CN113702630A - 一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白i型的方法和应用 - Google Patents
一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白i型的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白I型的方法和应用。该方法以多巴胺和酚(1,3‑萘二酚、8‑羟基久洛尼定、1,5‑萘二酚)为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好、波长可调荧光化合物(FCs)。在Cu2+引发下，多巴胺和不同酚可以获得不同发射波长的荧光物质，利用焦磷酸根离子(PPi)对Cu2+的亲和力实现了体系的荧光关闭。在碱性磷酸酶(ALP)的催化水解下，PPi能迅速转化为磷酸根离子，从而使体系荧光打开。我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，利用碱性磷酸酶作为标记酶构建了多通道免疫荧光传感平台。此外，该传感体系在人血清中仍表现出快速的响应和良好的回收率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于铜离子触发的波长可调实时原位荧光免疫分析传感平台的构建及其分析应用，用于实时灵敏的检测cTnI，属于纳米生物传感技术领域。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是一种膜结合酶，广泛表达于肝、骨、肠、胎盘、肾脏等组织。它主要负责从各种蛋白质和非蛋白质底物中水解和转化磷酸单酯。作为公认的生物标志物，碱性磷酸酶在细胞周期生长、凋亡和信号转导途径等许多重要的生理和病理过程中发挥着重要作用。成人血清ALP正常值一般在46～190U/L，儿童和孕妇ALP正常值在500U/L以上，但血清ALP异常与骨病、肝功能障碍、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、糖尿病等疾病密切相关。
此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定(ELISA)中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。目前，有多种方法用于检测ALP，例如：比色法、化学发光法、电化学发光法及表面增强共振拉曼散射等方法。上述的方法存在一些不足：复杂的步骤，低灵敏度及长的响应时间。因此，实现对多巴胺和碱性磷酸酶的高选择性和高灵敏度检测将有利于临床相关疾病的诊断、监测与治疗。
为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤开发了一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法及其酶联免疫应用，该检测方法兼具实时检测、快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提出一种基于铜离子引发的原位荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)活性的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，铜离子催化多巴胺和酚(1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚)发生原位荧光反应生成的蓝/绿/黄光发射的荧光化合物有助于构建多通道荧光酶联免疫传感平台，而焦磷酸根和铜离子离子具有较高亲和力使得荧光强度高、稳定性好的LFC波长可调荧光化合物(FCs)/Cu2+体系的荧光降低，向FCs/Cu2+系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根据荧光强度的变化以此来检测碱性磷酸酶。
优选的，FCs合成条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.4，多巴胺和1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚的浓度为300μM，铜离子和PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-1250mU/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5小时；取孵化后溶液加入FCs/Cu2+体系，充分振荡；焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜FCs/Cu2+体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力，根据荧光强度的变化，以此定量检测碱性磷酸酶。
为了解决上述技术问题，本发明提出另一技术方案是：所述的铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶方法制备的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提出另一技术方案是：一种利用所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法。首先，一系列捕获抗体被注入到孔板中4℃孵化过夜；接着加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后加入不同浓度的cTnI溶液，取山羊抗/Ab2移入孔板中，加入反应体系，从而构成三明治式夹心免疫；最后在孔板中加入FCs/Cu2+；通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于检测心肌钙蛋白I型。
