法，其特征在于：室温条件下，在PBS缓冲溶液中，在高锰酸钾的作用下多巴胺和苔黑酚水合物反应3s立刻生成DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行实时荧光强度检测，根据荧光强度的变化来实现对多巴胺的实时检测。
4.一种高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：苔黑酚水合物磷酸钠盐在碱性磷酸酶的作用下反应生成苔黑酚水合物，在高锰酸钾的作用下苔黑酚水合物再与多巴胺反应生成蓝色DMTM，根据荧光强度的变化以此来检测碱性磷酸酶；室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中，碱性磷酸酶与一定量的苔黑酚水合物磷酸钠盐反应，放入振荡箱37℃孵化1小时；取孵化后的溶液于PBS缓冲溶液中，再加入一定量的多巴胺，高锰酸钾混合均匀，反应3s立刻生成DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测。
5.根据权利要求4所述的高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：DMTM合成条件为：PBS缓冲溶液的pH为7.4，PBS缓冲溶液的浓度为10mM，苔黑酚水合物磷酸钠盐的浓度为160M，碱性磷酸酶的浓度为30mU/mL，苔黑酚水合物磷酸钠盐与碱性磷酸酶的孵化条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0，温度为37℃，孵化时长为1h，多巴胺的浓度为150M，高锰酸钾的浓度为150M，DMTM反应时间为3s，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测。
6.根据权利要求4所述的高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中，碱性磷酸酶与一定量的苔黑酚水合物磷酸钠盐反应生成苔黑酚水合物，在高锰酸钾的催化下苔黑酚水合物再与多巴胺反应3s生成DMTM，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行实时荧光强度检测，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力，根据荧光强度的变化，以此定量实时检测碱性磷酸酶。
7.一种基于室温形成荧光有机物构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris-HCl缓冲液，ALP标记的驴羊二抗和苔黑酚水合物磷酸钠盐37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对多巴胺和高锰酸钾；DMTM反应时间为3s，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测；该传感平台条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0，Tris-HCl的浓度为10mM，多巴胺为150M，高锰酸钾的浓度为150μM，苔黑酚水合物磷酸钠盐的浓度为160M，ALP标记的驴羊二抗与苔黑酚水合物磷酸钠盐的孵化温度为37℃，孵化时长为1h，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL,ALP标记的二抗浓度为2μg/mL,反应时间为3s，通过荧光光谱仪对合成的DMTM进行荧光强度检测，以此定量实时检测心肌钙蛋白I型。
8.根据权利要求1-3任一所述的高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测多巴胺的方法的应用，其特征在于：室温条件下，在含人体血清的复杂体系中，加入多巴胺，一定量的苔黑酚水合物和高锰酸钾，混合均匀，反应3s生成DMTM，DMTM的荧光强度会随着多巴胺浓度的增加而增强，用于实现在复杂环境体系中对多巴胺的检测试剂盒的制备。
9.根据权利要求4-6任一所述的高锰酸根引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法的应用，其特征在于：室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中，加入碱性磷酸酶和一定量的苔黑酚水合物磷酸钠盐，反应完全后，取孵化液溶在含人体血清的复杂体系中，再加入一定量的多巴胺和高锰酸钾，混合均匀，反应3s生成DMTM，DMTM的荧光强度会随着碱性磷酸酶浓度的增加而增强，用于实现在复杂环境体系中对碱性磷酸酶的检测试剂盒的制备。
10.根据权利要求7所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的应用，其特征在于：在用牛血清蛋白封闭结束后，加入含有不同浓度心肌钙蛋白I型37℃孵化1小时；结束后再按照上述步骤，最后再加多巴胺和高锰酸钾，混合均匀后立即在荧光光谱仪中测试；先用心肌钙蛋白标准试剂盒测试出不同血清样本中心肌钙蛋白I型的含量，之后再根据前面测试标准曲线对样品进行稀释使其浓度在曲线范围内，稀释倍数为10倍，之后将其加入96孔板中37℃孵化1小时，再按照上述步骤进行试验；根据形成的DMTM的荧光强度，用于病人血清样本中心肌钙蛋白I型的检测试剂盒的制备。
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