CN106442993A - 基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法 - Google Patents

基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106442993A
CN106442993A CN201610815155.XA CN201610815155A CN106442993A CN 106442993 A CN106442993 A CN 106442993A CN 201610815155 A CN201610815155 A CN 201610815155A CN 106442993 A CN106442993 A CN 106442993A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
trypsase
buffer solution
fluorogenic substrate
trypsin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610815155.XA
Other languages
English (en)
Inventor
常津
武玉东
宫晓群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN201610815155.XA priority Critical patent/CN106442993A/zh
Publication of CN106442993A publication Critical patent/CN106442993A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法；我们将结合酶联免疫检测和荧光检测两种技术，利用胰蛋白酶和肿瘤标志物相应抗体Ab2制得检测探针。探针、肿瘤标志物和包埋在酶联免疫ELISA试剂盒的另一种肿瘤标志物抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，最后通过酶和荧光底物的作用产生荧光，对CA125这种卵巢癌相关肿瘤标志物进行定性定量的检测，建立蛋白标志物检测的新方法。本发明的特点在于：整个制备过程简单，适合于产业化生产；根据荧光底物的荧光特性，以及与酶的作用，可定性定量检测蛋白标志物，且特异性良好；整个检测过程，成本低廉且操作非常简便，建立了一种蛋白标志物检测的新方法。

Description

基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联 免疫试剂盒制备方法
技术领域
本发明涉及疾病检测技术领域，更具体的是涉及一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法。
背景技术
近年来，随着人们的生活方式发生了急剧变化，精神压力也不断增大，我国肿瘤的发病率逐年攀升。其中，卵巢癌死亡率在妇科肿瘤中居首位，与乳腺癌不同，卵巢癌早期缺乏明显症状和有效筛查，生存率低。卵巢癌的肿瘤标志物根据其组织病理类型可分为多种亚型，其中上皮来源性肿瘤是最为常见的类型，现有肿瘤标志物大多也与卵巢上皮性癌密切相关，如CA125和人类附睾蛋白4(HE4)等。健康人群血清CA125含量很低，健康成人血清CA125浓度上限为35kU/L。CA125是重要的卵巢癌相关抗原，联合经阴道盆腔超声或其他标志物可以提高早期筛查特异性；CA125可用于鉴别良恶性卵巢包块，绝经后女CA125>95kU/L，阳性预测值达95％；此外，CA125是观察疗效、判断有无复发的良好指标。世界卫生组织已经作出最新的权威性的结论，恶性肿瘤患者如果能在发病早期发现，治愈率可以达到80％以上，所以肿瘤的早期诊断与治疗已经成为近年来研究的热点。
由于酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110是一种双酰胺衍生物的罗丹明110(R110)分子探针，是一个敏感的和有选择性的测定蛋白酶在溶液中或在活细胞内底物。这些荧光底物含有一种氨基酸或肽共价连接到每个R110的氨基，酶裂解后，非荧光双酰胺底物转化首先对荧光单酰胺然后R110，在荧光的进一步增加。使用荧光酶标仪基板可用于连续测量细胞提 取物中的酶活性和纯化的酶制剂，或用于细胞内蛋白酶的检测与分析，流式细胞仪和荧光显微镜等。目前荧光检测因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面，而ELISA则因为它的灵敏度高、特异性强等优点在检测领域处于特殊重要的地位。所以本文拟研制基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒，对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行检测，灵敏度提升了将近10000倍。
发明内容
鉴于蛋白标志物在肿瘤检测中的重要地位、荧光检测独特的光学性质以及酶联免疫检测技术的优势。我们将结合酶联免疫检测和荧光检测两种技术，利用胰蛋白酶和肿瘤标志物相应抗体Ab2制得检测探针。探针、肿瘤标志物和包埋在酶联免疫ELISA试剂盒的另一种肿瘤标志物抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，最后通过酶和荧光底物的作用产生荧光，对CA125这种卵巢癌相关肿瘤标志物进行定性定量的检测，建立蛋白标志物检测的新方法，极大程度提高了检测灵敏度。
本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒，其特征是选用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行定量检测，其结构式如下：
本发明的技术方案如下：
一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法；其步骤如下：
1)将新配制的高碘酸钠NalO4溶液加入到胰蛋白酶Trypsin溶液中，室温下避光搅拌后，用醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0～9.3，立即加入CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌后加入少量硼氢化钠NaBH4充分反应后用PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准CA125抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针Trypsin-Ab2， 用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
所述醋酸盐缓冲液是0.01M pH4.4的缓冲液；碳酸盐缓冲液是0.2M pH9.5的缓冲液；PBS缓冲液是0.15M pH7.4的缓冲液。
所述胰蛋白酶：高碘酸钠质量比为1:0.8～1.2；胰蛋白酶：CA125标记抗体质量比为1:1～5；胰蛋白酶：硼氢化钠质量比为15:1。
所述CA125包被抗体Ab1浓度为10～50μg/mL。
所述洗涤缓冲液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。
所述检测原理是根据胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110降解产生的荧光强度值和CA125标准抗原浓度之间的关系，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125。
通过高碘酸钠NalO4作用将CA125记抗体Ab2和胰蛋白酶Trypsin连接，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2。将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，4℃过夜后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入BSA 37℃封闭处理后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，在96孔酶标板加入待检样品37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入上述Trypsin-Ab2检测探针37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，最后用荧光酶标仪读数。如果检测样品有CA125抗原Ag存在，探针Trypsin-Ab2、CA125抗原Ag和包埋在96孔酶标板上的CA125包被抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构Trypsin-Ab2-Ag-Ab1，此时胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110在酶的作用下降解产生荧光；如果检测样品没有CA125抗原Ag存在，则96孔酶标板的检测探针Trypsin-Ab2将被洗涤缓冲液清洗，此时胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110不会降解，没有荧光出现。在96孔酶标板上加入不同浓度的标准CA125抗原，建立标准曲线，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125。
本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒优势在于：
1.采用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110这种具有优异的光学性质的双酰胺衍生物的罗丹明110(R110)分子探针，通过酶的放大作用，将极大的提高检测灵敏度，降低检测非特异性吸附。
2.采用酶联免疫检测ELISA这种具有灵敏度高、特异性强等优点的传统检测技术，有利于调高检测效率。
3.采用高碘酸钠NalO4作用将CA125记抗体Ab2和胰蛋白酶Trypsin连接得到酶联检测探针Trypsin-Ab2，夹心结构降解荧光底物产生的荧光强度，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125，有效地降低了检测荧光背景。
如图1所示，胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110酶裂解后，非荧光双酰胺底物率先转化为一对弱荧光的单酰胺，然后转化为强荧光的R110，荧光进一步增加，实现超灵敏检测。如图2所示，根据荧光酶标仪可知加入不同浓度标准CA125抗原所得荧光强度分别是194335、284399、302187、316222、349462、374451、421623；图3紫外照片也可以看出随着CA125抗原浓度的增加酶标板孔荧光强度依次增加。
附图说明
图1本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒底物降解图。
图2本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒荧光值曲线。
图3本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒紫外激发照片。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施案例1：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(21.39mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15MPH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
实施案例2：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
实施案例3：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(30mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
实施案例4：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.2，立即加入5mg CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(10μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
实施案例5：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.3，立即加入25mg CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(50μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(50mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
实施案例6：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后每孔加入100μL CA125标准抗原的浓度分别为100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0U/mL，缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤 缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。建立标准曲线。
如图2所示，根据荧光酶标仪可知加入不同浓度标准甲胎蛋白抗原所得荧光强度分别是194335、284399、302187、316222、349462、374451、421623 。