优选的，首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗数次，然后加入Tris-HCl缓冲液，ALP标记的驴羊二抗和焦磷酸钠盐37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对FCs/Cu2+；通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于检测心肌钙蛋白I型。
优选的，该传感平台条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0，Tris-HCl的浓度为10mM，多巴胺和1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚的浓度为300μM，铜离子和PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-1250mU/mL，ALP标记的驴羊二抗与焦磷酸钠盐的孵化温度为37℃，孵化时长为0.5h，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL,ALP标记的二抗浓度为2μg/mL,通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度检测，以此定量实时检测心肌钙蛋白I型。
为了解决上述技术问题，本发明提出另一技术方案是：所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的应用，在用牛血清蛋白封闭结束后，加入含有不同浓度心肌钙蛋白I型37℃孵化1小时；结束后再按照上述步骤，最后再加多巴胺和高锰酸钾，混合均匀后立即在荧光光谱仪中测试；先用心肌钙蛋白标准试剂盒测试出不同血清样本中心肌钙蛋白I型的含量，之后再根据前面测试标准曲线对样品进行稀释使其浓度在曲线范围内，稀释倍数为10倍，之后将其加入96孔板中37℃孵化1小时，再按照上述步骤进行试验；根据形成的FCs的荧光强度，用于病人血清样本中心肌钙蛋白I型的检测试剂盒的制备。
为了解决上述技术问题，本发明提出另一技术方案是：任一所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的制备的于定量检测心肌钙蛋白的商业试剂盒。
一种基于铜离子引发的原位荧光酶联免疫传感平台的构建，用于检测碱性磷酸酶(ALP)的方法，包括如下步骤：以多巴胺和8-羟基久洛尼定为原料，在室温下通过水相氧化法制备了具有强荧光的荧光化合物HFO。该纳米开关由四个构件组成：具有强荧光的HFO是荧光报告分子，Cu2+作为介体引起HFO的聚集，焦磷酸根离子(PPi)与Cu2+的竞争相互作用导致原位反应不能发生，PPi是碱性磷酸酶的底物。
具体为：包括如下步骤：在400μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.4)中加入300μM的多巴胺和8-羟基久洛尼定。充分混合后，在室温下混合实时检测荧光强度。将不同浓度的Cu2+水溶液分别加入400μL溶液中。将不同浓度的碱性磷酸酶加入40μL PPi(600μM)的Tris-HCl缓冲液(pH为9.0)中，37℃作用30min。然后将孵化溶液加入到HFO/Cu2+体系中。孵育5min后，记录HFO的实时荧光强度，以此定量检测碱性磷酸酶。
基于一种铜离子诱导多通道荧光酶联免疫传感器检测心肌钙蛋白I型的方法，在96孔板中，捕获抗体与抗原相结合，随后抗原与一抗相连接，一抗又与ALP标记的二抗相连构建一个三明治式夹心免疫，最后加上荧光底物，通过形成荧光纳米粒子的荧光强度的变化来实现对心肌钙蛋白I型的定量检测。
本发明的有益效果：
本发明涉及一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白I型的方法和应用，属于纳米生物传感技术领域。该方法以多巴胺和酚(1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚)为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC波长可调荧光化合物(FCs)。在Cu2+引发下，多巴胺和酚产生不同发射光谱的荧光，从而开启了纳米开关。利用PPi对Cu2+的亲和力实现了纳米开关的关闭。在碱性磷酸酶(ALP)的催化水解下，PPi能迅速转化为磷酸根离子，从而再次改变发射。其次，我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，利用碱性磷酸酶作为标记酶构建了多通道免疫荧光传感平台，因此，所研制的荧光纳米开关可以实现对碱性磷酸酶和心肌肌钙蛋白的定量检测。此外，该纳米开关在人血清中仍表现出快速的响应和良好的回收率。更重要的是，该方法在人体血清样本中具有良好的适用性，在临床诊断和生物医学研究中显示出潜在的应用前景。
本发明为一种基于铜离子诱导荧光增强检测ALP的方法及其应用，通过HFO与铜离子具有相互作用，由于诱导催化氧化效应使HFO荧光增强。通过焦磷酸根和铜离子较高的结合能力，使得HFO/Cu2+体系荧光减弱。在HFO/Cu2+体系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根，有效降低了焦磷酸根对HFO/Cu2+体系中Cu2+的竞争作用。从而，实现绿色快速的定量检测碱性磷酸酶。本发明的方法三为利用碱性磷酸酶在酶联免疫中常作为标记酶的特性，以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，构建了一个ALP引发的荧光免疫试剂盒。苔黑酚水合物磷酸钠盐为酶标记二抗的底物，通过HFO荧光强度的变化来实现对心肌钙蛋白I型的实时定量检测。
大多数荧光免疫传感器面临着制备过程复杂、信号单一、稳定性差，灵敏度低的挑战。而我们提出的用于检测cTnI的多通道、快速响应、实时的、检测限低，特异性好的酶联免疫传感器具有明显的优势。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为实施例1中制得的绿色HFO的吸收光谱图；
图2为实施例1中制得的绿色HFO的荧光激发光谱图；
图3为实施例1中制得的绿色HFO的荧光发射光谱图；
图4为实施例2中制得的HFO的时间扫描图；
图5为实施例3中不同浓度的碱性磷酸酶制得的HFO的时间扫描图；
