CN113655036B - 一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析方法技术领域，具体涉及一种判断氨基酸是否影响卡博替尼(CBZ)合理用药的方法，主要包括以下内容：步骤一：Tris‑HCl‑NaCl缓冲溶液配制；步骤二：牛血清蛋白(BSA)溶液配制、CBZ溶液配制；步骤三：谷氨酸(Glu)溶液、赖氨酸(Lys)溶液、蛋氨酸(Met)溶液配制；步骤四：借助荧光光谱法考察三种氨基酸对CBZ与BSA间相互作用的影响，判断氨基酸是否影响CBZ合理用药。该方法操作简单，采用的是荧光光谱法，实验条件易于实现。荧光分析的最大特点是：分析灵敏度高、选择性强和使用简便。符合三种氨基酸对CBZ与BSA相互作用是否有影响的研究特点，为该实验结果的准确性提供了技术上的支持和保障。

Description

一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法
技术领域
本发明涉及分析方法技术领域，提出了一种如何判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，具体方法为荧光光谱法。
背景技术
卡博替尼(CBZ)作为现阶段治疗适应症最广的靶向药物，面对肺癌，肝癌，黑色素瘤等多种癌症都有非常不错的治疗效果。CBZ是一种络氨酸酶受体的拮抗剂，通过抑制络氨酸酶活性而发挥抗肿瘤作用，杀死肿瘤细胞，减少转移并抑制肿瘤血管生成。BSA的应用非常广泛，在生化实验中，常将BSA用于靶标蛋白，具有稳定的光谱性能。衡量一个药物在临床应用上的治疗效果，不但要看这个药物是否能够靶向针对治疗部位，还要考虑这个药物在转运到靶点的过程中的保护情况，最后被人体新陈代谢的利用率如何，这都与药物和血浆蛋白质的相互作用有着不可分离的重要关系。
癌症患者身体都比较虚弱，因此经常需要补充氨基酸来强化提高身体免疫力。不同物质的存在会影响药物活性的发挥，因此研究氨基酸对于CBZ合理用药是否有影响具有重要意义，有助于临床用药的研究。
发明内容
为考察氨基酸对卡博替尼合理用药是否有影响，采取荧光光谱法进行研究。所述方法包括溶液的配制以及荧光光谱法的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，包括如下步骤：
步骤一：Tris-HCl-NaCl缓冲溶液配制；
步骤二：牛血清蛋白(BSA)溶液配制，CBZ溶液配制；
步骤三：谷氨酸(Glu)溶液配制、赖氨酸(Lys)溶液配制、蛋氨酸(Met)溶液配制；
步骤四：通过荧光光谱法判断三种氨基酸是否影响CBZ合理用药。
优选地，上述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，所述的Tris-HCl-NaCl缓冲溶液的浓度为0.05mol L-1，pH为7.40。
优选地，上述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，所述的BSA溶液的浓度为1.0×10-5mol L-1；所述的CBZ溶液的浓度为1.0×10-3molL-1。
优选地，上述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，所述的Glu溶液的浓度为1×10-2mol L-1，所述的Lys溶液的浓度为1×10-2mol L-1，所述的Met溶液的浓度为1×10-2mol L-1。
优选地，上述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，步骤四具体为：
(1)用5mL刻度吸管移取0.1×10-5molL-1BSA溶液2.5mL，转移到1cm比色皿中，用微量注射器吸取1×10-2mol L-1Glu或Lys或Met储备液5μL，分别转移到上述比色皿中。然后再用微量注射器逐次向比色皿中注入浓度1×10-3mol L-1CBZ储备液5μL，使CBZ浓度在0.0×10-5mol L-1至1.2×10-5mol L-1范围，间隔浓度0.2×10-5mol L-1,每个溶液混匀静置5min后，以激发波长为278nm，荧光发射与激发狭缝宽度都为5nm，温度为293K下以速度1200nmmin-1扫描从200到600nm的荧光发射光谱；同时在293K条件下以1200nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm和Δλ＝60nm，做光谱扫描；