Claims (7)

1.一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征是选用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行定量检测，其结构式如下：
。
2.权利要求1的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征在于步骤如下：
1)将高碘酸钠NalO4溶液加入到胰蛋白酶Trypsin溶液中，室温下避光搅拌后，用醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0～9.3，立即加入CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌后加入硼氢化钠NaBH4充分反应后用PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准CA125抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针Trypsin-Ab1，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是醋酸盐缓冲液是0.01M pH4.4的缓冲液；碳酸盐缓冲液是0.2M pH9.5的缓冲液；PBS缓冲液是0.15M pH7.4的缓冲液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是胰蛋白酶：高碘酸钠质量比为1:0.8～1.2；胰蛋白酶：CA125标记抗体质量比为1:1～5；胰蛋白酶：硼氢化钠质量比为15:1。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是CA125包被抗体Ab1浓度为10～50μg/mL。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是洗涤缓冲液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。
7.如权利要求2所述的方法，其特征是根据胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110降解产生的荧光强度值和CA125标准抗原浓度之间的关系，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125。
CN201610815155.XA 2016-09-10 2016-09-10 基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法 Pending CN106442993A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610815155.XA CN106442993A (zh) 2016-09-10 2016-09-10 基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610815155.XA CN106442993A (zh) 2016-09-10 2016-09-10 基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106442993A true CN106442993A (zh) 2017-02-22