图6为实施例3中不同浓度的碱性磷酸酶制得的HFO的荧光强度散点图；
图7为实施例3中不同浓度的碱性磷酸酶制得的HFO的标准曲线图；
图8为实施例4中不同酶或蛋白作用制得的HFO的荧光强度变化柱状图；
图9为一种基于碱性磷酸酶触发的检测心肌钙蛋白I型的荧光免疫试剂盒的示意图；
图10为实施5中不同浓度的心肌钙蛋白I型连接的免疫荧光试剂盒的时间扫描图；
图11为实施5中不同浓度的心肌钙蛋白I型的荧光强度散点图；
图12为实施5中不同浓度的心肌钙蛋白I型的标准曲线图；
图13为实施6中免疫荧光试剂盒中心肌钙蛋白I型的选择性的荧光强度变化柱状图；
图14为实施7中蓝色通道不同浓度的心肌钙蛋白I型连接的免疫荧光试剂盒的时间扫描图；
图15为实施7中蓝色通道不同浓度的心肌钙蛋白I型的荧光强度散点图；
图16为实施7中蓝色通道不同浓度的心肌钙蛋白I型的标准曲线图；
图17为实施8中黄色通道不同浓度的心肌钙蛋白I型连接的免疫荧光试剂盒的时间扫描图；
图18为实施8中黄色通道不同浓度的心肌钙蛋白I型的荧光强度散点图；
图19为实施8中黄色通道不同浓度的心肌钙蛋白I型的标准曲线图；
图20为本发明的示意图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1：室温下，取1000μL Tris-HCl缓冲溶液，分别加入300μM多巴胺，300μM 8-羟基久洛尼定和150μM Cu2+，震荡摇匀。反应60s后，在紫外灯照射情况下，观察到绿色荧光，表示HFO制备成功。通过紫外吸收光谱仪对DMTM进行吸收强度检测，绘制吸收光谱图，如图1。通过荧光光谱仪对HFO进行荧光强度检测，绘制荧光激发光谱图和荧光发射光谱图，如图2和图3。
实施例2：室温下，取1000μL Tris-HCl缓冲溶液，分别加入300μM多巴胺，300μM 8-羟基久洛尼定和150μM Cu2+，震荡摇匀，通过荧光光谱仪对DMTM进行时间扫描，激发波长为460nm，发射波长为520nm，绘制时间扫描图，如图4。表明生成的物质荧光强度体系非常稳定。
实施例3：将300μM多巴胺，300μM 8-羟基久洛尼定和150μM Cu2+，震荡摇匀。在上述体系中，加入5μL用不同浓度碱性磷酸酶(0-1250mU/mL)孵育的焦磷酸根(600μM)，振荡反应。通过荧光光谱仪对HFO进行荧光强度检测，激发波长为460nm，发射波长为520nm。绘制实时荧光扫描图、荧光相对强度散点图和标准曲线图，如图5、图6和图7。可以清楚地观察到荧光强度随着ALP活性的增加而逐渐增强，这种荧光检测非常灵敏，在当前的实验条件下可以轻松检测到0.5mU/mL的ALP。
实施例4：将300μM多巴胺，300μM 8-羟基久洛尼定和150μM Cu2+，震荡摇匀。在上述体系中，分别加入5μL用牛血清白蛋白、谷胱甘肽、胰蛋白酶、溶菌酶和碱性磷酸酶等孵育的焦磷酸根振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度柱状图，如图8。通过与其他常见的生物分子进行比较，这些对照样品中没有一个能引起显着的荧光反应。这些结果表明我们的检测系统对ALP表现出优异的选择性。
实施例5：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入Tris-HCl缓冲液，PPi37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后加入150μM Cu2+，结束后在孔板中加入300μM多巴胺，300μM8-羟基久洛尼定震荡摇匀。混合均匀后进行荧光强度分析并绘制免疫荧光试剂盒的实时荧光扫描图、荧光相对强度散点图和标准曲线，如图10，图11和图12。该测定在0至100ng/mL范围内显示出荧光响应与cTnI之间的良好线性，检测限小于0.1ng/mL。
实施例6：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后往各孔中分别加入200ng/mL的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入Tris-HCl缓冲液，PPi 37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后加入150μM Cu2+，结束后在孔板中加入300μM多巴胺，300μM 8-羟基久洛尼定震荡摇匀。混合均匀后进行荧光分析并绘制免疫荧光试剂盒的柱状图，如图13。其他检测的蛋白质引起的荧光信号变化可忽略不计，证明我们的荧光免疫测定系统对检测目标cTnI具有足够的选择性。
实施例7：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入Tris-HCl缓冲液，PPi37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后加入150μM Cu2+，结束后在孔板中加入300μM多巴胺，300μM 1,3-萘二酚震荡摇匀。混合均匀后进行荧光强度分析并绘制免疫荧光试剂盒的实时荧光扫描图、荧光相对强度散点图和标准曲线，如图14，图15和图16。该测定在0至100ng/mL范围内显示出荧光响应与cTnI之间的良好线性，检测限小于0.5ng/mL。
实施例8：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗5次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入Tris-HCl缓冲液，PPi37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后加入150μM Cu2+，结束后在孔板中加入300μM多巴胺，300μM1,5-萘二酚震荡摇匀。混合均匀后进行荧光强度分析并绘制免疫荧光试剂盒的实时荧光扫描图、荧光相对强度散点图和标准曲线，如图17，图18和图19。该测定在0至150ng/mL范围内显示出荧光响应与cTnI之间的良好线性，检测限小于0.5ng/mL。