(2)同时在293K条件下以1200nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm和Δλ＝60nm，做光谱扫描；
(3)同时在293K条件下以1200nm min-1速度扫描，激发波长从200到360nm,发射波长从250到500nm，做光谱扫描。
优选地，上述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，步骤(1)中，所述的激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm，其中激发波长从200到400nm，发射波长215nm；所述的激发波长与发射波长的差值Δλ＝60nm，激发波长从200到400nm，发射波长260nm。
优选地，上述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，步骤(2)中，所述的激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm，其中激发波长从200到400nm，发射波长215nm；所述的激发波长与发射波长的差值Δλ＝60nm，激发波长从200到400nm，发射波长260nm。
本发明的有益效果是：
氨基酸在能量代谢过程中以及调节机体物质代谢过程中扮演着非常重要的角色，它能够维持机体正常新陈代谢和生理机能，它对维持身体健康有着重要的作用。CBZ作为现阶段治疗适应症最广的靶向药物，面对肺癌，肝癌，黑色素瘤等多种癌症都有非常不错的治疗效果，但同时会伴随着不良反应的出现。CBZ最常见的药物不良反应有体重减轻、食欲不振、恶心，疲乏等，甚至会出现出血、胃肠穿孔，高血压和血栓性事件等严重不良反应。癌症患者身体都比较虚弱，因此经常需要补充氨基酸来强化提高身体免疫力。不同物质的存在会影响药物活性的发挥，因此研究氨基酸是否影响CBZ合理用药具有重要意义，有助于临床合理用药。
荧光分析的最大特点是：分析灵敏度高、选择性强和使用简便，因此，使用荧光光谱技术手段为研究氨基酸是否影响CBZ合理用药的准确性提供了保障和支持。
附图说明
图1为三种氨基酸分别存在时体系随CBZ浓度变化的荧光光谱；其中(a)是Glu存在时体系随CBZ浓度变化的荧光光谱、(b)是Lys存在时体系随CBZ浓度变化的荧光光谱、(c)是Met存在时体系随CBZ浓度变化的荧光光谱
图2为Glu存在时BSA的同步荧光光谱随CBZ浓度的变化；其中(a)是BSA中Tyr残基的同步荧光谱图(Δλ＝15nm)、(b)是BSA中Trp残基的同步荧光谱图(Δλ＝60nm)
图3为Lys存在时BSA的同步荧光光谱随CBZ浓度的变化；其中(a)是BSA中Tyr残基的同步荧光谱图(Δλ＝15nm)、(b)是BSA中Trp残基的同步荧光谱图(Δλ＝60nm)
图4为Met存在时BSA的同步荧光光谱随CBZ浓度的变化；其中(a)是BSA中Tyr残基的同步荧光谱图(Δλ＝15nm)、(b)是BSA中Trp残基的同步荧光谱图(Δλ＝60nm)
图5为三种氨基酸分别存在时CBZ-BSA的三维荧光光谱图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
溶液配制，包括以下步骤：
步骤一：Tris-HCl-NaCl(0.05mol L-1，pH＝7.40)缓冲溶液配制：Tris储备液：用分析天平准确称取24.23g Tris，用超纯水溶解后，定容于1000mL容量瓶。HCl溶液：用10mL量取12mol L-1浓盐酸8.33mL，再用超纯水定容于1000mL容量瓶。Tris-HCl-NaCl缓冲溶液：用量筒量取Tris储备液250mL、HCl溶液400mL，再加入2.925g的NaCl，用蒸馏水定容于1000mL容量瓶。