Family

ID=58168515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610815155.XA Pending CN106442993A (zh) 2016-09-10 2016-09-10 基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106442993A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111537728A (zh) * 2020-07-09 2020-08-14 广州瑞博奥生物科技有限公司 卵巢癌标志物ca125的定量检测试剂盒
CN111855625A (zh) * 2019-12-02 2020-10-30 南京市妇幼保健院 一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒及其应用
CN113655036A (zh) * 2021-08-04 2021-11-16 辽宁大学 一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法
CN114381529A (zh) * 2022-03-16 2022-04-22 上海晟燃生物科技有限公司 Actr10与ca125联合在卵巢癌检测中的应用和试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1207130A (zh) * 1996-10-04 1999-02-03 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 来自米曲霉的羧肽酶和编码该酶的核酸

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1207130A (zh) * 1996-10-04 1999-02-03 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 来自米曲霉的羧肽酶和编码该酶的核酸

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AIME G. MAYORAL 等: "An Improved End-Point Fluorimetric Procedure for the Determination of Low Amounts of Trypsin Activity in Biological Samples Using Rhodamine-110-Based Substrates", 《APPL BIOCHEM BIOTECHNOL》 *
ROBERT H.YOLKEN AND PETER J.STOPA: "Enzyme-Linked Fluorescence Assay: Ultrasensitive Solid-Phase Assay for Detection of Human Rotavirus", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *
WALTER HALANGK 等: "rypsin activity is not involved in premature,intrapancreatic trypsinogen activation", 《AM J PHYSIOL GASTROINTEST LIVER PHYSIOL》 *
于善谦 和 张若平: "荧光底物在酶联免疫吸附试验中的应用", 《病毒学杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111855625A (zh) * 2019-12-02 2020-10-30 南京市妇幼保健院 一种基于Cu-MOF的CA125检测试剂盒及其应用
CN111537728A (zh) * 2020-07-09 2020-08-14 广州瑞博奥生物科技有限公司 卵巢癌标志物ca125的定量检测试剂盒
CN113655036A (zh) * 2021-08-04 2021-11-16 辽宁大学 一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法
CN113655036B (zh) * 2021-08-04 2023-09-15 辽宁大学 一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法
CN114381529A (zh) * 2022-03-16 2022-04-22 上海晟燃生物科技有限公司 Actr10与ca125联合在卵巢癌检测中的应用和试剂盒
CN114381529B (zh) * 2022-03-16 2022-06-10 上海晟燃生物科技有限公司 Actr10与ca125联合在卵巢癌检测中的应用和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jiao et al. 3D vertical-flow paper-based device for simultaneous detection of multiple cancer biomarkers by fluorescent immunoassay
Liu et al. A portable chemiluminescence imaging immunoassay for simultaneous detection of different isoforms of prostate specific antigen in serum
Cho et al. Chemiluminometric enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)-on-a-chip biosensor based on cross-flow chromatography
WO2017107974A1 (zh) 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用
CN103033619B (zh) 一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法
CN106442993A (zh) 基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物ca125的酶联免疫试剂盒制备方法
CN101358976A (zh) 检测六项肿瘤标志物的微阵列-酶联免疫检测试剂盒
CN112679605B (zh) 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用
CN104422772A (zh) 一种定量检测胃蛋白酶原i的时间分辨免疫层析试纸条及其制备方法
CN109211868A (zh) 一种快速定量检测myo的微流控荧光免疫芯片
CN108169497A (zh) 人泌乳素检测试剂盒及其制备方法与应用
CN102081100B (zh) 一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用
TW201812299A (zh) 腫瘤標記物之測定方法及測定試藥
KR20140011760A (ko) 유방암 암 마커 측정을 위한 항체―렉틴 샌드위치 측정 방법
CN101377496A (zh) 一种检测甲状腺过氧化物酶自身抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒
CN105492907B (zh) 新检测方法
JP4197393B2 (ja) ＩｇＡ腎症の検査法
CN113150133B (zh) 针对SARS-CoV-2的单克隆抗体或其抗原结合片段
CN104849443B (zh) 基于pH计的酶联免疫吸附测定方法
CN106645745A (zh) 一种快速定量检测微量白蛋白的均相荧光免疫试剂及制备与检测方法
CN101545911A (zh) 细胞角蛋白18化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法
ES2718736T3 (es) Composición para el inmunoensayo enzimático por inmunofluorescencia y sus usos
CN106405111A (zh) 基于弹性蛋白酶荧光底物检测乳腺癌肿瘤标志物ca153的酶联免疫试剂盒制备方法
JP2010091308A (ja) レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット
CN110687293A (zh) 一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170222