实施例9：事先将各病人血清样本用标准试剂盒计算出含有的心肌钙蛋白I型的浓度，然后按照免疫的常规操作，在用牛血清蛋白封闭结束后再加入100L的含有不同浓度的心肌钙蛋白I型的病人血清，之后37℃孵育1h，用TBST去除未结合的病人血清样本后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，然后加入Tris-HCl缓冲液,PPi 37℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，使用TBST冲洗随后，结束后在孔板中加入150mM多巴胺和150μM高锰酸钾。混合均匀后进行荧光强度测试并计算心肌钙蛋白I型的回收率，并与商业标准试剂盒进行对比，结果与临床诊断和基于TMB的标准ELISA方法的结果一致。因此，所提出的平台在急性心肌梗死的早期诊断中具有巨大的潜力，表明该方法可应用在实际病人样本中。如表1。
表1
多通道检测心肌钙蛋白的优点：
心肌钙蛋白的波长可调和实时检测是通过使用铜离子触发的快速荧光反应从490nm到550nm的可调荧光发射来实现的。其次，根据不同的苯酚衍生物(1,3-Naphthalenediol，8-Hydroxyjulolidine，1,5-Naphthalenediol)，荧光波长可在490-550nm范围内可调，利用三重通道对心肌钙蛋白进行检测，更加系统准确。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：铜离子催化多巴胺和酚(1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚)发生原位荧光反应，生成的蓝/绿/黄光发射的荧光化合物有助于构建多通道荧光酶联免疫传感平台，而焦磷酸根和铜离子具有较高亲和力使得波长可调荧光化合物(FCs)/Cu2+体系的荧光降低，向FCs/Cu2+体系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根离子，根据荧光强度的变化来检测碱性磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：FCs合成条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.4，多巴胺和1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚的浓度为300μM，铜离子和焦磷酸PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-1250mU/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5小时；取孵化后溶液加入FCs/Cu2+体系，充分振荡；焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对体系的淬灭作用，根据体系荧光强度的变化检测碱性磷酸酶活性。
3.根据权利要求1或2所述的铜离子引发的原位荧光反应实时检测碱性磷酸酶方法制备的试剂盒。
4.一种利用权1所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列捕获抗体被注入到孔板中4℃孵化过夜；接着加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后加入不同浓度的cTnI溶液，取山羊抗/Ab2移入孔板中，加入反应体系，从而构成三明治式夹心免疫，最后在孔板中加入FCs/Cu2+，通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于心肌钙蛋白I型检测。
5.根据权利要求4所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗数次，然后加入Tris-HCl缓冲液，ALP标记的驴羊二抗和焦磷酸钠盐37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入对FCs/Cu2 +；通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度监测并用于检测心肌钙蛋白I型。
6.根据权利要求5所述的基于铜离子引发的原位荧光反应构建的酶联免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：该传感平台条件为：Tris-HCl缓冲溶液的pH为9.0，Tris-HCl的浓度为10mM，多巴胺和1,3-萘二酚、8-羟基久洛尼定、1,5-萘二酚的浓度为300μM，铜离子和PPi浓度分别为150μM和600μM，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-1250mU/mL，ALP标记的驴羊二抗与焦磷酸钠盐的孵化温度为37℃，孵化时长为0.5h，牛血清蛋白的浓度为20mg/mL，捕获抗体的浓度为1μg/mL，一抗浓度为2μg/mL,ALP标记的二抗浓度为2μg/mL，通过荧光光谱仪对合成的FCs进行实时荧光强度检测，以此定量实时检测心肌钙蛋白I型。
7.根据权利要求6所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的应用，其特征在于：在用牛血清蛋白封闭结束后，加入含有不同浓度心肌钙蛋白I型37℃孵化1小时；结束后再按照上述步骤，最后再加反应底物，混合均匀后立即在荧光光谱仪中测试；先用心肌钙蛋白标准试剂盒测试出不同血清样本中心肌钙蛋白I型的含量，之后再根据前面测试标准曲线对样品进行稀释使其浓度在曲线范围内，稀释倍数为10倍，之后将其加入96孔板中37℃孵化1小时，再按照上述步骤进行试验；根据形成的FCs的荧光强度，用于病人血清样本中心肌钙蛋白I型的检测。
8.根据权利要求5-7任一所述的基于室温形成荧光有机物来构建免疫传感器来检测心肌钙蛋白I型的方法的制备的于定量检测心肌钙蛋白的商业试剂盒。
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| CN113702630B (zh) | 2023-10-03 |
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