步骤二：BSA溶液(1.0×10-5mol L-1)配制：用25mL烧杯准确称取BSA 0.067g，用Tris-HCl-NaCl溶液解后，定容于100mL容量瓶。BSA溶液(0.1×10-5mol L-1)配制：准确移取BSA溶液(1.0×10-5mol L-1)10mL,用Tris-HCl-NaCl溶液溶解后，定容于100mL容量瓶。CBZ溶液(1.0×10-3mol L-1)配制：准确称取CBZ0.013g于25mL烧杯，用少量乙醇溶解，然后用NaCl-Tris-HCl溶液定容于25mL容量瓶。
步骤三：Glu溶液(1×10-2mol L-1)配制：准确称量Glu 0.147g于25ml烧杯中，用少量超纯水溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于100ml容量瓶。Lys溶液(1×10-2molL-1)配制：准确称量Lys 0.146g于25ml烧杯中，用少量超纯水溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于100ml容量瓶。Met溶液(1×10-2mol L-1)配制：准确称量Met 0.149g于25mL烧杯中，用少量超纯水溶解，然后用NaCl-Tris-HCl缓冲溶液定容于100mL容量瓶。
荧光光谱的测定，包括以下步骤：
步骤一：用5mL刻度吸管移取0.1×10-5mol L-1BSA溶液2.5mL，转移到1cm比色皿中，然后用微量注射器吸取1×10-2mol L-1Glu(或Lys、Met)储备液5μL，转移到上述比色皿中，然后再用微量注射器逐次向比色皿中注入浓度1×10-3mol L-1CBZ储备液5μL，使CBZ浓度在从0.0×10-5mol L-1到1.2×10-5mol L-1范围，间隔浓度0.2×10-5molL-1,每个溶液混匀静置5min后，激发波长278nm，荧光发射与激发狭缝宽度都为5nm，293K下以速度1200nmmin-1扫描从200到600nm的荧光发射光谱。
由图1可见固定浓度的Glu、Lys、Met分别加入，随着CBZ浓度增加，三元体系的荧光强度逐步降低，说明Glu、Lys、Met的存在情况下，CBZ与BSA存在相互作用。使之产生荧光猝灭。
步骤二：同时在293K条件下以1200nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ＝15nm(激发波长从200到400nm，发射波长215nm)和Δλ＝60nm(激发波长从200到400nm，发射波长260nm)，做光谱扫描。
如图2可以看出，Glu存在的情况下，CBZ对BSA的Tyr残基和Trp残基的荧光强度呈现极其显著的猝灭，Trp残基的最大发射峰位置波长变长(281nm-283nm)，即发生了红移，Glu的存在未改变CBZ与BSA的作用位置，依旧是作用在Trp残基上，Glu的存在未改变CBZ与BSA的作用位置，可以认为在Glu存在时，CBZ依旧是作用在BSA的Trp残基上。
如图3可以看出，Lys存在的情况下，CBZ对BSA的Tyr残基和Trp残基的荧光强度呈现极其显著的猝灭，Trp残基的最大发射峰位置发生略微红移，Lys存在未改变CBZ与BSA的作用位置，依旧是作用在Trp残基上，Lys的存在未改变CBZ与BSA的作用位置，可以认为在Lys存在时，CBZ依旧是作用在BSA的Trp残基上。
如图4可以看出，Met使CBZ对BSA的Tyr、Trp残基的荧光有显著的猝灭作用，Tyr残基最大发射峰位置未出现变化，Trp残基最大发射峰位置发生了微量红移，说明Met的存在未改变CBZ与BSA的作用位置，依旧是作用在Trp残基上。
步骤三：同时在293K条件下以1200nm min-1速度扫描，激发波长从200到360nm，发射波长从250到500nm，做光谱扫描。
图5为Glu-CBZ-BSA、Lys-CBZ-BSA、Met-CBZ-BSA的三维荧光光谱图(A、B、C)和三维荧光等高线图(A'、B'、C')。从图中可见，两个像“山脊”的峰，分别是瑞利散射峰Peak3、Peak4，峰强度较大的Peak 1、Peak 2是BSA的指纹峰，位置分别位于228nm/346nm(λex/λem)、278nm/346nm(λex/λem)，Peak 1主要反映蛋白质二级结构(多肽骨架结构特征)的变化情况[70]，Peak 2主要反映Trp、Tyr残基的光谱情况。
Glu、Lys、Met的添加均未改变CBZ对BSA的猝灭机理。但是固定浓度的Glu、Lys、Met分别加入，随着CBZ浓度增加，三元体系的荧光强度逐步降低，说明Glu、Lys、Met的存在情况下，CBZ与BSA存在相互作用。使之产生荧光猝灭。三种氨基酸的介入导致CBZ-BSA的猝灭常数变化不大，这表明无论此三种氨基酸是否存在，三种氨基酸与CBZ-BSA的荧光猝灭均不属于动态猝灭，且氨基酸的介入导致猝灭作用略有减小。说明Glu、Lys、Met与BSA结合较弱，对CBZ与BSA的结合影响较小。Glu、Lys、Met的存在减小了CBZ-BSA体系结合的稳定性，但影响较小。因此，在服用CBZ药物期间，可以服用Glu、Lys、Met。

Claims (6)

1.一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：Tris-HCl-NaCl缓冲溶液配制；
步骤二：BSA溶液配制，CBZ溶液配制；
步骤三：Glu溶液配制、Lys溶液配制、Met溶液配制；
步骤四：采用荧光光谱法分别考察三种氨基酸对CBZ与BSA间相互作用的影响，进而判断氨基酸是否影响CBZ合理用药；
步骤四具体为：
（1）用5 mL刻度吸管移取0.1×10-5 mol L-1 BSA溶液2.5 mL，转移到1 cm比色皿中，用微量注射器吸取1×10-2 mol L-1 Glu或Lys或Met储备液5 μL，分别转移到上述比色皿中；然后，用微量注射器逐次向比色皿中注入浓度 1×10-3 mol L-1 CBZ储备液5 μL，使CBZ浓度在0.0×10-5 mol L-1到1.2×10-5 mol L-1范围，间隔浓度0.2×10-5mol L-1,每个溶液混匀静置5 min后，以激发波长为278 nm，荧光发射与激发狭缝宽度都为5 nm，温度为293 K下以速度1200 nm min-1扫描从200到600 nm的荧光发射光谱；同时在293 K条件下以1200 nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，做光谱扫描；
（2）同时在293 K条件下以1200 nm min-1速度扫描，设置激发波长与发射波长的差值Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，做光谱扫描；
（3）同时在293 K条件下以1200 nm min-1速度扫描，激发波长从200到360 nm，发射波长从250到500 nm，做光谱扫描。
2. 根据权利要求1所述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，其特征在于，步骤一中，所述的Tris-HCl-NaCl缓冲溶液的浓度为0.05 mol L-1，pH为7.40。
3. 根据权利要求2所述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，其特征在于，步骤二中，所述的BSA溶液的浓度为1.0×10-5 mol L-1；所述的CBZ溶液的浓度为1.0×10-3 mol L-1。
4. 根据权利要求3所述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，其特征在于，步骤三中，所述的Glu溶液的浓度为1×10-2 mol L-1，所述的Lys溶液的浓度为1×10-2 mol L-1，所述的Met溶液的浓度为1×10-2 mol L-1。
5. 根据权利要求1所述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的激发波长与发射波长的差值Δλ=15 nm，其中激发波长从200到400nm，发射波长215 nm；所述的激发波长与发射波长的差值Δλ=60 nm，激发波长从200到400nm，发射波长260 nm。
6. 根据权利要求5所述的一种判断氨基酸是否影响卡博替尼合理用药的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的激发波长与发射波长的差值Δλ=15 nm，其中激发波长从200到400nm，发射波长215 nm；所述的激发波长与发射波长的差值Δλ=60 nm，激发波长从200到400nm，发射波长260 nm。
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